JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Abstract

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.

To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.

Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

Introduction

הנדסת רקמות לב התקדמה מאוד בעשור האחרון, עם מספר קבוצות פרסום תוצאות של רקמות מתפקדות במלואה, מכים עשו משני cardiomyocytes murine 1-6, ולאחרונה, גזע האנושי תא נגזרות myocytes לב 7-12. בתחום ההנדסה ברקמת הלב הוא מונע על ידי שתי מטרות עיקריות ובעצם עצמאי: 1) לפתח שתלי אקסוגניים כי ניתן להשתיל לתוך אי לבבות לשיפור תפקוד 4-6; ו -2) לפתח מודלים חוץ גופייה לחקר פיזיולוגיה ומחלות, או ככלי הקרנה לפיתוחים רפואיים 2,7.

תלת ממדי (3-D) תרבית תאי נחשב חיונית לפיתוח כלי איתור הדור הבא, כמו מטריקס 3-D משקף microenvironment לב טבעי יותר מאשר תרבית תאים בשכבה 2-D מסורתית; אכן כמה היבטים של ביולוגיה של תא שונים באופן מהותי בתרבויות 2-D לעומת 3-D 13,14 . בנוסף, רקמות לב מהונדסות בנויות ממרכיבים מוגדרים לחלוטין: מטריצה ​​תאית, ואוכלוסיית תא. עבור רקמות לב אנושיות מסורתיות מהונדסות, בעוד רכב תאי מטריקס (בדרך כלל הפיברין 9 או קולגן 7,8,10) נשלט לחלוטין, רכב תא קלט מוגדר פחות טוב, עם התערובת כולה של תאים מתוך בידול לב מכוון של כל אחד תאי גזע עובריים (ESC 7,9) או תאי גזע מושרים (iPSC 10,12) להתווסף הרקמות. בהתאם לקו תאים ספציפיים ואת היעילות של פרוטוקול בידול בשימוש, אחוז cardiomyocytes וכתוצאה מכך יכול לנוע בין פחות מ -25% ליותר מ -90%, את הפנוטיפ cardiomyocyte מסוים (כלומר, ventricular-, atrial-, או קוצב דמוי) יכול גם להשתנות, אפילו שבריר הלא cardiomyocyte יכול להיות מאוד הטרוגנית 15,16 ולשנות את מידת הבשלות של מ 'לב הבדילyocytes 17.

עבודות הנדסיות ברקמת לב אחרונות ניסו לנהל את אוכלוסיית תאי הקלט, עם או משטח תא קו 8 או תאי גזע עוברי אנושי כתב לב סמני 18 בשימוש כדי לבודד את מרכיב myocyte לב של הבידול. בעוד שבתחילה רקמה מורכבת myocytes לב רק היה נראה האידיאל, זה למעשה לא המקרה; hECTs מורכבת רק מיוציטים מלב מצליחה לדחוס לתוך רקמות פונקציונליות, עם כמה קבוצות מציאת יחס 3: 1 של myocytes לב: פיברובלסטים הפקת כוח העווית הגבוה ביותר 8. באמצעות שיטות בחירת תאים שונות, כולל משטח סמנים למיון תא חי, אפשר ליצור hECTs עם אוכלוסיות תאים מוגדרות. בעוד סמנים של תאי סטרומה הלא לב היו זמינים במשך זמן מה, כגון סמן פיברובלסטים המשוערת CD90 19,20, סמני משטח של myocytes לב כבר יותר קשיםלזהות. SIRPα היה בין סמני משטח הלב הראשונים המזוהים לצורך מיוציטים מלב אנושי 18 ו הוכח להיות בררן במיוחד עבור שושלת הלב. לאחרונה, מצאנו כי פעמיים מיון SIRPα + ו- CD90 - תאים מניב כמעט cardiomyocytes טהור, עם CD90 + האוכלוסייה מפגין פנוטיפ פיברובלסטים דמויי (Josowitz, תצפיות לא פורסם). בהתבסס על ממצאים שנאספו אלה, בזאת אנו מתארים יצירת hECTs באמצעות 3: שילוב 1 של SIRPα + / CD90 - cardiomyocytes ו CD90 + פיברובלסטים.

