JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Abstract

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

Introduction

Exponentially improving imaging techniques allow following developmental processes over time periods of up to about four consecutive days3. In zebrafish and many other animal model systems, specific cells, tissues, axonal or vascular structures are marked by transgenic green or sometimes red or yellow fluorescent proteins to facilitate visualization. However, in most transgenic lines the transgene is not specifically expressed in the cells of interest but also additional structures, which hinders the precise tracking of for instance single cells or groups of cells.

Fluorescent photoconvertible proteins are well suited for cell tracking during embryonic development. The prerequisites for the application of such proteins are a long-lived nature, a well-separated emission range upon conversion and bright fluorescence. Available photoconvertible proteins comprise those that change their emission range upon conversion such as Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 or Dendra27 and others which are only fluorescent when photoactivated (PAmCherry8, PAGFP9 or PATagRFP10). Their applications to track cells in existing FP-transgenic animals are however limited as they often involve a green fluorescent state or do not fulfill all of the above criteria. Only recently, Subach and colleagues reported the PSmOrange protein, which changes its emission from orange/red to far red upon photoconversion and was successfully applied in cells in culture and cultured cells injected into mice2.

To investigate the protein's suitability for cell tracking in a living embryo, we generated an expression construct for the microinjection of nuclear-tagged H2B-PSmOrange into zebrafish embryos. We find that the protein fulfills all prerequisites for successful cell tracking in GFP transgenic backgrounds during the first 4 (and possibly more) days of zebrafish embryonic development. During this time, most of the cell migratory events are completed in fish making the PSmOrange system an excellent addition to the zebrafish toolkit.

Protocol

1. תמלול mRNA H2B-PSmOrange במבחנה טיהור mRNA

  1. Linearize את PSmOrange H2B המכיל pCS2 + פלסמיד באמצעות אנזים הגבלה NotI פי הוראות היצרן.
    הערה: בצע את השלבים הבאים באמצעות הגנות מתאימות כגון כפפות וחלוק מעבדה על מנת למנוע זיהום והשפלה mRNA.
  2. לטהר את ה- DNA לינארית באמצעות שיטות המבוססות ערכת טיהור PCR או פנול, כלורופורם על פי פרוטוקולים של היצרנים.
  3. השתמש 1 מיקרוגרם של תבנית ה- DNA לינארית עבור שעתוק SP6-mRNA על פי הוראות היצרן.
  4. הסר DNA על ידי הוספת 1.0 U RNase חינם DNaseI במשך 10-20 דק 'ב 37 ° C.
  5. לנקות את ה- mRNA באמצעות RNA לנקות ערכה על פי פרוטוקול של היצרן.
  6. כדי להגדיל טוהר mRNA וריכוז, לזרז את mRNA על ידי הוספת 6 נתרן אצטט μl (3.0 M, pH 5.2) ו 150 μl 96% אתנול. דגירה מפתרון ixed ב -20 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות עד 24 שעות.
  7. אסוף את ה- mRNA על ידי ספינינג הפתרון ב 18.407 XG במשך 45 דקות ב 4 ° C. מחק את הנוזל ו resuspend mRNA ב 150 μl 70% אתנול. מערבבים צנטריפוגות הפתרון עבור 15 דקות נוספות ב 4 ° C. מחק את הנוזל, לייבש את הגלולה במשך 5 דקות על קרח ו resuspend mRNA ב 20 מים חינם μl ultrapure RNase.
  8. להעריך את ריכוז והטוהר של mRNA על ידי מדידה photometric של דילול 1: mRNA 100 (mRNA 1 μl ב 99 μl מים חינם ultrapure RNase).
  9. עבור אחסון לטווח קצר, לשמור על פתרון mRNA ב -20 ° C. עבור אחסון לטווח ארוך, לשמור על mRNA ב -80 מעלות צלזיוס.

