דוגמנות השלבים המוקדמים של סרטן השחלות הפצה בתרבות Organotypic של אדם חלל הבטן

Summary

Here, we present a protocol to construct a three-dimensional in vitro model of the lining of the peritoneal cavity, composed of primary human mesothelial cells and fibroblasts layered with extracellular matrix, as a tool to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

Abstract

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. Instead, ovarian cancer cells exfoliated from the primary tumor are carried by peritoneal fluid to metastatic sites within the peritoneal cavity. These sites, most notably the abdominal peritoneum and omentum, are organs covered by a mesothelium-lined surface. To investigate the processes of ovarian cancer dissemination, we assembled a complex three-dimensional culture system that reconstructs the lining of the peritoneal cavity in vitro. Primary human fibroblasts and mesothelial cells were isolated from human omentum. The fibroblasts were then mixed with extracellular matrix and covered with a layer of the primary human mesothelial cells to mimic the peritoneal and omental surfaces encountered by metastasizing ovarian cancer cells. The resulting organotypic model is, as shown, used to examine the early steps of ovarian cancer dissemination, including cancer cell adhesion, invasion, and proliferation. This model has been used in a number of studies to investigate the role of the microenvironment (cellular and acellular) in early ovarian cancer dissemination. It has also been successfully adapted to high throughput screening and used to identify and test inhibitors of ovarian cancer metastasis.

Introduction

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy¹. The majority of patients are diagnosed after the cancer has disseminated throughout the peritoneal cavity. Once the cancer has spread throughout the peritoneal cavity, cytoreductive surgery and chemotherapy are often not sufficient treatment to prevent cancer recurrence and chemoresistance, resulting in a less than 30% 5-year survival rate. Ovarian cancer metastasis is predominantly limited to the peritoneal cavity, and several other cancer types, including gastric, pancreatic, and colon cancers, metastasize to the same anatomic sites in the peritoneal cavity. In general, ovarian cancer cells detach from the in situ carcinoma in the fallopian tube or the primary ovarian tumor, travel in peritoneal fluid as single cells or spheroids, and attach to mesothelium-lined surfaces of the omentum, bowel, and abdominal wall².

The tumor microenvironment plays an important role in disease progression and chemoresistance in many cancers^3-6. The peritoneal cavity is a unique microenvironment, with a mesothelial cell monolayer covering the majority of surfaces (Figure 1A)⁷. The mesothelial lining acts as a barrier that creates a low-friction surface, which tends to be protective against cancer cell adhesion⁸. Immediately underneath this mesothelial-lined surface is a layer made predominantly of fibroblasts and extracellular matrix (ECM), which promote cancer cell adhesion and invasion⁸. Ovarian cancer cells secrete factors that induce changes in the mesothelial cell lining that enhance ovarian cancer cell adhesion, invasion, and metastasis^9,10. Ovarian cancer cells adhere to the mesothelial surface via integrin and CD44-mediated mechanisms (Figure 1B)^11-16.

Historically, several 3D models have been developed to investigate ovarian cancer interactions with the microenvironment. Some of the first models studied ovarian cancer-ECM interface^17-21, ovarian cancer-mesothelial cell communication^13,14,21-24, or both²⁵ (reviewed by us ²⁶). Niedbala et al. discovered that ovarian cancer cells display a quicker and firmer adhesion to ECM than to mesothelial cells or to plastic alone²⁵. However, these models did not histologically resemble the peritoneal microenvironment. Therefore, we established a 3D organotypic model to more thoroughly replicate the ovarian cancer microenvironment. In order to better understand the role of the microenvironment and the interaction between cancer and peritoneal cells in the peritoneal dissemination of ovarian cancer, we have developed a 3D organotypic in vitro culture model of the peritoneal cavity lining (schematic in Figure 1C). The proposed model is composed of primary human fibroblasts and ECM, covered with a layer of primary human mesothelial cells-each cell type is isolated from human omentum. Histologically, this model resembles the normal peritoneal or omental lining, and provides a surface on which we can study the tumor microenvironment, the interaction between cancer cells and normal tissue, and the processes of cancer cell adhesion, invasion, and proliferation⁸.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל פרוטוקולי המחקר המתוארים נבדקו על ידי אוניברסיטת שיקגו Institutional Review Board (IRB). הסכמה מדעת שהתקבלה מכל מטופל לפני הניתוח והמחקר אושר על ידי אוניברסיטת שיקגו IRB. יש להשתמש בסוג בטיחות ביולוגית קבינט 2 וכפפות בעת טיפול רקמות אנושיות להגנה וכדי להפחית את הסיכון של זיהום תאים.