היכולת להנדס ברקמת לב אנושית מוגדרת לחלוטין חיונית לא רק ליצירת כלי מיון חזקים, אלא גם לפיתוח מערכות מודל לחקור cell- המתעורר וטיפולי לב מבוסס גנים. בפרט, טיפולים בתאים רבים לאי ספיקת לב, ניצול סוגי תאים כולל תאי גזע mesenchymal (MSC) 21 , תאי גזע לב 22 ותאי mononuclear מח עצם 23-25, נבדקו במחקרים קליניים. בעוד רבים של התוצאות הראשוניות כבר מבטיחים 21,23,25, היתרון הראשוני לעתים קרובות פוחת לאורך זמן 26-29. מגמה דומה דווחה ברקמות לב מהונדסות בעכברים, אשר מציגות יתרון פונקציונלי משמעותי בשל תוספת MSC, אבל ההטבה לא שספגה במהלך לתרבות לטווח ארוך 1. בבסיס הביצועים תת אופטימלית הוא הידע המוגבל שלנו של המנגנונים השולטים טיפולים בתאים. הבנה עמוקה יותר של איך טיפולי תאים להשפיע לטובה שלהם, כמו גם תוצאות שליליות אפשריות של אינטראקציות myocyte-nonmyocyte, שתאפשר הפיתוח של טיפולים השתפרו מניב קליני הטבות משמעותיות וקבועות, עם תופעות לוואי מינימאליות, עבור חולים עם אי ספיקת לב.

כאן אנו מתארים את השימוש hECTs מוגדרת interrogאכול מנגנוני טיפול מבוסס תאים. רכב רקמות הנשלט חיוני לזהות גורמים ספציפיים להשפיע על ביצועי cardiomyocyte. ישירות השלים hECTs עם סוג התא הטיפולי של עניין (למשל, MSCs), יכול לחשוף את ההשפעה על ביצועי myocyte לב, כפי שהראנו חולדה ECTs 1.

הפרוטוקול רב השלבים הבאים מתחיל התמיינות תאי גזע לב הופנה, ואחריו ייצור של bioreactor הרב-הרקמה, וכלה בתיאור בניית רקמות אנליזה פונקציונלית. הניסויים שלנו מבוצעים באמצעות שורת NIH-אושרה H7 תאי גזע עובריים אנושיים (hESC). עם זאת, הפרוטוקולים הבאים גם נבדקו באמצעות קו hESC נוספים ושלושה תאי גזע מושרים (hiPSC) קווים עם תוצאות דומות. מצאנו כי יעילות בידול cardiomyocyte והצלחה ייצור hECT יכול להיות קו התא תלוי, במיוחד FOקווי r hiPSC נגזר מטופלים בודדים. על ידי ביצוע בפרוטוקול זה, שתי מנות 6-גם הם מצופים עם סך של 1.68 מיליון hESCs (140,000 תאים לכל היטב), בתשואה של כ -2.5 מיליון מיוציטים לאחר ההבחנה במשך 20 ימים ומיון, מספיק כדי להפוך שש רקמות מוגדרות.

Protocol

הערה: בצע את כל המניפולציות התא בתנאים aseptic באמצעות ארון בטיחות ביולוגית HEPA מסונן בכיתה השנייה לעקר את כל הפתרונות על ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. בצע בניית רקמות בדיקה תפקודית באחת באותם תנאים מזוהמים או ברדס זרימה למינרית.

1. מתזמן של H7 hESCs כהכנה בידול לב

  1. (יום 1) הכנת מרתף מטריקס ממברנה
    1. להפשיר 150 aliquot μl של מטריקס קרום במרתף מוסמך hESC על קרח בן לילה על 4 מעלות צלזיוס.