2. H2B-PSmOrange mRNA Microinjection לעוברי דג הזברה

  1. הגדרת ההזדווגות זוגות בלילה לפני הזריקה באמצעות TG (foxD3: GFP); TG (FLH: GFP) דג מהונדס כפול (או כל דג מהונדס GFP אחר). השאירו את הדגים מופרדים על ידי הצבת spacerביניהם כדי לקבוע את הזמן של הזדווגות.
  2. הסר את spacer בבוקר ההזרקה ולתת זוג דגים למשך 20 דקות.
  3. במהלך ההזדווגות זמן, לדלל את ה- mRNA H2B-PSmOrange לריכוז סופי של 130 pg / NL (במים חינם RNase) פתרון הזרקת μl העברת 6 לתוך נימי microinjection באמצעות קצה microloader. בדוק את עוצמת זריקה עם שקופית זכוכית מכוילת. התאם את לחץ ההזרקה להזריק 2 פתרון mRNA NL (260 pg).
  4. אסוף את הביצים לתוך צלחת פטרי פלסטיק מעוקר המכילים עובר 1x בינוני (E3).
  5. עבר 20 עד 30 עובר למנת הזרקה בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק.
  6. להזריק 2 mRNA NL המכיל פתרון לתוך התא או סתם מתחת לתא בחלמון בשלב אחד התא 11.
  7. העברת עוברים מוזרק לתוך צלחת פטרי שמכילה בינוני 1x E3, להסיר בדרך כלל מופרית או לא עוברים לפתח ולגדל אותם על 28 מעלות צלזיוס.
    הערה: o הגנת אורf עובר אינו נדרש לאורך הניסוי.
  8. תרים עוברי דג הזברה במדיום 1x E3 ולהוסיף 0.2 מ"מ PTU (1-פניל-2 thiourea) לאחר gastrulation לעכב פיגמנטציה. שינוי המדיום פעמים ביום כדי למזער את הסכנה של זיהומים חיידקיים.

3. עובר והטבעה

  1. בחר את ה- GFP (ירוק) ו PSmOrange (כתום / אדום) עובר להביע שיתוף באמצעות מיקרוסקופ משקפת מצוידת מנורת קרינה ומסנני פליטה מתאימות. מעביר את העוברים החיוביים לתוך פטרי צלחת סטרילי המכילה בינוני 1x E3.
  2. עוברים dechorionate תחת סטראו באמצעות מלקחיים 12.
  3. העברת עובר אחד בתוך שפופרת 1.5 מ"ל המכיל 1.0 מ"ל של מחומם מראש agarose התכה נמוכה 1.0% (אה"ע) שהוכנו מים ultrapure באמצעות פיפטה לחתוך קצה (P200). הערה: מומלץ לחמם את אה"ע 80 ° C ו להתקרר במשך 3-5 דקות ב RT לפני הטבעה העובר.
  4. מעבירים את העובר ב -150 אה"ע μl לתוךתאיים coverglass ולהתאים את האוריינטציה של העובר, בצד הגבי למשל למטה בניסוי שתואר על A1R מיקרוסקופ סורק לייזר confocal הפוכה + (או כל מיקרוסקופ מתאימה אחרת), באמצעות קצה פלסטיק משובח. כאשר אה"ע הוא polymerized, למלא את התא במים דגים המכיל 0.2 מ"מ PTU ו 0.02% אתיל 3-aminobenzoate methansulfonate (Tricaine) עבור הרדמה.
  5. לפני הדמיה המדגם, לחכות 15 דקות כדי לקבוע במדויק את השפעת Tricaine. ההרדמה מונעת תנועות עוברות, אשר ניתן לנטר באמצעות סטראו מצויד תאורת brightfield.
    הערה: התאים ניתן לעשות שימוש חוזר פעמים.

4. PSmOrange photoconversion

  1. מניחים את המדגם תחת מיקרוסקופ confocal ולסרוק את הדגימה כדי לזהות את האזור photoconvert באמצעות 488 ננומטר ו 561 nm לייזרים הדמיה GFP ו PSmOrange בהתאמה.
    הערה: השתמש A1R מיקרוסקופ סורק לייזר confocal הפוכה + על sta הפוכהge TiEcontrolled ידי תוכנת הדמיה מיקרוסקופ ומצוידים 488 ננומטר, 561 ננומטר ו 640 nm לייזרים עבור photoconversion והדמיה. עם זאת, היישום הוא בהחלט לא מוגבל מיקרוסקופ זה כל עוד קווי לייזר לגיור הדמיה זמינים.
    1. שים את המטרה אוויר 20X למקומו (NA: 0.75; WD: 1.0 מ"מ; FOV: 0.64 x 0.64 מ"מ).
    2. השתמש בהגדרות מיקרוסקופ הבא כדי לזהות את החלבון PSmOrange לפני photoconversion: 561 ננומטר לייזר, 0.74 mW הנמדדים המטוס מוקד מעל המטרה.
      הערה: זה מקביל ל -40% במערכת זו (מדידה במישור המוקד הוא הדרך היחידה לקבוע את כוח יעיל). התאם את עוצמת הלייזר בהתאם לצרכים ניסיוניים כמו יעילות של זריקות H2B-PSmOrange יכול להשתנות.
    3. להוסיף גורמי זום כדי להדגיש את תחומי העניין. בהגדלות גדולות להפחית את זמן רכישת תמונה ולכן phototoxicity.
  2. לרכוש Z- מחסנית כיסוי המבנההים של עניין באמצעות 488 ננומטר ו 561 nm לייזרים במצב רציף (מצב קו 1-> 4). תקן ה- z צעד בין 1.0 ו -2.0 מיקרומטר. ממוצע קו ותדיר סריקה ניתן להשתמש כדי לייעל את איכות תמונה.
  3. סרוק את המדגם לבחור את האזור של כלי עניין (ROI) כדי להדגיש את האזור photoconvert. תקן את ההחזר על ההשקעה כאזור גירוי. בחר את מודול הפעלת תמונה / הלבנה, להפעיל את הלייזר 488 ננומטר על ידי סימון התיבה המתאימה ולהגדיר את לייזר 488 ננומטר עד 80% (כוח לייזר 1 mW הנמדדים המטרה). הגדר את מהירות הסריקה ל -0.5 שניות / מסגרת.
  4. פתח את כלי העזר photoconversion (ND גירוי) וציין את ההגדרות photoconversion.
    1. הקש על הפקודה "הוסף" כדי לציין את פרוטוקול photoconversion.
    2. גדר "שלב" 1 בתפריט "רכישה / הגירוי" ל "הרכישה" ומציין את מספר התמונות להירכש לפני photoconversion בתפריט "הלולאות".
    3. גדר "שלב" 2 עד "Stimulation "והזן את מספר אירועי גירוי להתבצע.
    4. התאם "שלב" 3 כמתואר עבור "שלב" 1. לחלופין, כנס המתנה "שלב" אחרי "שלב" 2 על ידי הזנת הזמן לחכות לפני הסיבוב האחרון של רכישת תמונה.
    5. לאחר כל הפרמטרים נקבעים, להחיל את ההגדרה גירוי ולהפעיל את photoconversion.
      הערה: כוח לייזר, תדירות סריקה ומספר חזרות עבור כל סיבוב של photoconversion יכול להשתנות נבדלים העובר העובר. הגדרה להתחיל עם מוצג בטבלה 1.
  5. לרכוש Z- מחסנית הסופי באמצעות 488 ננומטר, 561 ננומטר ו 640 nm לייזרים החלת הגדרות כנ"ל. הגדר את לייזר 640 ננומטר כדי להמחיש את PSmOrange המרה באמצעות כוח לייזר גבוהה (עד 4.5 mW).

5. העובר לרדת מעל אה"ע

  1. הסר את העובר המכיל קאמרית מן מיקרוסקופ. מוציאים בזהירות את העובר מן u agaroseלשיר מלקחיים.
  2. מעבירים את העובר לתוך צלחת פטרי-פלסטיק חדש מעוקר או לתוך צלחת 6-היטב מעוקר המכיל E3 1x ו -0.2 מ"מ PTU. דגירה העובר על 28 מעלות צלזיוס עד לשלב של פיתוח הרצוי.