1. בידוד והתרבות של תאי סטרומה לא הותמר הראשיים

1. אוסף אדם רקמה והכנה.
   1. להשיג דגימות של omentum האנושי, 2 סנטימטר ^3, הוסר במהלך ניתוח בבטן, ולטבול מייד רקמה מלוחים RT-פוספט (PBS) (איור 2 א). חתיכת omentum 3 סנטימטרים X 2 סנטימטר בדרך כלל מניבה 1 מיליון תאים ראשוניים אדם mesothelial (HPMC) ו200,000 fibroblasts אדם ראשוני או fibroblasts הנורמלי omental (נוף).
   2. ספין למטה PBS הרקמה הייתה שקועה ברמה של 0.5 XG במשך 3דקות בהקדם האפשרי לאחר איסוף (<2 שעות בPBS) ולהעביר את הרקמה עד 20 מיליליטר PBS הטרי בצינור חרוטי 50 מיליליטר. לחתוך את הרקמה לתוך ³ חתיכות 5 מ"מ על ידי מיותר עם ​​אזמלים בקוטר 15 סנטימטר, צלחת תרבות סטרילי (איור 2).
2. בידוד תא mesothelial האנושי ראשוני ⁸
   1. כדי לבודד HPMC, להעביר את הרקמות טחונות לתוך צינורות חרוטי 50 מיליליטר ולחכות 1 דקות לחתיכות מוצקות ללצוף למעלה (איור 2 ג & D). HPMC ותאי דם אדומים (RBC) יהיו נוכחים בנוזל שבתחתית. השתמש pipet כדי להסיר את הנוזל מהחלק התחתון של הצינור ולתוך צינור חרוטי חדש. ספין הנוזל מטה ברמה של 0.5 XG במשך 3 דקות ולשאוב supernatant מגלולת HPMC / RBC.
      1. חזור על התהליך שלוש פעמים: להוסיף 20 מיליליטר PBS לרקמות טחונות, לאפשר רקמה לעלות, להסיר נוזל מהתחתית עם טפטפת ולתוך צינור HPMC / RBC, ספין למטה, ולהסיר אתsupernatant. אחרי הכל הספינים הושלמו וsupernatant הוא aspirated, גלולה תכיל HPMC וRBC.
   2. צלחת כל התאים מהגלולה לבקבוק ² 75 סנטימטר ב 15 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה (DMEM עם סרום 10% שור עוברי [FBS], ויטמיני ממ 1% [93 מ"ג / ליטר], חומצות אמינו החיוני ממ 1% [81.4 מ"ג / ליטר], 1% סטרפטומיצין פניצילין [פן-דלקת, 100 U / פניצילין מיליליטר ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין]).
   3. בצע לשטוף PBS משניים לבודד HPMCs נוסף.
      1. לPBS המשני לשטוף, לנער את הרקמה המוצקה שנותרה על 200 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 20 מיליליטר של PBS, ולאחר מכן לחכות 1 דקות לרקמות ללצוף למעלה. הסר את הנוזל מהחלק התחתון של הצינור לתוך צינור חדש, צנטריפוגות ב 0.5 XG במשך 3 דקות, ולשאוב supernatant.
      2. פלייט כל HPMC / RBC מPBS המשני לשטוף בבקבוק ² 75 סנטימטר נפרד ב 15 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה.
   4. כדי לבודד כל remaining HPMC, לנער את הרקמות טחונות ב 200 סל"ד, 37 ° מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 20 מיליליטר של 1: 1 0.25% טריפסין EDTA 25 מ"מ: פתרון PBS לפי נפח. לאפשר לרקמות לעלות, לאסוף את הנוזל בחלק התחתון של הצינור לתוך צינור 50 מיליליטר חדש, וספין למטה ברמה של 0.5 GX 3 דקות.
      1. לשאוב supernatant וצלחת כל HPMC / RBC בבקבוק ² 75 סנטימטר נפרד ב 15 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה.
   5. תרבות התאים המצופה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ בסביבה humidified. תאי הזנה מצופים על ידי הוספת 15 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה בימים 3 ו -5 מבלי להסיר את התקשורת בילתה. HPMC יכול להיות מתורבת במשך 5-7 ימים לפני הפיצול.
      1. השתמש HPMC נמוך מעבר (עד למעבר 2) בכל הניסויים כדי למזער dedifferentiation ושינוי של פנוטיפ המקורי. השתמש במיקרוסקופ שדה רחב רצוי עם מטרת 20x עם יכולות ההפרש פלסטיק ניגוד להפרעה או אובייקטיבי 4-20x עם capabilitie ניגוד שלבs (מסנני שלב ניגוד למיקרוסקופ) לקחת את כל התמונות של תאים, ומטרת 10x () בשדה בהיר לנתח immunohistochemical 3,3' diaminobenzidine מכתים (DAB).
   6. ודא שHPMC הוא cuboidal ולהביע cytokeratin 8 וvimentin על ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה ⁸ (איור 3 א, ג, ה).
3. בידוד NOF ⁸
   1. הכן 10 מיליליטר של המניה של פתרון מסוג collagenase III (10x) על ידי שילוב של 1: 1 תערובת של 100x פן-דלקת: 1 פעילות יחידות 1500 / מיליליטר של סוג collagenase השלישי: פעילות 714 יחידות / מיליליטר של hyaluronidase ב PBS.
   2. לנער את הרקמות טחונות omentum שנותרו לאחר בידוד HPMC ב 200 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות ב 10 מיליליטר של הפתרון מסוג 10x collagenase III המדולל בסרום ללא מדיה (DMEM עם ויטמיני 1% ממ [93 מ"ג / ליטר], חומצות 1% ממ אמינו החיוני [81.4 מ"ג / L], 1% סטרפטומיצין פניצילין [פן-דלקת, 100 U / פניצילין והמ"ל 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין]). רקמה מתעכל תיראה אטומה ואולי קצת פסולת סיבית (איור 2E).
   3. צנטריפוגה תאי NOF התמיסה המכילה בהשעיה על 0.5 XG במשך 3 דקות ב RT, לשאוב supernatant וצלחת גלולה בבקבוק ² 75 סנטימטר ב -13 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה.
   4. הסר המדיה ישנה ולהחליף עם 15 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה הטרי לאחר 24 שעות. NOF יכול להיות מתורבת ל1-3 ימים לפני הפיצול. התפשטות הערה של NOF תחדל כאשר התאים מגיעים confluency.
   5. ודא שfibroblasts האדם העיקרי הם תאים שטוחים, מוארכים ולהביע vimentin אבל לא cytokeratin 8 על ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה ⁸ (איור 3, D, F). השתמש NOF נמוך מעבר לניסויים (באופן אידיאלי לפני המעבר 3) כדי למזער dedifferentiation ושינוי של פנוטיפ המקורי. השתמש במיקרוסקופ שדה רחב עם מטרת 20x עם יכולות דסק"ש פלסטיק ללוקח את כל תמונות השלב של תאים,ומטרת 10x בשדה בהיר לנתח צביעת DAB immunohistochemical.

2. ציפוי Organotypic תרבות ⁸

1. NOF שחרור מהבקבוק תרבות 75 סנטימטרים על ידי שטיפה עם 10 מיליליטר של PBS ואחרי 3 מיליליטר של 0.25% טריפסין / 25 מ"מ EDTA ללא יותר מ 5 דקות. לנטרל טריפסין עם לפחות 3 פעמים את נפח תקשורת צמיחה מלאה.
2. העבר את תאי trypsinized לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ומסובב את ברמה של 0.5 GX 3 דקות. הסר supernatant ולהביא תאים לגבות ב 5 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה. השתמש בדלפק תא לספור את התאים התאוששו מהבקבוק התרבות.
3. לדלל תאים בנפח המתאים של תקשורת צמיחה מלאה לצלחת 2,000-4,000 NOF לכל 100 μl על צלחת שחורה, עם תחתית ברורה, 96-היטב. להוסיף 0.5 מיקרוגרם / μl 100 של קולגן אני עכברוש זנב לתערובת התא לפני ציפוי. בואו תאים לשבת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ בסביבה humidified לפחות 4 שעות, או עד שהתאיםלדבוק במשטח הצלחת.
4. שחרר HPMC מהבקבוק התרבות משתמש באותן שיטות שתוארו בשלבי 2.1 ו -2.2. לדלל תאים בכמות המתאימה של תקשורת צמיחה מלאה לצלחת 10,000-20,000 HPMC לכל 50 μl על גבי NOF כבר מצופה קולגן אני ב96-גם צלחות. בואו התאים לשבת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ בסביבה humidified לפחות 18 שעות לפני תחילת ניסויים.
5. חלבון תרבות ירוק ניאון (GFP) -expressing תאי סרטן השחלות HeyA8 בתקשורת צמיחה מלאה. תאי סרטן השחלות HeyA8 שכותרתו fluorescently ידי ביטוי של וקטור lentiviral להביע טרגליים cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). תאי סרטן השחלות HeyA8 צריכים להיות מחוברות 80-90% ביום שימוש (שלב צמיחת לוגריתמים). לשחרר תאים מצלחת התרבות ולספור באמצעות אותן השיטות שתוארו בצעדים 2.1-2.2 לתאים ראשוניים.
6. לאפשר לתאי סרטן השחלות להתאושש בתקשורת צמיחה מלאה במשך 15-20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בצינור חרוטי עם המכסה אטום באופן רופף.

3. הדבקה Assay ⁸

1. לאחר התאוששות, גלולה תאי סרטן השחלות על ידי ספינינג במשך 3 דקות ברמה של 0.5 XG ולאחר מכן להסיר את supernatant ולדלל את התאים בנפח המתאים של סרום ללא מדיה כדי להשיג ריכוז של 50,000 תאים / μl 100.
2. הפוך את 96-גם הצלחות עם תרבויות organotypic / NOF HPMC להסיר תקשורת בילתה, ולהוסיף את ההשעיה תא הסרטן 100 μl בסרום ללא מדיה לכל אחד. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ בסביבת humidified למשך 30 דקות עד 4 שעות.
3. הפוך את צלחת 96-היטב כדי להסיר תקשורת ותאים שאינם חסיד. השתמש pipet רבי ערוצים בהספק נמוך לpipet בזהירות ובעדינות של PBS 100 μl לכל טוב, ולהפוך את צלחת שוב. חזור על PBS לשטוף פעם נוספת.
4. הפוך להסרת PBS ולהוסיף paraformaldehyde 100 μl 4% לכל אחד. לאפשר את הצלחת לשבת במשך 20 מילn כדי לתקן את התאים. לאחר 20 דקות, להפוך את הצלחת ולהוסיף 100 μl PBS.
5. שימו לב שהקרינה הכוללת של בארות ניתן לדווח או את מספר התאים ניתן לכמת. לכימות, צלחת ראשונה עקומה סטנדרטית בשני עותקים באמצעות תאי HeyA8 בריכוז של 1 מיליון תאים / מיליליטר.
   1. הפוך את העקומה סטנדרטית על ידי ספינינג למטה 1 מיליון תאים, הסרת תקשורת, ומאפשר להם לשבת בparaformaldehyde 1 מיליליטר 4% במשך 20 דקות.
   2. תאי ספין שוב ולהעלות ב 1 מ"ל PBS (תאי ספירה חוזרת כדי לאשר 1 מ'/ מיליליטר ריכוז). צלחת 50,000, 40,000, 30,000, 20,000, 10,000, 5000, 1000, ו -0 תאים לכל טוב בשני עותקים, ולהוסיף PBS להיקף כולל סופי של 50 μl בכל טוב.
6. תחתון לקרוא את צלחת התרבות על קורא ניאון צלחת (עירור = 488 ננומטר, פליטה = 528 ננומטר), דרוג בארות גבוהות (50,000 על עקומה סטנדרטית). השתמש בעקומה סטנדרטית לחישוב תאי סרטן השחלות כמה דבקו organotypתרבות IC בכל טוב (4A-C איור).

4. הפצת נשק Assay ¹⁰

1. לאחר שתאי סרטן השחלות להתאושש (ראה שלבים 2.5 ו -2.6 לעיל), גלולה התאים על ידי ספינינג במשך 3 דקות ברמה של 0.5 XG ואז לדלל את התאים בנפח המתאים של 1% FBS תקשורת (DMEM עם FBS 1%, ממ 1% ויטמינים [93 מ"ג / ליטר], חומצות 1% ממ שאינם חיוניות אמינו [81.4 מ"ג / L], 1% סטרפטומיצין פניצילין [פן-דלקת, 100 U / פניצילין מיליליטר ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין]) כדי להשיג ריכוז של 4,000 תאים / 150 μl.
2. הפוך את הצלחת 96-היטב עם / תרבויות organotypic NOF HPMC להסיר תקשורת בילתה, ולהוסיף 150 μl של ההשעיה תא הסרטן ב 1% FBS תקשורת היטב כל אחד. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ בסביבת humidified במשך 72 שעות.
3. תחתון לקרוא את צלחת התרבות על קורא ניאון צלחת פעם אחת ביום (עירור = 488 ננומטר, פליטה = 528 ננומטר) כדי להעריך את ההתפשטות היחסיתשל תאים. המשך assay עבור 96 שעות, לשנות את התקשורת בשעה 48 (איור 5 א-ג). היזהר שלא להפריע לתרבות כאשר תקשורת משתנות (היפוך לצלחת עדיפה).

5. פלישת Assay ⁸

1. לפני ציפוי תרבות 3D, להוסיף קולגן עכברוש זנב 7.5 מיקרוגרם אני ב200 μl PBS להוספת 24 גם צלחת התרבות (גודל נקבובית 8 מיקרומטר). בואו O דגירה צלחת / N, ולאחר מכן להסיר בזהירות את PBS עם pipet מייד לפני ציפוי תרבות organotypic HPMC / נוף על מוסיף מצופה קולגן (שלב 2, לעיל).
2. הכן את תאי סרטן השחלות כמו בשלב 3.1. לצלחת תאי סרטן השחלות על תרבויות organotypic במוסיף, להשתמש בזהירות pipet כדי להסיר תקשורת עודפת מהחלק העליון של מוסיף. להוסיף את ההשעיה תא סרטן השחלות 100 μl בסרום ללא מדיה לכל אחד.
3. להוסיף 750 μl של תקשורת צמיחה מלאה להרבה מתחת להוספה לגרום לתאי סרטן בvasion לתרבויות organotypic. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ בסביבת humidified למשך 24 שעות.
   הערה: תאי סרטן השחלות שלפלוש תרבות organotypic תחצה את הכנס ותישאר בצד התחתון של הכנס.
4. לאחר 24 שעות, לתפוס את התוסף עם קרציות ובקצרה לשטוף אותו בכוס של PBS, ולאחר מכן להעביר את הכנס ולריק. לשפשף את החלק העליון של כל הכנס עם שני הצדדים של מקלון צמר גפן בסך של 1 דקות. במהירות להכניס את התוסף לצלחת המכילה 750 paraformaldehyde μl 4% בכל טוב. לאפשר לכל הוספה לשבת בparaformaldehyde למשך 10 דקות לפני העברה מוסיף לתוך בארות מלאות 750 μl PBS.
5. צפה תאים פלשו (דבקה וקבוע לתחתית מוסיף) עם מיקרוסקופ בהגדלה 2.5x. כאשר כל גם הוא בתוך שדה הראייה, להתאים את ההגדלה ל10x ולקחת 5 תמונות, אחד בסמוך למרכז ו1 בכל רבע של הבאר, הימנעותלוקח תמונות כי הם קרובים מדי לשוליים. בצע את אותו דפוס לכל אחד.
6. השתמש בתכנית של היצרן כדי לספור את מספר התאים בכל תמונה כדי לקבל מספר ממוצע של תאים פלשו לשדה בכל טוב (6 א-ג איור) על פי הפרוטוקול שלהם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תרבות organotypic הורכבה על ידי הערבוב הראשון fibroblasts האנושי ראשוני עם אני סוג קולגן ולאחר מכן כיסה את התרבות הזאת עם 5 פעמים את מספר תאי mesothelial. התרבות הייתה טופחה במשך לפחות 18 שעות לפני תאי סרטן השחלות נוספו ללמוד הידבקות, פלישה או הפצה. כל assay חזר על עצמו עם מספר (n = 3-5) תרבויו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מודל organotypic של מייקרו-סביבת הצפק הוקם על מנת להעריך את התפקוד האישי וקולקטיבי (ים) של שני המרכיבים התאיים ומולדים של מייקרו-הסביבה בהפצת סרטן השחלות. הפרוטוקולים הספציפיים עבור ציפוי והתאמה אישי של תרבות organotypic 3D לחקור הידבקות תא סרטני, ופלישת השחלות מסופקים. תאים ראש...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Isolation and culture of primary cells
PBS	Fisher Scientific	SH3001304
Single-edged razor blades	Fisher Scientific	12-640
15 cm culture dishes	BD Biosciences	353025
Glass flask	?	?
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000044_3616914956
DMEM with L-Glutamine	Corning	10-013-CV
MEM Vitamins	Corning	25-020-Cl
MEM Nonessential amino acids	Corning	25-025-CI
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
Shaker	Thermo-Fisher	MaxQ 4450
Centrifuge	Eppendorf	5702
Incubator	Thermo-Fisher	Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100
Trypsin EDTA, 1x (0.25%)	Corning	25-053-CI
Hyaluronidase	Worthington Biochemical	LS002592
T-75 Flasks	BD Biosciences	353136
T-175 Flasks	BD Biosciences	353112
Pipet tips	Rainin	P2, P10, P20, P200 and P1000
Pipet tips	Corning	Filtered tips P2, P10, P20, P200 and P1000
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
2. Plating 3D culture
Cell Counter	Invitrogen	Countess
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10313
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Collagen Type I (Rat Tail)	BD Biosciences	354236
96 well plate, clear bottom, black	BD Biosciences	353219
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
3. Adhesion assay
Multichannel pipet	Eppendorf	Xplorer 300
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
Plate reader	Molecular Devices	Minimax
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
5. Invasion assay
Cell Culture Inserts (8um, 24-well)	BD Biosciences	353097
Cotton swabs	Q-tips	cotton swabs
Microscope	Zeiss	Axiovert 200m
Cell Profiler	public domain
24 well plate	BD Biosciences	353047
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
6. Antibodies
Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609	EMD Millipore	MAB1976
Beta 1	Oncosynergy	OS2966
Alpha 5 [CD49e]	ID Pharmingen	555615
Beta 4 [CD104]	EMD Millipore	MAB 2058