Bioprinting Cellularized בונה בעזרת רקמות ספציפיות הידרוג'ל Bioink

Summary

אנו מתארים קבוצה של פרוטוקולים שמאפשרים bioink הידרוג'ל המחקים רקמות שבה פונקציונלי קיימא בונה רקמות 3-D ניתן bioprinted לשימוש ביישומי הקרנה במבחנה.

Abstract

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.

Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues.

Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Introduction

בשנים האחרונות, במגוון טכנולוגיות הפך זמין מתייחס לצורך המקורות חלופיים של איברים ורקמות תפקודיים על ידי המבקש לייצר, או biofabricate, אותם. Bioprinting התפתחה כאחד המבטיחים ביותר של טכנולוגיות אלה. Bioprinting יכול להיחשב כסוג של ייצור כתוסף רובוטית של חלקים ביולוגי, שניתן להשתמש בהם כדי לבנות או מבנים איבר דמוי או מרקמה דמוית דפוס קיימא ב 3 מימדים. ¹ ברוב המקרים, bioprinting מעסיקה 3-ממדי (3 -D) תקן ההדפסה כי היא נוהלה על ידי מחשב להפקיד תאים וחומרים ביולוגיים לעמדות מדויקות, ובכך משחזרים ארכיטקטורות פיסיולוגיות-מחק אנטומית. ² התקנים אלה להדפיס "bioink", אשר יכול ללבוש הצורה של אגרגטים תא, תאים גלומים הידרוג או ונוזלים צמיגים, או microcarriers תא זרע, כמו גם פולימרים ללא תאים המספקים מבנה מכאני או לפעול PLA תא ללאceholders. ^3,4 בעקבות תהליך bioprinting, המבנה וכתוצאה מכך ניתן התבגר לתוך מבנים רקמה או איבר פונקציונלי, ומשמש ליישום הסוף המיועד. ^5,6 עד כה, איבר אנושי בגודל תפקודי מלא לגמרי לא הודפס, אבל זה נשאר המטרה ארוכת הטווח העיקרית של bioprinting מחקר ופיתוח. ² עם זאת, בקנה מידה קטן "organoid" בונה רקמות מיושמים כיום מספר יישומים, כולל מודלים פתולוגיה, פיתוח תרופות, והקרנת טוקסיקולוגיה.

אחד המכשולים העיקריים כי חוקרים נתקלו ביישום טכנולוגית bioprinting הוא כי חומרים מעטים פותחו לצורך bioprinting המפורש. כדי להצליח ביעילות bioprinting, ביולוגי חייבים לעמוד 4 דרישות בסיסיות. ביולוגי צריך להיות 1) תכונות מכניות שראוי לאפשר בתצהיר (אם זה שחול דרך נחיר כג'ל או אניnkjet כמו טיפה), 2) את היכולת להחזיק את צורתו כמרכיב של מבנה 3-D לאחר בתצהיר, 3) את היכולת למשתמש שליטה של ​​2 המאפיינים המוקדמים, ו 4) סביבה ידידותית ותומכת תא בכלל שלבי הליך bioprinting. ⁷ הסטוריים, bioprinting עבודה ניסו לעתים קרובות להעסיק biomaterials המסורתי קיים במכשירי bioprinting ללא תמורה עבור התאימות שלהם, במקום בעיצוב ביולוגי יש את המאפיינים דרושים bioprinting ויישומים שלאחר ההדפסה הבאות.

מגוון bioinks פותח לאחרונה ממשק טוב יותר עם החומרה בתצהיר ייצור. מערכות הידרוג'ל תקן מציבות בעיות משמעותיות משום שהם קיימים בדרך כלל כמו גם מבשרים פתרונות נוזלים עם תכונות מכאניות מספיק, או הידרוג'ל polymerized שאם מודפס יכול לסתום פיות או להיות שבור על תהליך שהחול. הצוות שלנו, כמו גם וטיהורrs, בחן ניסוחים הידרוג'ל שונים כדי לטפל בבעיות bioprinting אלה, כולל הדפסת אליפטית תא לתוך מצעים הידרוג'ל, ^5,8 תא נימת הידרוג'ל שחל משפופרות microcapillary, ^9-11 חומצה היאלורונית extrudable (HA) הידרוג ננו-חלקיקי -gold עם תכונות crosslinking דינמיות , ¹² שליטה זמנית של קשיחות הידרוג'ל באמצעות photopolymerizable methacrylated HA ו ג'לטין, ¹³ crosslinking פיברינוגן מבוסס-תרומבין, ^14,15 ג'ל אלגינט-קולגן חליפין יוניים, ¹⁶ ואור אולטרה הסגול polymerizing המהירה לאחרונה (UV) crosslinking -initiated, ¹⁷

דוגמאות אלה להוכיח את ההיתכנות של חומרים ליצירה שיכולה ידי bioprinted ביעילות. עם זאת, בנוסף לאינטגרציה עם חומרה, כדי ליצור קיימא ופונקציונלי 3-D רקמה בונה בהצלחה, בביו-חומרים חייבים לכלול רמזי ביוכימיים מכנים מסייעות בשמירה הסלולרכדאיות ותפקוד. גורמים נוספים אלה, פרופילי ביוכימיות מכאניים, יכולים להיות השפעה משמעותית על התפקוד המוצלח של מבני רקמות bioprinted.

שני התאים ואת תאי מטריקס הילידים (ECM) אחראי הצגת מגוון רחב של מולקולות איתות כגון גורמי גדילה וציטוקינים אחרים לתאים אחרים. השילוב של אותות אלה משתנה בין רקמה לרקמה, אבל יכול להיות מאוד חזק ובעל השפעה בויסות התנהגות תאים ורקמות. ¹⁸ העסקת רכיבי ECM ספציפי רקמות מאיברים שונים ויישום בתור הידרוג'ל או כחלק הידרוג'ל נחקר עם הצלחה. ^19-21 גישה זו, אשר מורכבת decellularizing רקמה נתון, מפוררת את זה, ואת פירוקה, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר אותות ביוכימיים רקמות ספציפיות מכל רקמות ניתן לשלב בונה הידרוג'ל 3-D. ²²

בנוסף,שהיא מתועדת בהרחבה כי ורקמות בגוף לכבוש מגוון רחב של stiffnesses. ²³ ככזה, את היכולת לכוון את התכונות המכאניות של חומרים ביולוגיים, כגון E מודולוס אלסטיות 'או ז מודולוס אלסטיות גזירה', הוא כלי שימושי בהנדסת רקמות . כפי שתואר לעיל, שליטה על תכונות מכאניות bioink מאפשרת biofabrication שחול מבוסס באמצעות ג'ל רך, אז מה שיכול להשפיע עוד יותר על ידי crosslinking המשנית בשלב מאוחר יותר, שבו רמות מודולוס אלסטיות ניתן להשיג שתואמות מן סוג איבר המטרה. לדוגמא, חומרים ביולוגיים יכולים להיות מותאמים אישית כדי להתאים נוקשות של 5-10 kPa כמו כבד ילידים, ²³ או להתאים נוקשות של 10-15 kPa כמו ברקמת לב ילידים, ^24,25 בתאורית הגדלת היכולת של organoids אלה לתפקד באופן דומה עמיתיהם רקמות מולדתם. ההשפעה של קשיחות הסביבה על פנוטיפ התא כבר explored בשנים האחרונות, במיוחד ביחס לתאי גזע. אנגלר et al. מפגין גמישות המצע כי סייעה נהיגה בתאי גזע mesenchymal (MSC) כלפי שושלות עם גמישות רקמת ההתאמה של המצע. ²⁵ רעיון זה נחקר נוסף לבידול לתוך שריר, תפקוד לב, פנוטיפ הכבד, התפשטות תאי גזע hematopoietic , ותחזוקה של פוטנציאל הטיפולי של תאי גזע. ^24,26-29 יכולת לכוון הידרוג'ל כדי moduli אלסטי השונה היא תכונה חשובה של ביולוגי אשר ישמש כדי biofabricate בונה רקמות. ³⁰

כאן אנו מתארים פרוטוקול מייצג גישה תכליתית המשמשת במעבדה שלנו לגבש מערכת הידרוג'ל שניתן שחול bioprinted, והוא מותאם אישית כדי 1) מכיל את הפרופיל הביוכימי של סוג רקמה מסוים ו -2) לחקות את מודולוס האלסטיות מסוג זה רקמה . על ידי טיפול בדרישות אלה, אנו שואפים provide חומר שיכול לשחזר את מאפייני physiochemical וביולוגיים של in vivo רקמה. ³¹ המערכת מרוכבי הידרוג'ל מודולרית המתוארת כאן מנצלת בגישה רבה-crosslinking להניב bioinks extrudable, ומאפשרת crosslinking משני לייצב ומגבירה את הנוקשות של מוצרי קצה להתאים מגוון של סוגי רקמות. התאמה אישית ביוכימיים מתקיימת באמצעות רכיבי ECM רקמות ספציפיות. כמו הפגנה, אנו מעסיקים מגוון כבד ספציפית של מערכת הידרוג'ל זה bioprint בונה organoid כבד פונקציונלי. הפרוטוקול המתואר משתמש במכשיר bioprinting מותאם אישית 3-D. באופן כללי, פרוטוקול זה ניתן להתאים רוב המדפסות מבוססות שחול, פרמטרי הדפסה ספציפיים להשתנות באופן דראמטי עבור כל סוג של מכשיר ודורשים בדיקה על ידי המשתמש.

Protocol

1. פורמולציות Bioink הידרוג'ל והכנה

1. על מנת לספק פרופילים ביוכימיות רקמות ספציפיות, להכין רקמות ספציפיות ECM לעכל פתרונות כפי שתוארו לעיל עבור כבד. ²⁰
   הערה: באופן כללי, זה ECM לעכל יהוו 40% מנפח bioink הידרוג'ל הסופי כי הוא מועסק. כמה מאות מיליליטרים של פתרון ECM לעכל יכול להיות מוכן, aliquoted, קפוא ב -80 ° C לשימוש עתידי.
2. לפני הידרוג'ל ניסוח, להמיס photoinitiator, 2-הידרוקסי-4 '- (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiophenone, במים ברמה של 0.1% w / v.
   הערה: כרכים בטווח 50-100 מ"ל ניתן להכין מראש ולאחסן מוגן מפני אור על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.
3. כדי ליצור bioinks הידרוג'ל, ראשון לפרק את מרכיבי חומר בסיס מן החומצה ההיאלורונית הערכות הידרוג'ל (HA) בפתרון המים photoinitiator.
   1. ממיסים את הג'לטין HA ו thiolated thiolated בנפרד במים-pפתרון hotoinitiator (שלב 1.2) לעשות 2% w / פתרונות v.
   2. ממיסים diacrylate פוליאתילן גליקול (PEGDA), את crosslinker ב ערכות הידרוג'ל, בתמיסה במים photoinitiator (שלב 1.2) כדי להפוך פתרון 8% w / v.
   3. ממסי פוליאתילן גליקול (PEG) אלקין 8-Arm (10 kDa MW) בתמיסת מי photoinitiator (שלב 1.2) כדי להפוך פתרון 8% w / v.
4. באופן כללי, ליצור הידרוג באמצעות הסכימה הבאה, אם כי התאמה אישית נוספת אפשרית.
   1. שלב 4 חלקים 2% thiolated HA, 4 חלקים ג'לטין 2% thiolated, 1 חלק crosslinker 1, 1 חלק crosslinker 2 עם פתרון ECM 8 חלקים רקמות התקשורת והתרבות 2 חלקים hepatocyte (HCM) (או 10 חלקים מים כמו-רקמות שאינן גנריות הידרוג'ל -specific).
      הערה: נוסף ללא שינוי HA או ג'לטין ניתן להוסיף כדי להפוך את extrude bioink בצורה חלקה יותר. זה מתואר להלן.
5. וורטקס את התערובת וכתוצאה מכך על גבוהה (מהירות 10 מתוך 10) במשך 10 שניות כדי לערבב לפני השימוש.
6. השימוש הידרוג'ל bioink
   1. עבור שחול או בדיקות bioprinting, להעביר את התערובת לתוך מחסנית מזרק או מדפסת ולאפשר לו crosslink ספונטני למשך 30 דקות (crosslinking שלב 1) על 37 מעלות צלזיוס.
   2. עבור מדידות rheological, להעביר את התערובת לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ ולאפשר לו crosslink למשך 30 דקות.
      הערה: התערובת מייד מתחילה crosslink דרך היווצרות קשר תיאול-acrylate תתחיל להגדיל צמיגות. התערובת צריכה להיות מועברת מזרק, מחסנית הדפסה, או מיקום היעד בתוך 10 דקות כדי למנוע סתימת פיפטה או מזרק במהלך העברה.
   3. כאשר crosslinking המשנית (שלב 2) היא רצויה, מקרין את הבמה 1-crosslinked הג'לי עם אור אולטרה סגול (365 ננומטר, 18 W / ² סנטימטר) ליזום תגובת פילמור אלקין-תיאול.
      הערה: משך ההקרנה תלוי שטח הפנים של החומר. באופן כללי, סנטימטר מרובע של חומר רק דורש 12 שניות של חשיפה UV בהספק UV זה.

2. בדיקת תאימות מדפסת

1. לפני בדיקות אינטגרציה עם מכשירי bioprinting, מאפייני שחול מבחן על ספסל המעבדה עם בדיקות שחול פשוטות באמצעות מזרקים סטנדרטיים טיפי מחט מד קטנים (20-30 מד).
   1. דחוף את bioink באמצעות מזרק סטנדרטי להשיג חוטים מעוקמים בצורה חלקה של הידרוג'ל עם מעט או ללא בליטות. לשיחול של קווים או דפוסים פשוטים מספיק כדי לקבוע את מידת ההצלחה.
2. לשילוב bioprinter, לטעון bioink ההכנות ידי pipetting אותם לתוך דיו למדפסת, ולאפשר 30 דקות עבור bioink לעבור crosslinking שלב 1 ספונטנית בתוך המחסנית.
   הערה: נפח של bioink תלוי ביישום הספציפי צריך להיקבע על ידי המשתמש. מחסניות מדפסת עשויות להיות דומות או להיות מזרקים התואמים את מכשיר bioprinter.
3. הערכת תאימות שחולעבור bioprinting ידי הדפסת דפוס פשוט באמצעות bioink. לדוגמה, להדפיס דפוס 7 x 7 מ"מ המורכב של קווים מקבילים. החל הלחץ (למשל, 20 kPa לחץ פנאומטי) ואילו ראש ההדפסה זז במישור XY במהירות של כ 300 מ"מ / דקה.
   הערה: בקטרי זרבובית ראש הדפסה בגדלים שונים ניתן להשתמש, אך חרירי חרוטים עם פתחים בקוטר 400-500 מיקרומטר הם אופטימליים עבור הדפסת spheroids בטווח 250-350 מיקרומטר.
   1. אם החומרים מעוקמים הם גבשושיים או לא סדירים, ראה שלב 2.4, או להפחית את כמות PEGDA כדי לרכך את חומר crosslinked שלב 1. כראוי ניסוחי bioink מוכנים extrude חלק, המאפשרים בתצהיר מדויק בדפוסים רצויים או ארכיטקטורות.
      הערה: ההליכים bioprinting והשימוש בו המתוארים מכשיר מותאם אישית 3-D bioprinting נועד בבית במיוחד עבור רקמות לבנות הדפסה ³² כפרמטרים הדפסה כגון, הספציפיים משתנים באופן דרמטי עבור כל סוג של מכשיר ודורשים כיול.g על ידי המשתמש.
4. כדי לשפר את תכונות שחול, להשלים ללא שינוי HA ו ג'לטין אל bioinks (1.5 מ"ג / מ"ל ​​ו -30 מ"ג / מ"ל, בהתאמה).

3. אימות ידי Bioprinting עם בונה כבדה ראשונית

1. כן 3-D spheroids הכבד תא ראשוני בתליית שיטות ירידה כמרכיב הסלולר ³³
   הערה: Bioprinting יכול להתבצע ללא spheroids, אבל במקום עם תאים בודדים המרחפים bioinks הידרוג'ל גם כן. Spheroids מועסקים כאן כדי להאיץ אינטראקציות תאים תאים ולבנות פונקציונליות. מספר spheroids או התאים מועסקים תלוי ביישום הספציפי צריך להיקבע על ידי המשתמש. פעולות אלה אמורות להתבצע בתנאים סטריליים, באמצעות אספקה ​​סטרילית.
   1. כן HCM על ידי הוספת התוכן המופשר של ערכת רכיב תוספת HCM לתקשורת הבזליים hepatocyte (HBM) וסינון סטרילי.
      1. הפשרת un רכיבי תוספתtil נוזלי.
      2. מוסיפים את הרכיבים תוספת (חומצה אסקורבית, 0.5 מ"ל; אלבומין בסרום שור [חומצות השומן החופשיות], 10 מ"ל; גנטמיצין B סולפט / amphotericin, 0.5 מ"ל; הידרוקורטיזון 21-hemisuccinate, 0.5 מ"ל; אינסולין, 0.5 מ"ל; גורם הגדילה באפידרמיס אנושי רקומביננטי , 0.5 מ"ל; העברת, 0.5 מ"ל) ל -500 מ"ל HBM.
      3. סינון סטרילי דרך פילטר מיקרומטר 0.45 מיקרומטר או 0.22 באמצעות יחידת מסנן בקבוק העליונה או מסנן קצה המזרק.
   2. לקבוע את צפיפות התאים של hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה, תאים Kupffer, ותאי stellate ידי ספירת על hemocytometer לאחר כל סוג תא הופשר פי הוראות היצרנים.
   3. שלב hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה, תאים Kupffer, ותאי stellate המאופיינים ביחס 80:10:10 על ידי מספר הסלולרי במדיה HCM כי כבר חימם עד 37 מעלות צלזיוס צינור חרוטי.
      הערה: היקף בתקשורת לשמש תלוי את מספר הסלולרי הכולל ספציפי לבקשה צריך להיקבע על ידי הדואר אלקטרוני למשתמש.
   4. צנטריפוגה השעית התא במשך 5 דקות ב 520 XG ב 20 ° C.
   5. לשאוב supernatant, משאירים מאחור את התא גלולה.
   6. Resuspend התא גלולה בתקשורת HCM להניב ההשעיה תא המכיל 1,000 תאים לכל 40 מדיה μl. הנפח הכולל תלוי במספר spheroids שיופק.
   7. מעבירים את ההשעיה תא צלחות Drop Hanging בפורמט 96-היטב. להוסיף סך של כ 1,000 תאים לכל היטב HCM ולשמור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 3 ימים שבמהלכה יוצר spheroids רב-תאי.
   8. אסוף spheroids הכבד מהצלחת Drop Hanging באמצעות pipettor. מעבירים צינור חרוטי 15 מ"ל סטרילי.
2. spheroids הכבד Bioprint ב bioink הידרוג'ל הכבד ספציפי
   1. הכן גיבוש bioink הידרוג'ל ECM המכיל כבד כמתואר שלב 1, העסקת 8% PEGDA ו -8% 8-Arm אלקין PEG כפי crosslinkers. השתמש השילוב הזה עבור היכולת שלה resulting בתוך הידרוג'ל קרוב מודולוס אלסטיות גזירת רקמת כבד ילידים.
   2. תן spheroids ליישב לתחתית של צינור החרוטים שבו הם הונחו שלב 3.1.7. זה משתנה בהתאם לגודל וצפיפות אליפטית, אך בדרך כלל מתרחש בתוך 1-2 דקות. הסר את כל התקשורת על ידי aspirating או עם pipettor בזהירות.
   3. מעבירים את העוצמה הרצויה של פתרון הידרוג'ל bioink מוכן טרי אל צינור חרוטי המכיל את spheroids. באופן כללי, נפח מתאים הוא 10% -25% יותר מאשר הנפח של לבנות 3-D המיועד להדפסה. בזהירות פיפטה מעלה ומטה כדי resuspend הספרואידים בפתרון הידרוג'ל bioink. מעבירים מחסנית bioprinter באמצעות pipettor או פיפטה סרולוגיות.
   4. בתוך המחסנית bioprinter, לאפשר הפתרון לעבור לשלב crosslinking הראשון (התגובה תיאול-acrylate) למשך 30 דקות.
      הערה: בהתאם לגודל אליפטית, המחסנית ייתכן שתהיה צורך לאט לסובב או התוכן ייתכן שיהיה צורך מהולמרית סטרילי כדי לשמור על spheroids מופצים ברחבי bioink במהלך crosslinking שלב 1. זהו פחות של הכרח bioinks מוכן עם תאים מושעים במקום spheroids.
      הערה: בעקבות crosslinking שלב 1, למשתמשים יש חלון הפעלה של כמה שעות. עם זאת, מומלץ לבצע את תהליך bioprinting במהירות כדי לשפר את כדאיות התא.
   5. בעקבות crosslinking שלב 1, השתמש בהתקן bioprinting ליצור מבנים הידרוג'ל רצויים המכילים את spheroids הכבד הראשוני (או תאים אחרים).
      הערה: טכנולוגיה זו מספקת מערכת biofabricating מגוון רחב של מבנים. פרמטרים כגון נפח הכולל, מספר התאים או spheroids, גיאומטרית המבנה המודפסת, ואת מצע שעליו בונה מודפסות הם תלויים במידה רבה על המטרות של המשתמש.
   6. לאחר בתצהיר לתוך התצורה המבוקשת, לנהל אור UV למשך 2-4 שניות כדי להפעיל את מנגנון crosslinking המשני, ייצוב השיתוףnstructs וקשיחות הגדלה לרמה הרצויה.
      הערה: ריכוז-אלקין PEG, ובכך צפיפות crosslinking הסופית הכוללת, בעיקר שולטת קשיחות המבנה הסופי.
   7. חזור על שלבי 3.2.4 ו 3.2.5 כדי ליצור מבנים רבים-שכבתיים.

תוצאות

כאשר ההליכים המתוארים לעיל הוא אחריו בצורה נכונה, הידרוג צריך להכיל פרופיל ביוכימיים ספציפי לסוג רקמת היעד, ²⁰ לאפשר רמה גבוהה של שליטה על bioprinting מודולוס אלסטיות סופי, ³⁴ ולתמוך תאים פונקציונליים קיימא בונת רקמות.

Discussion

ישנם מספר מרכיבים חיוניים שכדאי להביא בחשבון כאשר מנסים biofabricate בונה רקמות 3-D, לשימוש עתידי בבני אדם או עבור יישומים ההקרנה חוץ גופית. העסקת מרכיבים תאיים המתאים קובע את הפונקציונליות הפוטנציאל בסופו של דבר, כאשר המכשיר biofabrication עצמו קובע את המתודולוגיה הכללית לה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronic acid	Sigma	53747
Gelatin	Sigma	G6144
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone	Sigma	410896
Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)	ESI-BIO	GS315	Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)
PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa	Creative PEGWorks	PSB-887
Primary human hepatocytes	Triangle Research Labs	HUCPM6
Primary human liver stellate cells	ScienCell	5300
Primary human Kupffer cells	Life Technologies	HUKCCS
Hepatocyte Basal Media (HBM)	Lonza	CC-3199
Hepatocyte Media Supplement Kit	Lonza	CC-3198	HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5 ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5 ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 ml; insulin, 0.5 ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 ml; transferring, 0.5 ml)
Triton X-100	Sigma	T9284	Other manufacturers are ok.
Ammonium hydroxide	Fischer Scientific	A669	Other manufacturers are ok.
Fresh porcine cadaver tissue	n/a	n/a
Lyophilizer	any	n/a
Freezer mill	any	n/a
Bioprinter	n/a	n/a	The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.
Hanging drop cell culture plate	InSphero	CS-06-001	InSphero GravityPlus 3D Culture Platform