6. ניתוח הגורל של תאים המבטאים חלבון photoconverted PSmOrange

  1. Re-להטביע את העובר כפי שמתואר תחת נקודות 3.3 ו -3.4.
  2. מניחים את המדגם תחת מיקרוסקופ confocal ולסרוק את הדגימה כדי לזהות תאים photoconverted (640 ננומטר) במבנה מהונדס GFP עניין (488 ננומטר).
  3. לרכוש Z- מחסנית מכסה את המבנים של העניין באמצעות 488 ננומטר, 561 ננומטר ו 640 nm לייזרים במצב רציף (מצב קו 1-> 4). תקן ה- z צעד בין 1.0 ו -2.0 מיקרומטר. ממוצע קו ותדיר סריקה ניתן להשתמש כדי לייעל את איכות תמונה.
  4. השתמש באחת מהשיטות הבאות כדי לזהות תאים, אשר GFP שיתוף מפורש ואת חלבון photoconverted.
    1. מותאם ללקוח תמונת פיג'י אוטומטית3 J מאקרו
      1. שזירת ערימת מסמכי המקור באמצעות תוסף "GaussianBlur" (→ תהליך → מסנן → GaussianBlur) ולחסר את הערימות החלקות מהמקור באמצעות תוסף "מחשבון תמונה" (Image מחשבון → תהליך →). את הצעד הזה כדי לחזות מבנים של עניין ולהפחית את הזמן חישובית לניתוח.
      2. החל סף ספציפי הערוצים הירוקים ומרחיקים בצבע האדום על מנת להדגיש את תאי photoconverted (→ תמונה → התאם → סף). השתמש באפשרות "לנתח חלקיקים" כדי לזהות את תחומי סף עם הגדרה מתאימה (→ לנתח → לנתח חלקיקים).
      3. פתח את תוסף "מחשבון תמונה" ולהציג את ROIs חופף בערוץ ירוק ומרחיקות האדומים בצהוב (→ מחשבון תמונת → תהליך).
    2. תוכנת הדמיה מיקרוסקופ להערכת נתוני 3D
      1. הצג את המחסנית3D באמצעות אפשרות הצגת נפח הצגה (→ צפה נפח צג → תפריט ויזואליזציה 3D). השתמש בממשק הגרפי כדי לבחור את הערוצים הירוקים, אדום ומרחיקות האדומים, להתאים את הבהירות הניגודיות לחתוך את מחסנית 3D כדי להדגיש את אזור photoconverted (איור 1).
        הערה: שיטות דומות כדי לנתח את הנתונים זמינים ברוב התוכנות הנפוצות לניתוח תמונה.

תוצאות

איור 1 מדגים דוגמה של מערכת photoconversion PSmOrange. מתחם האצטרובל הוא מבנה משומר ב diencephalon הגבה חוליות. כמו חוליות רבות אחרות, מורכבים זה מורכב של איבר האצטרובל במרכז של diencephalon ותאי parapineal צדדי-השמאל. ניסויים משחררים רפרוף אלגנטיים אבל גוזל זמן הראו כי...

Discussion

עובר מהונדסים נושאת כתבי ניאון סייע ביסודו להבין התפתחות עוברית. עם זאת, יש עדיין הצורך החיוני עבור יזמים כדי להקל על ויזואליזציה הספציפי של מבנים בפרט. בהיעדרם, החוקרים מסתמכים על טכניקות כגון photoconversion של חלבוני ניאון כדי לברר על מוצאם והתפתחותם של מבנה האינטרס שלהם...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank O. Subach for providing the original H2B-PSmOrange plasmid and our fish facility team for fish care. We are grateful to the Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg for access to microscopy equipment and analysis software. We acknowledge the support of the Core Facility Live Cell Imaging Mannheim at the CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). This work was supported by the Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Spatio-temporal coordination of signaling processes (EcTop 2), University of Heidelberg to C.A.B. and the Medical Faculty Mannheim of the University Heidelberg and the DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 and 298/6-1) to M.C.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PCR Purification KitQiagen28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kitAmbionAM1340
RNeasy MiniElute Cleanup kitQiagen74204
Plastic Pasteuralpha laboratoriesLW4000
Original H2B-PSmOrange PlasmidAddgene31920The plasmid described in the paper is available in the Carl lab
FemtoJet MicroinjectorEppendorf5247 000.013
Forceps (5 Inox)NeoLab2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System Nunc155382
Nikon A1R+Nikon GmbH GermanyNo Number
Nikon PLAN Apo λ 20X air objective Nikon GmbH GermanyNo Number
NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)Nikon GmbH Germany/Laboratory ImagingNo Number

References

  1. Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
  2. Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods. 8, 771-777 (2011).
  3. Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function. Neural Development. 8, 19 (2013).
  4. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).
  5. Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944 (2008).
  6. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6, 131-133 (2009).
  7. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
  8. Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6, 153-159 (2009).
  9. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
  10. Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).
  11. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
  12. Concha, M. L., et al. Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality. Neuron. 39, 423-438 (2003).
  13. Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish. Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).
  14. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24, 142-153 (2014).
  15. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

108photoconversionPSmOrangeCLSMIn vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved