תרבויות יצירה ראשיות פיברובלסטים מרקמות אוזן וזנב עכבר

Summary

אנו מתארים הליך ניסוי פשוט ומהיר ליצירת fibroblasts העיקרי מהאוזניים והזנבות של עכברים. ההליך אינו דורש הכשרה מיוחדת ובעלי חיים יכול לשמש לדור של תרבויות פיברובלסטים מאוזניים מאוחסנות על RT עד 10 ימים.

Abstract

תאים ראשוניים נגזרים ישירות מהרקמה ונחשבים לנציג נוסף של המצב הפיזיולוגי של תאים בגוף חי משורות תאים הוקמו. עם זאת, יש לי תרביות תאים ראשוניות בדרך כלל אורך חיים סופי וצריכה להיות הוקמו מחדש בתדירות גבוהה. פיברובלסטים הם מקור נגיש של תאים ראשוניים. כאן, אנו דנים בהליך ניסיוני פשוט ומהיר להקמת תרבויות פיברובלסטים עיקריות מאוזניים וזנבות של עכברים. הפרוטוקול ניתן להשתמש כדי להקים תרבויות עיקריות פיברובלסטים מאוזניים מאוחסנות על RT עד 10 ימים. כאשר הפרוטוקול ואחריו בזהירות, זיהומים צפויים להתרחש למרות השימוש ברקמות שאינן סטרילי מאוחסנות לזמן ממושך ובמקרים מסוימים. Fibroblasts להתרבות במהירות בתרבות ובניתן להרחיב למספרים משמעותיים לפני שעברנו הזדקנות replicative.

Introduction

תאים ראשוניים נגזרים מרקמת חיה ותרבותית בתנאים במבחנה. מקובל להניח כי תאים ראשוניים דומים למצב הפיזיולוגי ורקע גנטי של הרקמה שממנו הם מקורו משורות תאים הונצחו או גידול ¹ באופן הדוק יותר. מסיבה זו, תאים ראשוניים מייצגים מודל שימושי לחקר ^2,3 שאלות ביולוגי. עם זאת, בניגוד לשורות תאים קבעו כי לגדול ללא הגבלת זמן, תאים ראשוניים סופו של דבר לעבור הזדקנות בתרבות ובצריכים להיות הוקמו מחדש בתדירות גבוהה.

תאים ראשוניים נפוצים כוללים fibroblasts, תאי אפיתל, תאי אנדותל, תאי T, תאי B, מקרופאגים נגזר מח עצם (BMDM) ותאים דנדריטים נגזר מח עצם (BMDC). Fibroblasts לעתים קרובות מנוצלים כמודל תרבית תאים ראשוניים. הם מציעים יתרונות מרכזיים על פני תאים ראשוניים אחרים. תרביות תאים בקלות הוקמו, מתוחזק בקלות ולא דורשות purification של תאים לפני התרבות. יש להם תפוצה ראשונית מהירה ואין דרישה לפרוטוקולים בינוניים או הפעלה מיוחדות. Fibroblasts ניתן transfected ביעילות באמצעות ביולוגי, כימי, ופרוטוקולים פיזיים ^4,5. יש אפשרות לאחסן את האוזניים של עד 10 ימים בRT לפני הקמת תרביות תאים. תרבויות פיברובלסטים הם תורמים להדמיה של תהליכי cytoplasmic ומתאימים לתכנות מחדש לתאי גזע pluripotent המושרה (iPS) ^6.

פיברובלסטים הם תאים חשובים של רקמת החיבור שמפרישים חלבוני קולגן ומטריקס ^7. הם מספקים את המסגרת המבנית ברקמות רבות ⁸ ולשחק תפקיד חיוני בריפוי פצעים ^ו9,10 תיקון רקמות.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ומהיר (<4 שעות) להקים תרבויות פיברובלסטים מאוזניים וזנבות של עכברים ^11. הפרוטוקול מחייב עכבר מינימאליניסיון לקצור את הרקמות (בניגוד לפרוטוקולים אחרים ^12,13) ​​וניתן להשתמש בם כדי להקים תרבויות מאוזניים מאוחסנות במדיום ב RT לעד 10 ימים.

Protocol

עכברים שוכנו בתנאי הפתוגן ללא בעמידה בהנחיות המוסדית עד מתת חסד (המוסדי הטיפול בבעלי חיים והנחיות ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטה הלאומית של סינגפור והוועדה הלאומית המייעצת למחקר בבעלי חיים מעבדה (NACLAR) הנחיות).

1. עכברים

1. להזמין עכבר אחד הרקע הגנטי המתאים. פרוטוקול זה מבוסס על רקמה נובעת מC57BL אחד / 6 עכבר.

2. הכנת בינונית מלא

1. הכן בינוני מלא על ידי הוספת הרכיבים לרוזוול פרק זיכרון המכון (RPMI) מדיום 1640 הבאים: 10% בסרום עגל עוברי (FCS), 50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, 100 מיקרומטר asparagine, גלוטמין 2 מ"מ, 1% פתרון פניצילין, סטרפטומיצין.

3. הכנת פתרונות אנזים

1. הכן פתרון collagenase D בצינור תחתון חרוטי 15 מיליליטר.
   1. שוקל 10 מ"ג של collagenase ד דיD ssolve collagenase ב 4 מיליליטר בינוני שלם.
2. הכן פתרון pronase בצינור 1.7 מיליליטר microcentrifuge.
   1. לשקול 10 מ"ג של pronase.
   2. הוסף 5 μl של 1 חיץ M טריס (pH 8.0). הוסף 1 μl של 0.5 M EDTA (pH 8.0).
   3. ראש עם 494 μl של מים סטריליים.
   4. דגירה פתרון pronase על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 30 דקות.

4. הכנת Collagenase D-pronase מיקס (≤2 זנבות)

הערה: בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע תרבית תאים סטריליים.

1. הוסף 250 μl של פתרון pronase 4 מיליליטר של תמיסת collagenase D.
2. להעביר את תערובת D-pronase collagenase דרך פילטר מזרק 0.2 מיקרומטר לתוך צינור תחתון סטרילי 15 מיליליטר חרוטי.

5. הפקת פיברובלסטים מרקמות אוזן וזנב

1. להרדים עכברים על פי ההנחיות מוסדיות המתאימות.
2. מקום מכשירים (מספריים ומלקחיים) autoclaved כירורגית בשכונה תרבית תאים.
3. להוסיף 10 מיליליטר בינוני שלם לשתי מנות תרבות תא 10 סנטימטרים כל אחת.
4. חותך את האוזניים (~ רדיוס 1 סנטימטר) ו -5 סנטימטרים של זנב (מקצה הזנב) של עכבר עם מספריים ודגירה של 5 דקות ב 40 מיליליטר אתנול 70% בצינור תחתון סטרילי 50 מיליליטר חרוטי.
5. אוזני אוויר יבשות וזנב על ידי הצבת אותם בצלחת תרבית תאי 10 סנטימטרים פתוחות בשכונה במשך 5 דקות. ברגע שהתייבש, אוזן העברה וחתיכות זנב לשתי מנות התרבות שכותרתו "אוזניים" ו- "זנב" המכיל 10 מיליליטר בינוני שלם כמתואר בשלב 5.3.
6. הסרת שיער מהאוזניים וזנב המספריים באמצעות.
7. חותך את האוזניים וזנב לחתיכות קטנות יותר מ 3 מ"מ בגודל באמצעות מספריים.
8. העבר את הרקמות לחתוך לתוך 1.8 מיליליטר בקבוקוני cryotube שכותרתו "אוזניים" ו- "זנב" ולהוסיף פתרון D-pronase collagenase מספיק לנפח להגיע הסימן 1.8 מיליליטר בבקבוקון.
9. Pתחרה בקבוקוני cryotube אופקית על שייקר ולנער את הדגימות ב 200 סל"ד 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
10. לאחר 90 דקות דגירה, להסיר את בקבוקוני cryotube מייקר ומניח את צלוחיות במכסת המנוע.
11. להוסיף 10 מיליליטר בינוני שלם לשתי מנות תרבות תא 10 סנטימטר, "אוזניים" שכותרתו ו" זנב "כל אחד, ולשים את מסננת 70 מיקרומטר תא בכל מנה.
12. מניחים את רקמות אוזן וזנב מתעכלים במסננת 70 מיקרומטר התא במנות מסומנות בהתאם מוכנות בשלב 5.11 וכוח לטחון את הרקמות באמצעות בוכנת מזרק 10 מ"ל ל> 5 דקות. לנער את מסננת התא מדי פעם במדיום לשטוף תאים מתוך מסננת התא.
13. פיפטה ההשעיה תא מכל מאכל לתוך צינורות תחתון שני 15 מיליליטר חרוטי שכותרתו "אוזניים" ו- "זנב". לשטוף את הצלחת ומסננת עם מדיום מלא נוסף 10 מ"ל ולהוסיף הבינוני לצינורות תחתון חרוטי 15 מיליליטר המתאים.
14. ספין למטה התאהשעיה למשך 7 דקות ב~ 580 XG ו -4 מעלות צלזיוס באמצעות צנטריפוגות תא קירור.
15. הסר supernatant, להוסיף 10 מיליליטר בינוני שלמה לתא גלולה בשפופרת 15 מיליליטר חרוטי תחתון וresuspend התאים.
16. חזור על שלב 5.14 ו5.15.

6. Culturing של תערובת תאים

1. הסר supernatant. ודא שהתא גלולה נשאר באין מפריע.
2. להשעות מחדש תאים ב 10 מיליליטר בינוני שלם ולהוסיף את התערובת המתאימה לשתי מנות תרבות תא 10 סנטימטרים שכותרתו "אוזניים" ו- "זנב".
3. הוסף 10 amphotericin B פתרון μl (פתרון מניות: 250 מיקרוגרם / מיליליטר) לתרבות.
4. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס ב5% CO ₂ באינקובטור humidified.
5. ביום השלישי, להחליף בינוני עם בינוני 10 מיליליטר טרי שלם המכיל 10 μl של amphotericin B כדי להסיר שאריות (איורים 1 ו -2).

7. תת-תרבות של פיברובלסטים

1. Wheתרבות n מגיעה סביב 70% confluency (יום 3-4 של תרבות) להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם מי מלח 5 מיליליטר סטרילי פוספט 1x שנאגרו (PBS).
2. הסר PBS ולהוסיף פתרון טריפסין-EDTA 1x סטרילי 2 מיליליטר לתאים.
3. דגירה התאים למשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO ₂ באינקובטור humidified.
4. לאחר 5 דקות, לטפוח בעדינות את המנה התרבות ולהוסיף 6 מיליליטר בינוני שלמה לתאים.
5. מעבירים את ההשעיה תא צינור תחתון 15 מיליליטר חרוטי ולסובב את הצינור במשך 5 דקות ב~ 450 XG ו -4 מעלות צלזיוס באמצעות צנטריפוגות תא קירור.
6. הסר supernatant, ובעדינות מחדש להשעות את התא גלולה ב 5 מיליליטר בינוני שלם.
7. זרע 2 x 10 ⁵ תאים בצלחת תרבית תאי 10 סנטימטרים ודגירת התאים על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO ₂ באינקובטור humidified במשך 3-4 ימים לפני חזרה על שלבי 7.1-7.6.

8. הכנת אוזניים למשלוח

הערה: בצע tהוא השלבים הבאים במכסת מנוע תרבית תאים סטריליים.

1. להרדים עכברים על פי ההנחיות מוסדיות המתאימות.
2. הנח מספריים ומלקחי autoclaved למכסה מנוע תרבית תאים.
3. הוסף 50 מיליליטר בינוני שלם לתוך צינור תחתון חרוטי 50 מיליליטר.
4. חותך את האוזניים (~ רדיוס 1 סנטימטר) של עכבר עם מספריים.
5. העבר את האוזניים לתוך הצינור התחתון חרוטי 50 מיליליטר (כפי שהוכן בשלב 3) מלקחיים באמצעות.
6. לאטום את הצינור תחתון 50 מיליליטר חרוטי עם parafilm לפני המשלוח ב RT בתיבה מתאימה.

תוצאות

הפקה של fibroblasts מתוצאות רקמה בכמות משמעותית של רקמת פסולת (איור 1). בניגוד לפסולת רקמות, fibroblasts לדבוק משטחי פלסטיק בתרבית רקמה בין יום 1 ו -3 של התרבות. הבינוני של תרבויות פיברובלסטים ניתן לשנות בבטחה ביום 3 של תרבות, שאמור להקטין באופן משמעותי את הרמות של הווה פסו...

Discussion

כאן אנו מספקים הליך ניסוי פשוט, זול ומהיר להקמת תרבויות פיברובלסטים עיקריות מאוזניים וזנבות של עכברים. החילוץ צריך לגרום fibroblasts החלוקה חסיד ומהירות תוך 3 ימים לאחר בידוד של הרקמה. מגבלה חשובה של תאים ראשוניים היא הזדקנות, מעצר צמיחה קבוע ^15. שימוש בפרוטוקול, ניתן ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Fetal Calf Serum	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010
Ethanol	Merck Millipore	107017	Absolute for analysis
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088866001	From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease	Merck Millipore	53702	From Streptomyces griseus
Tris buffer (pH 8)	1st BASE	1415	Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)	1st BASE	BUF-1053	Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	1st BASE	BUF-2040-10X4L	Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μM syringe filter	Sartorius Stedim	16534
70 μM cell strainer	SPL	93070
Syringe plunger	Terumo	SS+10L
Cryovial tube	NUNC	368362
1.7 ml microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 cm cell culture dish	Greiner	664160	Cell culture treated dish
15 ml conical bottom tube	Greiner	188271
50 ml conical bottom tube	Greiner	227261
Water bath	GFL	1002
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Incubation shaker	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope	Carl Zeiss AG