  2. (יום 0-4) ציפוי של hESCs על צלחות מצופות
    1. לדלל את מטריקס מופשר לתוך 12 מ"ל של קר כקרח DMEM / F12 ומערבבים היטב.
    2. העברת 1 מ"ל של הפתרון DMEM / F12-מטריקס לבאר כל צלחת מטופל בתרבית רקמה 6 באר. כל aliquot של מעיל פחית מטריקס שני 6 צלחות היטב.
    3. דגירת הצלחות המצופות בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 לפחות.
      הערה:הניסיון, מצופית שלנו מנות חתומות עם פרפין ניתן לאחסן פתרון מטריקס ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 10 ימים לפני השימוש.
    4. בערך בשעה 75 מפגש%, לנתק את H7 hESCs מצלחת 10 ס"מ באמצעות 6 מ"ל של מגיב דיסוציאציה אנזימטית. לאחר 5 דקות, בעדינות לגרד את התאים מפני שטח התרבות באמצעות מגרד תא פנוי ולהעביר את ההשעיה לתא צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר סטרילי.
    5. הסר 0.5 מ"ל של הפתרון דיסוציאציה עם התאים מהצינור 15 מ"ל ולהעביר צינור מ"ל חדש סטרילי 15 (עוזב 5.5 מ"ל של מגיב דיסוציאציה נוספת לנתק את hESCs) לריבוי קו תאי גזע.
    6. גלולה 0.5 מ"ל של תאים ב XG 300 במשך 5 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant בעדינות resuspend ב 8 מ"ל של התקשורת תא גזע פלוריפוטנטיים המכיל 1% סטרפטומיצין פניצילין ואז מעבירים לצלחת בתרבית רקמה חדשה, מצופים, 10 ס"מ ולשמור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 כדי לשמור על קו תאי גזע.
      הערה: שמור תקשורת תא גזע פלוריפוטנטיים על קרח במהלך שינויי תקשורת.
    7. בינתיים, להוסיף 5.5 μl של 10 מ"מ ROCK מעכב Y-27632 לפתרון 5.5 מ"ל של דיסוציאציה הנותרים וממשיכים דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות אחר. לערבב בעדינות את התאים עם pipet 5 מ"ל סרולוגיות. המשך כדי לדגור עד ההשעיה תא בודד מושגת, אז גלולה התאים XG ב 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. Resuspend התאים 5 מ"ל של התקשורת תא גזע פלוריפוטנטיים ולבצע ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
    9. זרע היטב בכל צלחת 6-גם בצפיפות של 140,000 תאים לכל טוב. זרעי שתי צלחות 6-גם ליצור בסך הכל שש רקמות מוגדרות. זרוק כל תאים הנותרים לאחר הציפוי.
    10. מלאו הבאר עד 1 מ"ל עם התקשורת תא גזע פלוריפוטנטיים לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. עשרים וארבע שעות לאחר מכן, להסיר את המדיה ומוסיף 2 מיליליטר של תקשורת תא גזע פלוריפוטנטיים הטריה היטב כל (איור 1 א ).
    11. בדוק את המפגש של צלחות בכל יום ולהתחיל את הבידול פעם התאים להגיע לכ 75 מפגש% (איור 1 ב - D).

2. (יום 4-24) דיפרנציאציה של בתאי גזע עובריים אנושיים כדי cardiomyocytes 30,31

  1. (יום 4-7, בידול יום 0-3) mesoderm אינדוקציה
    1. הכן RPMI התקשורת בידול אני (טבלה 1) על ידי שילוב 500 מ"ל RPMI 1640 עם 10 תוספת מ"ל B27 (ללא אינסולין) ו 5 מ"ל של פתרון המניות סטרפטומיצין פניצילין (10,000 פניצילין IU / ml; 10,000 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין). Aliquot, על הקרח, אל צינורות 50 מ"ל ולאחסן ב 4 ° C..
    2. (יום 4, בידול יום 0) כן תקשורת אינדוקצית mesoderm על ידי הוספת 2.4 μl של CHIR99021 מעכב GSK3 מולקולה הקטן (מניית 10 מ"מימ, 6 מיקרומטר ריכוז סופי) עד 12 מיליליטר של תקשורת בידול RPMI I. הסר מדיה תא גזע פלוריפוטנטיים מכל טוב אnd להחליף עם 2 מ"ל של התקשורת אינדוקציה mesoderm לכל טוב. מחזירים את הצלחת אל האינקובטור.
      הערה: מוות של תאים משמעותי מתרחש בדרך כלל בתוספת CHIR99021 (איור 1E). בשכבה תתאושש, אבל זה חשוב לשטוף את התאים המתים משם עם שטיפת DMEM / F12.
    3. (יום 5, בידול יום 1) כן תקשורת אינדוקצית mesoderm טריה כמתוארים לעיל. הסר את המדיה הישנה מבאר כל ולשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל של DMEM / F12 לכל טוב. הוסף 2 מ"ל של התקשורת אינדוקציה mesoderm טרי היטב כל אחד.
      הערה: שטיפה כל יום מהיום 0-10 מגדיל מאוד תשואה וטוהר של myocytes לב.
    4. (יום 6, בידול יום 2) הסר את המדיה אינדוקציה הלב ולשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל DMEM / F12 לכל טוב. החזר את השטיפה עם 2 מיליליטר תקשורת בידול RPMI לי (לא מולקולות קטנות הוסיפו אבל עדיין עם B27 (ללא אינסולין) תוספת) ולחזור אל האינקובטור.
  2. (יום 7-13, בידול Day 3-10) לב mesoderm אינדוקציה
    1. (יום 7, יום 3 בידול) כן תקשורת אינדוקצית mesoderm לב על ידי הוספת 6 μl של המולקולה הקטנה Wnt מעכב IWR-1 (10 מ"מ מניות, 5 מיקרומטר סופיים) עד 12 מיליליטר של I. תקשורת בידול RPMI
    2. הסר את המדיה מכל טוב, לשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל DMEM / F12 לכל טוב ולהחליף עם 2 מ"ל של התקשורת אינדוקציה mesoderm לב לכל טוב.
    3. (יום 8, בידול יום 4) כן 12 מיליליטר נוסף של תקשורת אינדוקצית mesoderm לב כפי שתואר לעיל. הסר את המדיה הוסיף היום לפני, לשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל DMEM / F12 לכל טוב ולהחליף עם 2 מ"ל של התקשורת בידול mesoderm לב טרי לכל טוב ולחזור אל האינקובטור.
    4. (יום 9-10, בידול יום 5-6) ביום שני ימים, להסיר את המדיה אינדוקציה mesoderm הלב ולשטוף היטב עם כל 1 מ"ל של DMEM / F12.
    5. הוסף 2 מ"ל של התקשורת בידול טרי RPMI אני (ללא תוספת מולקולות קטנות אבל עדיין עם B27 (ללא אינסולין) תוספת)זה טוב ולהחזיר את הצלחת אל האינקובטור.
  3. (יום 11-24, בידול יום 7-20) הס הנגזרת לב Myocyte ארגון / הבשלה
    1. הכן התקשורת בידול RPMI השנייה (טבלה 1) על ידי שילוב 500 מ"ל RPMI 1640 עם 10 מ"ל B27 תוספת (עם אינסולין) ו 5 מ"ל של פתרון המניות פניצילין, סטרפטומיצין. Aliquot, על הקרח, אל צינורות 50 מ"ל ולאחסן ב 4 ° C..
    2. (יום 11, בידול יום 7) הסר מדיה בידול RPMI (ללא אינסולין) מבאר כל ולשטוף עם 1 מ"ל DMEM / F12. חלף עם 2 מיליליטר של תקשורת בידול RPMI החדשה השני (עם אינסולין) זה טוב ולחזור אל האינקובטור.
      הערה: מכות ספונטניות יש לשים לב ראשון בין ימים 7 ו 10. אם מכות לא נצפו במהלך הזמן הזה, זה בדרך כלל מצביע על יעילות בידול עניה. הפרוטוקול יכול להיות נמשך עד יום 15 במאמץ להתבונן מכות, אבל אם לא מכות הוא ציין ביום 15 עדיף stאמנות הבחנה חדשה.
    3. (יום 12-24, בידול יום 8-20) כל יום, להסיר את המדיה הבידול הישנה ולהחליף עם 2 מיליליטר של תקשורת בידול RPMI הטריה השני לכל טוב להתיר התבגרות תא וארגון בשכבת המכות (איור 1F, וידאו איור 1 ).
      הערה: בהתאם מוות של תאים שיורית, זה עשוי להיות נחוץ כדי לשטוף עם 1 מ"ל של DMEM / F12 דרך יום בידול 10.

3. (יום 24, יום בידול 20) בידוד של הלב myocytes תאים פיברובלסטים דמויי

  1. לנתק תאים מן חד שכבתי
    1. הסר מדיה בידול ולשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל PBS.
    2. לנתק את monolayers עם 1 מ"ל של הפתרון דיסוציאציה האנזימטית (0.04% טריפסין / 0.03% EDTA) זה טוב.
    3. הזז הצלחת לתוך החממה במשך 10 דקות. בינתיים, להוסיף 12 μl של מעכבי ROCK עד 6 מ"ל של תמיסת נטרול טריפסין.
    4. Gently להוסיף 1 מ"ל של הפתרון נטרול טריפסין המכיל מעכב ROCK היטב כל הצלחת לנטרל את פתרון טריפסין.
    5. שימוש pipet העברת סטרילי, לערבב בעדינות כל טוב כדי להתפרק צבירי תאים.
    6. להעביר את כל 12 מ"ל מהצלחת 6-היטב לצינור צנטריפוגות 15 מ"ל.
      הערה: מאז שתי 6-גם צלחות משמשות בפרוטוקול זה, שני צינורות 15 מיליליטר יהיה צורך.
    7. העברת 3 מ"ל של PBS היטב אחד של הצלחת, ולאחר מכן ברצף להעביר אותו 3 מ"ל היטב כל הבאים לאסוף את כל התאים שיורית על צלחת. מעבירים את 3 מ"ל הנותרים מהגמר היטב לתוך הצינור אותו 15 מ"ל צנטריפוגות המכיל את התאים.
    8. גלולה ב XG 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  2. כן תאים למיון תא חי על ידי FACS
    1. הכן את החיץ מכתים ידי הוספת 5 מ"ל של שור עוברית סרום 45 מ"ל של PBS על הקרח עם 50 μl של מעכבי ROCK.
    2. הסר את supernatant מן pel התאלתת (ב 3.1.8) ו resuspend ב 1.2 מ"ל של חיץ מכתים.
    3. העבר 200 μl של השעיה לתא צינור צנטריפוגות חדשות, מראש צונן, 50 מ"ל על הקרח. זו תהיה מלאה מכתימה השלילית.
    4. מעבירים את ההשעיה 1 מ"ל של תא הנותרים לצינור צנטריפוגות חדשות, מראש צונן, 50 מ"ל על הקרח ולהוסיף 2 μl SIRPα-PE / Cy7 (דילול 1: 500) ו -4 μl של CD90-FITC (1: 250 דילול) . בעדינות מערבבים את ההשעיה תא עם pipet העברת ולחזור הקרח.
    5. דגירה היא את שליטת מדגם השלילי, על שייקר נדנדה, על קרח, ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה.
    6. הכן צינורות אוסף מדגם ידי הוספת 3 מ"ל של RPMI התקשורת (עם אינסולין) לשני צינורות 15 מ"ל צנטריפוגות. הוסף 3 μl של ROCK מעכב צינור אחד ולאחסן על הקרח.
    7. גלולה התאים מוכתם ב XG 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C ולשטוף פעמיים עם 10 מ"ל לפחות של PBS קר כקרח לכל שטיפה.
    8. הוסף 1 μl של DAPI (1 מיקרוגרם / מ"ל) ל 5 מ"ל של חיץ מכתים. בעדינותresuspend גלולה המדגם עם 1-3 מ"ל של חיץ מכתים המכיל DAPI באמצעות העברת pipet.
    9. הוסף 500 μl של חיץ מכתים (ללא DAPI הוסיף) לשליטה השלילית.
    10. בעדינות לסנן הן את השליטה מדגם שלילי דרך מסננת תא 40 מיקרומטר כדי להסיר גושים של תאים ולהעביר קלקר צינורות FACS על הקרח. מיד להביא דוגמאות על סדרן תא.
    11. בדומה הוקם חי מיון תא שיטות 18, להשתמש בשלט השלילי להגדיר את השערים, בחר עבור תאי חיים (DAPI שלילי) ולאסוף הן + FITC (כלומר, CD90 + פיברובלסטים) ו- PE / Cy7 + (כלומר, SIRPα + cardiomyocytes ) אוכלוסיות 20 psi (איור 2 עצמאי).
      הערה: לאחר קביעת השערים, הביקורת השלילית ניתן לתקן PFA 4% כדי לקבוע את היעילות בידול על ידי מכתים עבור-T טרופונין לבבי.
      הערה: יש חוקרים ויעדיפואלוטיפ ולא שליטה בלא כתם כדי להגדיר את השערים כדי לפצות מחייב נוגדנים שאינם ספציפיים. אחד מינוס שנקרא הקרינה (FMO) שליטה היא אפשרות נוספת. בשל פיזור bimodal הברור של FITC, DAPI אותות PE-Cy7, אנו מגודרים מן האוכלוסייה החיובית, שמרני מכוונים רחוק לתוך השער החיובי, אשר אולי לא כולל כמה תוצאות חיוביות נכונה אבל עוזר למזער את תוצאות חיוביות שגויות.
  3. Cell Reaggregation כהכנה הנדסת רקמות
    1. לאחר מעין תא, גלולה שני צינורות איסוף resuspend ב 1 מ"ל של DMEM המכיל 10% סרום ילודים שור, 1% סטרפטומיצין פניצילין 0.2% Amphotericin B ( "מדיה NBS").
    2. ולשלב מחדש את תאי SIRPα + ו- CD90 + ב ליחס 3: 1 ו צלחת התאים בשילוב בתרבות הלא רקמה שטופלו צלחת פטרי בצפיפות של 2 מיליון תאים לכל 60 ס"מ 2 (10 צלחת ס"מ). הוסף 10 מ"ל של התקשורת NBS ו -101; l של ROCK מעכב Y-27632.
    3. מניח השעית תא בתרבית רקמת החממה עבור 48 שעות כדי לאפשר תא reaggregation בצבירים קטנים.

4. הנדסת רקמות אדם לב

  1. לפברק את Bioreactor Multi-רקמה
    הערה: כדי להשלים את האיורים באיור 3A, קבצי CAD עם שרטוטים עיצוב bioreactor מפורט יימסרו לכל מבקש מן המחברים.
    1. מכונת עובש אמן PDMS באמצעות קידוח שישה במרווחים חורים שווה של 0.5 מ"מ קוטר לתוך קוביות 9 x 33 x 3.25 מ"מ של polytetrafluoroethylene.
    2. שימוש endmill, מכונת מסגרת מ פוליסולפון בשטח של 25 x 35 x 11 מ"מ 3. מטרת המסגרת היא להחזיק את ההודעות PDMS (בנוי השחקנים עשו לעיל) ובהלימה בארות baseplate.
    3. באמצעות בנפרד 1 מ"מ endmill, מכונת 6 בארות (6 x 1 x 1 מ"מ 3), 4 מ"מ לתוך חתיכת 3 20 x 40 x 5 מ"מ של פולי השחוריםtetrafluoroethylene כדי ליצור את baseplate.
    4. מערבב את בסיס אלסטומרי סוכן ריפוי עבור polydimethylsiloxane (PDMS) בתוך 10: 1 w / פרופורציות ולהוסיף את תבנית polytetrafluoroethylene המותאם אישית (שלב 4.1.1) כדי ליצור שתי שורות של שישה פוסט כוח-חישה, דגירת הלילה ותחת ואקום ב 80 מעלות צלזיוס. לאחר ריפוי, להסיר את PDMS בעדינות מהתבנית מאסטר ובזהירות לסמן את צמרות כל הודעה בטוש שחור קבע עבור ניגודיות משופרת ומעקב סטיה פוסט בזמן אמת אוטומטי.
      הערה: Polytetrafluorethylene די רך ועלול להינזק בקלות. היזהר בעת ניקוי עובש אמן לפני PDMS הליהוק על מנת להבטיח אריכות ימים של מערכת וגיאומטריה פוסט PDMS עקבית. חוט 0.5 מ"מ ניתן להשתמש כדי לנקות את החורים עבור ההודעות לאחר כל שימוש, אך היזהר שלא לגרד את החלק הפנימי של החורים.
      הערה: חלופה אחת היא דגה את PDMS תחת ואקום במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר, ואז לתת את התרופה תערובת בלחץ הסביבה.זה עלול להוביל בועות גז שיורית פחות להיקוות PDMS במהלך תהליך הריפוי.
    5. לעקר את כל הרכיבים בתוך אדי חיטוי.
      הערה: עובש אמן PDMS (שלב 4.1.1) ומסגרת פוליסולפון (שלב 4.1.2) הם גם לשימוש חוזר. את הודעות PDMS נוצרו מתוך היצוק (שלב 4.1.4) הן גם לשימוש חוזר אבל רק למשך כ -10 שימושים. עם זאת, יותר הודעות PDMS ניתן ליצור לפי הצורך באמצעות עובש אמן.
  2. איסוף תאי Reaggregated לב
    1. הסרת תאים reaggregated מן החממה ולהעביר את כל 10 מ"ל של התקשורת reaggregation לצינור צנטריפוגות 50 מ"ל.
    2. יש לשטוף את הצלחת עם 3 מיליליטר של PBS ולהעביר את לשטוף את הצינור אותו 50 מיליליטר צנטריפוגות המכיל תקשורת reaggregation.
    3. הוסף 3 מ"ל של 0.04% טריפסין / 0.03% EDTA כדי בצלחת 10 ס"מ ולחזור בחממה במשך 5 דקות.
    4. לאחר 5 דקות, לבדוק את הצלחת עם מיקרוסקופ המתחם הפוך ב 10X הגדלה כדי להבטיח dissocia תא מלאtion מצלחת. אם כמה אשכולות שיורית עדיין מחוברים, בעדינות להתסיס את הצלחת לנתק את הגושים. אם האשכולות נשארים צמודים, לחזור בחממה במשך 2-3 דקות אחרות. אין דגירה יותר מעשר דקות או מוות של תאים משמעותיים עלולים להתרחש.
    5. לאחר כל התאים מנותקים, להוסיף 3 מ"ל של תמיסת נטרול טריפסין. בעדינות מערבבים את פתרון נטרול עם הפתרון טריפסין תאים ולהעביר את הצינור צנטריפוגה 50 מ"ל המכיל את התקשורת reaggregation ולשטוף פעם עם PBS.
    6. יש לשטוף את צלחת כולו עם 5 מ"ל של PBS ולהעביר אל הצינור אותו 50 מ"ל המכיל את התאים.
    7. גלולה התאים XG ב 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של התקשורת NBS, ואז להעביר צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
    9. גלולה ב XG 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר להסיר את supernatant. תאי הלב (תאי CD90 + סטרומה SIRPα + myocytes) מוכן כעת לבניית רקמות.
  3. (אופציונלי) איסוף תאים משלימה עניין
    הערה: בנוסף לרקמות המוגדרות המכילות רק SIRPα + cardiomyocytes ו CD90 + תאי פיברובלסטים דמויים, אפשר להוסיף תאים נוספים של עניין לחקור את השפיע על תפקוד רקמות. לדוגמא MSCs העכברוש הוכח כדי לשפר את התפקוד של רקמות לב מהונדסת עכברוש 1. הצעד האופציונלי הבא מתאר את האוסף של תאים משלימים למערכת המוגדרת.
    1. אסוף את סוג התא המשלים של עניין (למשל, בתאי גזע mesenchymal) באמצעות EDTA 0.25% טריפסין / 0.1%.
    2. גלולה התאים XG ב 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן resuspend ב 5 מ"ל של תרבית תאים התקשורת המתאימה לסוג של עניין התא. לדוגמא, עבור MSCs, השתמש DMEM בתוספת 20% בסרום שור עוברי, 1% סטרפטומיצין פניצילין 0.2% amphotericin-B לתרבות גאמות.
    3. בצעו ספירת תאים באמצעות hemocytometer, אז גלולה התאים שוב ב XG 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. הסר את supernatant, resuspend ב 1 מ"ל של התקשורת בתרבות התא והעברת צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
    5. גלולה התאים XG ב 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. הסר את supernatant. תאי המשלים מוכנים כעת לבניית רקמות.
      הערה: אם התאים המשלימים מתווספים בריכוז של 10% במספר הכולל התא בתוך הרקמה, אז עבור הרקמות המוגדרות, זה ידרוש 50,000 תאים משלימים לכל רקמה כמו כל רקמה מכילה 500,000 תאי לב (שני תאי סטרומה CD90 + ו SIRPα + מיוציטים).
  4. צור את רקמות לב Engineered האנושות
    הערה: אחסן את כל הפתרונות על הקרח התאים בטמפרטורת החדר. כל הכרכים המפורטים להלן לכל רקמה. בדרך כלל, כשש רקמות ניתן לבנות שני 6-גם plאטס של בידול לב.
    1. לדלל 60.0 μl של המניה קולגן 5 מ"ג / מ"ל ​​ל 3.125 מ"ג / מ"ל ​​עם 1.5 μl של 1 M NaOH, 9.6 μl של 10x PBS ו 24.9 μl של מים ללא יונים ultrapure סטרילית.
      צעד קריטי: הימנע כניסתה של בועות אוויר לכל פתרון במהלך ההכנה כבועות אוויר תשבשנה היווצרות רקמה נאה.
    2. להוסיף 12.0 μl של שני MEM 10x ו -0.2 N HEPES pH 9 לתערובת קולגן לדלל ליצור תמהיל קולגן. הוסף הן פתרונות למטה בצד של הצינור צנטריפוגה 15 מ"ל כדי למנוע את כניסתה של בועות אוויר לתערובת קולגן.
    3. מוסיפים את מטריקס קרום במרתף לריכוז סופי של 0.9 מ"ג / מ"ל ​​לתערובת קולגן ולאחסן על הקרח כדי ליצור תמהיל רקמות הסופי. הריכוז הסופי של קולגן צריך להיות 2 מ"ג / מ"ל.
    4. להוסיף 500,000 של תאי reaggregated לתערובת רקמות (myocyte + ריכוז פיברובלסטים הוא 20 מיליון / מ"ל) ולמלא לנפח סופי של 25 μl לכלרקמה עם התקשורת או NBS ללא תא או 50,000 תאים של סוג תא משלים של עניין (למשל, hMSCs) ומערבבים היטב כדי ליצור ההשעיה תא אפילו.
      הערה: מספר תאים בתוספת ישתנה מן ליישומים שונים. הנה 10% תוספת משמשת.
    5. עם טיפול, pipet 25 μl של השעיה התא לתוך כל אחד מששת בארות baseplate bioreactor, ללא החדרת בועות אוויר לתוך הבאר.
    6. לדחוף שתי שורות של חיישני כוח PDMS על משני צדי מסגרת פוליסולפון, ויצר 6 זוגות של הודעות מנוגדות, ואז להפוך את המסגרת על גבי baseplate כך זוג אחד מהפוסטים נכנס לכל היטב המכיל את השעית התא.
      הערה: מסגרת פוליסולפון כולל כרטיסיות כדי לסייע ביישור של PDMS.
    7. בזהירות במקום bioreactor, baseplate למטה, לתוך צלחת 60 מ"מ, אז במקום צלחת בלי העטיפה שלו הפנימי של צלחת 10 ס"מ, מניחים את המכסה 10 ס"מ על גבי, ולהעביר את הרכבה bioreactor כולואל האינקובטור בתרבית רקמה, מחכה שעתיים עד שהרקמה להגליד.
    8. לאחר 2 שעות, להסיר את bioreactor מן החממה ולהוסיף 14 מ"ל של התקשורת NBS אל מכלול שלם, מספיק כדי לכסות את baseplate. חזור אל האינקובטור, ולשנות מחצית התקשורת מדי יום.
    9. ארבעים ושמונה שעות לאחר מכן, להסיר בזהירות את baseplate ידי הזזת כל צד בעדינות של baseplate את המסגרת כמה מילימטרים בכל פעם, לשנות את התקשורת, ולאחר מכן להחזיר את bioreactor, רקמות פונות כלפי מטה, אל התקשורת.
    10. המשך שינוי מחצית התקשורת בתרבות NBS מדי יום.
      הערה: התכווצויות ספונטניות של הרקמה ניתן להבחין מוקדם ככל 3 ימים לאחר בניית רקמות, יצירת כוחות עווית למדידה מוקדם ככל יום 5 עד 7.

תוצאות

כדי להשיג myocytes לב, גרסה מעט שונה של שיטות בידול Boheler וליאן משמשת 30,31. זה הכרחי כי הבידול מתחיל במהלך יומן פאזיים של צמיחת תאים, אלא גם כי אוכלוסיית המוצא היא ומחוברות מספיק כדי לקבל מספר שמיש של תאים לאחר המיון (כ 75% הם אופטימליים). בדרך כלל, עבור H7 hESCs, ציפוי בצפיפות ...

Discussion

בניית רקמות לב מהונדסת אנושיות תחמו (hECT) יכולה לספק מודל יותר עקבי ואמין של תפקוד myocyte לב אנושי. האנושות, כל הרכיבים הסלולר תאיים במערכת ידועים וניתן לטפל לפי צורך, ובכך להסיר את ההשפעה של בלבול סוגי תאים ידועים אחרים הנובעים תהליך ההתמיינות. כדי לאזן צמיחת תאים מהירה ?...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי NIH (1F30HL118923-01A1) כדי TJC, HHSN268201000045C חוזה NIH / NHLBI PEN כדי KDC, המועצה מענק מחקר של הונג קונג TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) כדי Bdg, האמריקני איגוד הלב (12PRE12060254) כדי RJ, ומחקר גרנט מועצת HKSAR (TBRS, T13-706 / 11) כדי RL מימון נוסף שהועמדה TJC ידי NIH DRB 5T32GM008553-18 וכתוצאה התמחות על הדרכה NIDCR-הבינתחומי מערכות התפתחותית פגמי ביולוגית לידת T32HD075735. המחברים גם מבקשים להודות בתודה ארתור Autz ב"מרכז זאן של המכללה העירונית של ניו יורק על הסיוע עם עיבוד bioreactor ו ממדוח Eldaly לקבלת סיוע טכני. כמו כן, אנו מודים לד"ר קנת Boheler לקבלת ייעוץ על בידול הלב, וד"ר יהושע הייר למתן אדם בתאי גזע mesenchymal בנדיבות.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell CultureCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BSigma-AldrichA2411Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with InsulinLife Technologies17505055
B27 without InsulinLife TechnologiesA1895601
CHIR99021Stemgent04-0004Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 MediaLife TechnologiesA1517001
H7 Human Embryonic Stem CellsWiCellWA07
hESC Qualified Matrix, Corning MatrigelCorning354277Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1Sigma-AldrichI0161Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf SerumLife Technologies16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation ReagentStem Cell Technologies7174
Penicillin-StreptomycinCorning30-002-CI
RPMI 1640Life Technologies11875-093Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor)Stemgent04-0012Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell SortingCompanyCatalog NumberComments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)Life TechnologiesD1306
CD90-FITCBioLegend328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution) PromoCellC-41200
Fetal Bovine SerumAtlanta BiologicsS11250
SIRPα-PE/Cy7BioLegend323807
Tissue ConstructionCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin/0.1% EDTAFisher Scientific25-053-CIOptional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEMSigma-AldrichM0275-100ML
10x PBS PacketsSigma-AldrichP3813
Collagen, Bovine Type ILife TechnologiesA10644-01Keep on ice
DMEM/F12Life Technologies11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High GlucoseSigma-AldrichD5648
Polydimethylsiloxane (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Sodium HEPESSigma-AldrichH3784
Sodium HydroxideSigma-Aldrich221465
MaterialsCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml microcentrifuge tubesFisher ScientificNC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tubeCorning352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom TubeCorning352235With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tubeCorning352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plateCorning353046
Cell Scraper, DisposableBiologix70-2180
PolysulfoneMcMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon)McMaster-Carr
EquipmentCompanyCatalog NumberComments
Dissecting MicroscopeOlympusSZ-61Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing SystemAstro-Med, IncGrass S88X Stimulator
High Speed CameraPixelinkPL-B741UOr similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature ControlUsed to maintain media temperature during data acqusition.
Custom MaterialsCompanyCatalog NumberComments
LabView Post-tracking Programavailable upon request from the authors

References

  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  3. Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14 (5), 669-679 (2000).
  4. Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, 16-23 (2007).
  5. Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
  6. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
  7. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28 (2), 644-654 (2014).
  8. Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (49), 4698-4707 (2013).
  9. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6 (10), e26397 (2011).
  10. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109 (1), 47-59 (2011).
  11. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  12. Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35 (5), 1367-1377 (2014).
  13. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  14. Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7 (5), e38147 (2012).
  15. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  16. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  19. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42 (5), 991-1000 (2007).
  20. Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).
  21. Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
  22. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  23. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  24. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152 (3), 434-441 (2006).
  25. Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126 (5), 551-568 (2012).
  26. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30 (24), 2978-2984 (2009).
  27. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113 (10), 1287-1294 (2006).
  28. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  29. Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114 (10), 1564-1568 (2014).
  30. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010 (2014).
  31. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  32. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293 (2011).
  33. Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. , 732742 (2013).
  34. Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161 (3), 487-493 (2011).
  35. Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108 (7), 792-796 (2011).
  36. Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104 (24), 2923-2931 (2001).
  37. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12 (3-4), 331-343 (2007).
  38. Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Bioengineering109myocytesmesenchymalmesenchymalBioengineeringmicroenvironmentSIRPACD90

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved