Ex Vivo optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח

Summary

גישות optogenetic נמצאים בשימוש נרחב כדי לתפעל פעילות עצבית ולהעריך את ההשלכות על תפקוד המוח. הנה, טכניקה מתוארת שעם ביטוי in vivo של המפעיל האופטי Channelrhodopsin, המאפשר ניתוח vivo לשעבר של נכסים הסינפטי של ארוכי טווח ספציפי קשרים עצביים מקומיים מעגלים הקשורות פחד.

Abstract

גישות optogenetic נמצאים כעת בשימוש נרחב כדי ללמוד את הפונקציה של אוכלוסיות נוירונים ומעגלים ידי שילוב ביטוי ממוקד של חלבוני אור מופעל והמניפולציה הבאה של פעילות עצבית על ידי אור. Channelrhodopsins (ChRs) הם אור מגודר קטיון ערוצים וכאשר התמזגו חלבון פלואורסצנטי הביטוי שלהם מאפשר להדמית הפעלה בו זמנית של סוגי תאים ספציפיים תחזיות axonal שלהם באזורים המוגדרים של המוח. באמצעות זריקה stereotactic של וקטורים ויראליים, חלבונים היתוך CHR ניתן constitutively או הביע תנאי בתאים ספציפיים של אזור במוח מוגדר, ותחזיות axonal שלהם יכול לאחר מכן להיחקר אנטומית והן מבחינה תפקודית באמצעות לשעבר vivo ההפעלה optogenetic פרוסות המוח. זה הוא בעל חשיבות מיוחדת כאשר מכוונים על מנת להבין את המאפיינים הסינפטי של קשרים שלא ניתן להתמודד עם גישות גירוי קונבנציונליות חשמליות או בזיהוי affe רומןלהשכרה וקישוריות efferent כי הובן היטב בעבר. הנה, כמה דוגמאות להמחיש עד כמה טכניקה זו ניתן ליישם לחקור שאלות אלה כדי הבהרת מעגלים הקשורות פחד באמיגדלה. האמיגדלה היא אזור מפתח לרכישה והבעה של פחד, ואחסון של פחד זכרונות רגשיים. קווים של ראיות רבים מראים כי קליפת מוח הקדם חזיתית המדיאלי (mPFC) משתתפת היבטים שונים של רכישת פחד הכחדה, אבל הקישוריות המדויקת שלה עם האמיגדלה היא רק מתחילה להיות מובנת. ראשית, הוא הראה כיצד vivo לשעבר ההפעלה optogenetic יכול לשמש כדי לחקור היבטים של תקשורת הסינפטי בין afferents mPFC ותאי היעד באמיגדלה basolateral (BLA). יתר על כן, היא המחישה עד כמה vivo לשעבר זו הגישה optogenetic ניתן ליישם כדי להעריך דפוסי קישוריות הרומן באמצעות קבוצת נוירונים GABAergic באמיגדלה, האשכול תא intercalated paracapsular (mpITC), כדוגמה.

Introduction

כלים מדויקים להדמית הפעלה במקבילה של קשרים ספציפיים בין אזורים במוח לבין סוגים מסוימים של נוירונים הם הופכים חשובים יותר בהבנת מדינות תפקוד המוח ומחלות הבריאות הבסיסיות הקישוריות התפקודית. באופן אידיאלי, זה כרוך בחקירה פיזיולוגית של נכסים הסינפטי מדויקים עם אשר זיהו נוירונים לתקשר. זה נכון במיוחד עבור חיבורים בין אזורים במוח שלא ניתן להישמר פרוסה מוחית חריף יחידה. בעבר, זו הושגה בעיקר ניסויים נפרדים. מצד אחד, קליעים נותבים עצביים מוזרקים in vivo הועסק בשילוב עם אור עוקב או ניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים של שותפים טרום postsynaptic. מצד השני, כאשר שטחי סיבים מהאזור מהמוצא נשמרים ונגישים בהכנת הפרוסה, גירוי חשמלי נעשה שימוש כדי להעריך מנגנוני תקשורת סינפטית עם תאים באזור היעד.

עם כניסתו של optogenetics, הביטוי הממוקד של-ערוצי קטיון אור המגודרים, כגון Channelrhodopsins (ChRs) התמזג חלבוני ניאון, מאפשר כעת הפעלה של נוירונים מסלולי axonal שלהם, ובמקביל לאפשר להדמיה שלהם פוסט הוק ניתוח אנטומי ^{1- 4.} בגלל CHR להביע אקסונים יכול להיות מגורה גם כאשר ניתק מהורה somata ^5, אפשר פרוסות המוח אל: 1) להעריך תשומות מאזורים במוח שלא היו נגישים עם גירוי חשמלי קונבנציונלי, כי שטחי סיבים אינם להפרדה או מסלול ספציפי הוא לא ידוע; 2) באופן חד משמעי לזהות את האזור המוצא לתשומות ספציפיות שהיו הניחו אך באופן חלקי הבינו; ו -3) לחקור את הקישוריות התפקודית בין סוגי תאים מוגדרים, הן מקומי והן בתחזיות ארוך טווח. בגלל מספר יתרונות, מיפוי optogenetic זו של מעגלים פרוסות המוח הפך רחבly בשימוש בשנים האחרונות, וכן מגוון של וקטורים ויראליים עבור ביטוי ChRs fluorescently-tagged זמין מספקי מסחרי. כמה יתרונות מרכזיים של הפעלת optogenetic על גירוי חשמלי קונבנציונלי הם ללא ניזק לרקמות עקב מיקום של אלקטרודות גירוי, ספציפי של גירוי סיבים כי גירוי חשמלי יכול גם לגייס סיבי מעבר או תאים סמוכים אחרים, וכן גירוי מהיר לא פחות ובזמן מדויק. בנוסף, הזרקת stereotactic של וקטורים ויראליים ניתן לכוון בקלות לאזורים ספציפיים במוח ⁶ וביטוי ספציפי מותנה או תאים מסוג יכול להיות מושגים באמצעות ביטוי Cre שונה ו / או מקדם ⁷ ספציפיים. הנה, טכניקה זו מיושמת למיפוי של ארוכי טווח ומעגלים מקומיים במערכת הפחד.

האמיגדלה היא אזור מפתח לרכישה והבעה של פחד, ואחסון של פחד זכרונות רגשיים ^8,9. חוץ הלוך ושובמ האמיגדלה, קליפת המוח הקדם חזיתית המדיאלי (mPFC) ובהיפוקמפוס (HC), מבנים המחוברים באופן הדדי לאמיגדלה, הם מעורבים בהיבטים של הרכישה, איחוד ואחזור של זיכרונות פחד הכחדה ^10,11. פעילות מחוזות של mPFC תנוגן תפקיד כפול זה לשלוט פחד גבוה ונמוך מקובעת ^12,13. זה יכול בחלקו להיות מתווך על ידי קשרים ישירים מן mPFC לאמיגדלה שצפויה לשלוט פעילות האמיגדלה ופלט. לכן, בשנים האחרונות, מספר מחקרים אשר נכתבו בניסויים פרוסים vivo לשעבר לחקור אינטראקציות הסינפטי בין afferents mPFC ותאי יעד ספציפיים באמיגדלה ^14-17.

במהלך הלמידה פחד, מידע חושי על גירויים ממוזגים מותנית מגיע האמיגדלה באמצעות תחזיות מאזורים התלמוס ואת קליפת המוח ספציפיים. פלסטיות של תשומות אלה לנוירונים בחלק לרוחב (LA) של basolהאמיגדלה ateral (BLA) היא מנגנון חשוב שבבסיס פחד מיזוג ^9,18. ראיות הגדלה עולות כי תהליכי פלסטיק במקביל באמיגדלה כרוכות באלמנטים מעכבים לשלוט זיכרון פחד ^19. קבוצת נוירונים מעכבים אשכולות הם תאי המדיאלי GABAergic intercalated paracapsular (mpITCs), אבל הקישוריות והתפקוד המדויקת שלהם מובנת ^20-22 חלקית. כאן, מיפוי מעגל optogenetic משמש כדי להעריך קישוריות מביאה ו efferent של תאים אלה והשפיעו על הנוירונים היעד באמיגדלה, הוכחה כי mpITCs לקבל קלט חושי ישיר מתחנות ממסר התלמוס ואת קליפת מוח ^23. ביטוי ספציפי של chr ב mpITCs או נוירונים BLA מאפשר מיפוי של אינטראקציות מקומיות, חושף כי mpITCs לעכב, אלא גם מופעלים הדדית, הנוירונים העיקריים BLA, הצבתם מעגלים מעכבות היזון קדימה ומשוב הרומן ששולטים ביעילות פעילות BLA23.

Protocol

הצהרה אתיקה: כל הפרוצדורות היו בהתאם הדירקטיבה של האיחוד האירופי על השימוש בחיות במחקר אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מקומיים ושימוש הוועדה (Regierungspräsidium Tuebingen, מדינת באדן-וירטמברג, גרמניה) אחראי מאוניברסיטת טובינגן.

1. נוהל הזרקת stereotactic

1. הכן את כלי סטרילי (מספריים, סכין מנתחים, מלחציים, קודח, מחטים, חומר תפר) באמצעות מעקר. מסדרים כלים סטרילי ופתרונות נדרשים אחרים ואספקה ​​ניתוח כגון חילופי גפן סטרילי, חיטוי, בופר פוספט סטרילית (PBS, pH 7.4), ו- H ₂ O ₂ על וילון ניתוח סטרילי.
2. משוך micropipettes זכוכית זריקות (איור 1 א ', הבלעה) באמצעות נימת תיבה רחבה 3 מ"מ על microelectrode אופקי חולץ על פי הוראות היצרן.
   הערה: עבור זריקות עמוקות, להתחדד אלקטרודה צריך להיות מספיקזמן להגיע הקואורדינטות ביותר הגחון (כ 5 מ"מ;. קואורדינטות, ראה 1.10).
3. Premix 1 μl של פתרון וירוס ו -0.2 μl של פתרון ירוק מהיר 0.1% ב PBS סטרילית (הנראות של פתרון טוב יותר ב פיפטה זכוכית). מלאו טפטפות זכוכית עם תערובת של פתרון וירוס וירוק מהר בעזרת פיפטה מיקרוליטר עם טיפ נאה (איור 1 א ', הבלעה).
   הערה: עבודה עם וקטורים ויראליים הקשורים מוקטורים (rAAV) נחשב בטיחות ביולוגית ברמה 1 (BSL 1) עבודה והוא חייב להתבצע במעבדה 1 BSL. rAAVs ששימשו במחקר זה (תרשים 1C) היו: 1) mPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (סרוטיפ 2/9) ^16; 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (סרוטיפ 2/9) ^23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (סרוטיפ 2/1) ²³
4. להרדים עכבר באמצעות מכונת הרדמה חיה קטנה (Isoflurane: 3% חמצן לזירוז).
   הערה: עכברים ששימשו במחקר זה היו 4 -7 שבועות ישנים של הזנים גנוטיפים הבאים: סוג בר C57BL6 / J (ניסוי 2A דמויות 3A-D); GAD67-GFP ²⁴ (ניסוי 2B דמויות 3E-H); Tac2-Cre ²⁵ (ניסוי 2C דמויות 3I-J).
5. לגלח את הראש בין האוזניים והעיניים. החל חיטוי (providone-יוד המבוססת) בראש מגולח באמצעות צמר גפן.
6. החל משחת עין כדי למנוע התייבשות של עיניים במהלך הרדמה. תת עורי להזריק עכבר עם משכך כאבים (מבוסס-meloxicam, 0.1 מ"ל של 5 מ"ג / מ"ל ​​פתרון).
7. העבר את העכבר בתוך מסגרת stereotactic (איור 1A) ולשמור הרדמה באמצעות מסכת גז הרדמה (Isoflurane: 2% חמצן לצורך תחזוקה). בדוק עומק ההרדמה באמצעות רפלקס נסיגה איבר לפני שתמשיך.
   הערה: לשמור על תנאים סטריליים טוב ככל האפשר במהלך ההליך הכירורגי כולו; ללבוש facemask חד פעמי, ללכת כירורגיתwn, וכפפות.
8. בצע חתך עור על החלק העליון של הראש באמצעות מספריים. משוך בעדינות את עור לצד באמצעות מלקחיים בוטים, לתקן עם מלחציים לחשוף פני גולגולת, וגולגולת נקיה עם H ₂ O _2.
9. המוזרקים מארק על הגולגולת באמצעות חורים סמן וצינורות קידוח קבע טיפ נאה עבור ההמיספרות הן (איור 1B). קואורדינאטות זריקות במחקר זה הם (מ גבחת (מ"מ)): mPFC: קדמית 1.9, לרוחב ± 0.3, הגחון 2.1; MGM / PIN: אחורי 3.0, לרוחב ± 1.8, גחון 3.8; mpITC / BLA: אחורי 1.45, לרוחב ± 3.35, ועל גחון 4.75.
10. הר פיפטה זכוכית מלאה על מסגרת stereotactic מחוברת להתקן הזרקה בלחץ ולהביא פיפטה לעמדת גבחת.
11. לשבור את קצה פיפטה הזכוכית באמצעות מלקחיים ישר-טיפ נאה. האם זה בעדינות כדי למנוע דור אירוסול של פתרון וירוס. ודא קצה פיפטה פתוח ידי החלת פולסים הלחץ כמה והתבוננות שחול של טיפות Viruהפתרון של.
12. עבור אל קואורדינטות הזרקה הרצויות ולהזריק מחצית תוכן פיפטה (~ 0.5 μl) באמצעות ההגדרות הבאות בהתקן ההזרקה בלחץ: לחץ: 20 psi, אורך הפולס ממוצע: 30 ms, מספר הממוצע של פעימות: 50.
13. השאירו פיפטה במקום דקות ~ 1 לפני לאט (1 מ"מ / דקה) חוזרת בה זה.
    הערה: הפוך פיפטה בטוח אינו חסום לפני חזרה הליך עם פיפטה אותו על אונה אחרת. במקרה של קצה חסום, נקי או לנתק קצה ומצבת פיפטה אפס גבחת שוב.
14. גולגולת נקיה עם PBS (pH 7.4), להסיר מלחציים, משוכה בעדינות את העור יחד, תפרה את החתך עם תפר כפתור פרט (3 - 4 קשרים). החל החיטוי (providone-יוד המבוססת) באזור הפצע.
15. עצור ההרדמה ואל תשאירו עכבר ללא השגחה עד שהוא ער לחלוטין. שמור יחיד שוכן או לחזור לחברה של בעלי חיים אחרים רק כאשר התאוששו לחלוטין. לאחר ניתוח, ממשיך לעקוב אחר מצב הבריאות, ואת המנהלמשכך כאבים ter במידת הצורך. בצע את ההליכים על פי כללים שהועלו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המקומית.

2. הכנת פרוסות חריפה

1. כן ACSF, פתרון חיתוך, כלים (מספריים, סכין מנתחים, מלקחיים, מרית, פיפטה פסטר), וחוסם אגר.
   הערה: 1 ליטר של נוזל מלאכותי השדרה Cerebro (ACSF) נדרש לכל ניסוי, והוא הוכן על ידי המסת חומרים כימיים H פעמיים מזוקקים ₂ O כפי שפורסם בעבר ^16,23. פתרון חיתוך הוא הוכן על ידי השלמת 200 מ"ל של ACSF עם 0.87 מ"ל של 2 מניות פתרון M MgSO _4.
2. ACSF וחיתוך חמצן פתרון לאורך הניסוי עם 95% O _2, 5% CO _2.
3. עמוק להרדים העכבר באמצעות מכונת הרדמה חיה קטנה באמצעות isoflurane (3% חמצן). בדוק עומק ההרדמה באמצעות רפלקס נסיגה איבר לפני שתמשיך.
4. לערוף עכבר באמצעות מספריים גדולים ומיד לצנןראש בתמיסת חיתוך קר כקרח.
5. גולגולת נפתחת בידי חתך קו אמצע אחת מן הזנב מקורי ודחף בעדינות פיסות גולגולת לצדדים באמצעות מלקחיים. במהירות להסיר מוח על ידי הרמתו מתוך הגולגולת בעדינות בעזרת מרית מעוגלת קטנה. חותכי מוח קטן עם אזמל. מניחים המוח בפתרון חיתוך קר כקרח.
6. לקבלת המוזרקים mPFC: לחתוך חלק הקדמי של המוח (המכיל mPFC) באמצעות אזמל ולשים פתרון חיתוך קר כקרח עד חיתוך.
7. הסר פתרון חיתוך עודף עם נייר סינון ודבק בחלק האחורי של המוח לבמה vibratome.
8. עבור פרוסות האמיגדלה מוטות, מדביק את המוח על לחסום את אגר (4%) לחתוך בזווית 35 מעלות (1D איור, באמצע). עבור פרוסות האמיגדלה העטרה, המוזרקים MGM / PIN ו המוזרקים mPFC, מדביקים את המוח באופן ישיר על הבמה (איור 1D, על ימין ועל שמאל). הוסף בלוק אגר נוסף מאחורי המוח ליציבות בזמן שחתך.
9. placדואר שלב חיתוך קאמרי עם פתרון חיתוך מחומצן קר כקרח שמתוחזק על 4 מעלות צלזיוס באמצעות יחידת קירור. כן פרוסות חריפות של האמיגדלה (320 מיקרומטר) באמצעות סכין ספיר. מניחים פרוסות בתא ממשק המסופק עם ACSF מחומצן ב RT.
10. לאחר ההכנה של פרוסות האמיגדלה חריפות, מניח את חדר הממשק בתוך waterbath על 36 ° C להתאושש פרוסות עבור 35 - 45 דקות. בהמשך לכך, לחזור לתא ממשק RT. עבור הקלטה מ פרוסות אלה, להמשיך עם שלב 3.2.
11. במהלך תחילת השלב 2.10, לחתוך פרוסות המוזרקות כפי שתואר קודם לכן עבור פרוסות האמיגדלה חריפות (שלבי 2.8 - 2.9). שחזור של פרוסות waterbath אינו נדרש כאן. אופציונלי: כדי להעריך ההזרקה מיקום במהירות, להתבונן פרוסות על סטריאוסקופ מצויד מנורת פלורסנט וערכות מסנן מתאים.
12. תקן פרוסות המכילות מוזרקים עבור ניתוח פוסט הוק על ידי רבדה אותם בין שני ניירות לסנן submerגינג אותם paraformaldehyde 4% (PFA) ב N / O פתרון PBS. באשר לניתוח מוזרק להמשיך בשלב 4.1.

3. ויזואליזציה גירוי של סיבי Presynaptic

1. כן מיקרוסקופ תיקון עבור הפעלת optogenetic של סיבים ותאים:
   1. מרכז את דיודה הרכובה פולטות אור (LED) על מסלול מסירת האור.
   2. מדוד את עוצמת אור LED במישור המוקד האחורי ו במוצא של כל מטרה עם מד כוח בבחירת אורך הגל המתאים של 470 ננומטר.
   3. חשב את עוצמת האור ב mW / ² מ"מ וליצור עקומת כיול (עוצמת LED (%) לעומת תפוקת האור (mW / מ"מ ²⁾⁾ לכל מטרה עבור הערכים הנמדדים עבור 470 ננומטר אורך גל.
2. תחזור פרוסת האמיגדלה חריפה מאולם ממשק המקום בתא הפרוס רכוב על גבי מיקרוסקופ הזקוף מצויד מנורת פלורסנט. תשמור על עצמך כדי למקם את הפרוסה כזו כי slicמשטח דואר פונה כלפי מעלה בתא הממשק גם הוא מופנה כלפי מעלה בחדר ההקלטה. Perfuse פרוסה עם ASCF טריים, מחומצן בשיעור של 1 - 2 מ"ל / דקה בטמפרטורה של כ -31 מעלות צלזיוס.
3. שים סיבי presynaptic של הפרוסה באמצעות מנורת פלורסנט בשילוב עם מערכות סינון מתאימות עבור חלבון פלואורסצנטי הספציפי לידי ביטוי. השתמש המטרה 5x להשיג סקירה (איור 1E), ואובייקטיבי 60x להערכת צפיפות סיבים בתוך אזור היעד.
   הערה: GFP ו YFP, להגדיר מסנן השימוש "ירוק" (עירור 472/20, beamsplitter 495, פליטה 490 LP) עבור mCherry להשתמש במסנן להגדיר "אדום" (עירור 560/40, beamsplitter 585, פליטה 630/70) כמפורט בטבלת חומרים / ציוד.
4. פתח או להגביל את הצמצם במסלול אור מיקרוסקופ כפי רצוי עבור הניסוי (איור 2 ד).
5. כדי לקבל הקלטה תיקון, למלא פיפטה תיקון עם פתרון פנימי ו הר iבעל אלקטרודה n. החל לחץ חיובי פיפטה את התיקון ולאט לאט להוריד את זה קודם לתוך התמיסה אמבטיה ולאחר מכן תחת שליטה חזותית לתוך הפרוסה באמצעות micromanipulator.
   1. מתקרבים נוירון עניינים עם פיפטה את התיקון מהצד ומלמעלה. שחרר לחץ חיובי כאשר פיפטה על פני השטח של התא (גלוי גומה על פני התא) ולקבל "gigaseal" על ידי הפעלת לחץ שלילי.
   2. החל יניקה נוספת כדי לקרוע את קרום תיקון להשיג הקלטה כל תא. בהמשך לכך, לעורר סיבים שכותרתו עם LED המחוברים באמצעות אורך הגל המתאים להפעלת chr (470 ננומטר) בעת הקלטת תגובות חשמל מהתא.
   3. עבור גירוי הסינפטי להתחיל עם עוצמת LED נמוכה ולהגדיל עד משרעת הנוכחית הסינפטי הרצויה הוא הגיע. לעורר את LED על ידי הגדרת יציאות דיגיטליות בתוכנת רכישת נתונים לשלוט באורך העיתוי דופק (דוגמאות באיור3).
      הערה: תוכנות אחרות ו / או המניבה TTL התקנים יכולים לשמש כדי להפעיל LED.
6. גירוי חזור עם צמצם פתוח או מוגבל (שלב 3.4) במסלול אור מיקרוסקופ כפי רצוי בתא הסמוך רשם ו / או בנוכחות תרופות ספציפיות.
7. לאחר הקלטת, לתקן פרוסות לניתוח פוסט-הוק על ידי הרבדה אותם בין שני ניירות לסנן ו השריית אותם 4% PFA O / N.
8. לנתח נתונים אלקטרו.
   הערה: תוכנה מתאימה השתמש כדי להמחיש נתונים לטאטא מוקלטים לכל מחובר גירוי יחיד. כאשר מנתחים השפעת סמים, השתמש רוטינות לגילוי השיא להשיג מהלך הזמן של אפקט התרופה על אמפליטודות הנוכחית הסינפטי עבור כל מטאטא הפרט. לקבוע מתי השפעת התרופה מגיעה למצב יציב. כדי להכין תשובות ממוצעות מייצגות עבור דמויות, להשתמש בתוכנה כדי ממוצע ≥10 מטאטא בודד לכל תנאי ניסוי (cf איור 3B-D, FHפנל ימני, J).
   הערה: מספר חבילות תוכנות חלופיות יכולות לשמש לניתוח נתונים.

ניתוח 4. פוסט-הוק של מוזרקים

1. לשטוף פרוסות מוזרקות (משלב 2.12) והקלטת אתרים (אם הוא רצוי ההדמיה מחדש, משלב 3.7) שלוש פעמים PBS. הדבר נעשה על ידי החלפת פתרון שוב ושוב עם PBS הטרי על שייקר מסתובב שלוש פעמים במשך 10 דקות.
2. כן פתרון אגר-אגר 2% ב PBS, ולתת לו להתקרר ~ 65 מעלות צלזיוס. פרוסות מקום שטוח על החלק התחתון של צלחת פטרי בקוטר קטן 30 מ"מ, להטביע הפרוסות-אגר אגר ולתת לו להתקרר עד מוצק.
3. מדביק בלוק אגר עם פרוסה מוטבעת או פרוס לשלב של vibratome ומניח במת חיתוך קאמרי עם PBS.
4. כריתה מוטבעת פרוסות עד 70 מיקרומטר עובי. אופציונלי: לאחר resectioning, יכול להיות מוכתם פרוסות, כלומר, עם Neurotrace לחשוף cytoarchitecture (איור 3 א, ג), ו / או במכתים immunofluorescence y עבור YFP או mCherry כדי להגביר את האות מן החלבון היתוך Chr.
5. פרוסות הר בשקופיות ו coverslip עם תקשורת גוברת. המוזרקים תמונה, אם תרצה בכך, גם פרוסות תמונה המכיל סיבי בתחומי הקרנה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מיקרוסקופ לייזר סריקה confocal (איור 2 א-ג).

תוצאות

חלק זה מציג את זרימת העבודה של vivo לשעבר הגישה optogenetic ותוצאות נציג אסטרטגיות ניסויים שונים כדי לחקור את המאפיינים הפיזיולוגיים של תחזיות ארוכות טווח חושי modulatory כדי BLA ונוירונים mpITC וכן נכסים של קישוריות מקומית בין mpITC ו BLA.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה לחקירת vivo לשעבר optogenetic של מעגלים עצביים וקישוריות מקומית שניתן ליישם בקלות על רוב, אם לא כל, setups ההקלטה תיקון- clamp הפרוס זקוף על ידי לאבזר אותם עם ננומטר ~ 470 LED בנמל אור epifluorescence. יתרון עיקרי של גירוי optogenetic של תחזיות axonal בפרוסה הוא שהיא מאפשרת ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgery
Stereotactic frame	Stoelting, USA	51670	can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor	Stoelting, USA	51625	can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice	Stoelting, USA	50264	no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer	Toohey Company, USA	T25-2-900	other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries	World Precision Instruments, Germany	1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo	Eickemeyer, Germany	213261
DC Temperature Controler and heating pad	FHC, USA	40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000	Sutter Instruments, USA	P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75	Melag, Germany	08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)	Penn Vector Core, USA	AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)	Penn Vector Core, USA	AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)	Penn Vector Core, USA	AV-1-20298P
fast green	Roth, Germany	0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)	CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine)	Purdure Products, USA	BSOL32	can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)	Boehringer Ingelheim, Germany		can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment	Bayer, Germany	0191	can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)	Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle	Fine Science Tools, Germany	12050-01
Braided Silk Suture	Fine Science Tools, Germany	18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF)	for composition see references #16 and #23
internal patch solutions	for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate	Roth, Germany	P027.1	prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V	Fisher Scientific, Germany	920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65	Fisher Scientific, Germany	770180
Sapphire blade	Delaware Diamond Knives		custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16	Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492)	Lumen Dynamics Group, Canada	2012-12699
Patch microscope, BX51WI	Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier	Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A	Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10	Molecular Devices, USA		used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05	Luigs & Neumann, Germany	200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25	Luigs & Neumann, Germany	210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7	Luigs & Neumann, Germany	200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes	World Precision Instruments, Germany	GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber	Satorius Stedim Biotech, Germany	13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE	CoolLED, UK	244-1400	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt	CoolLED, UK	pE-ADAPTOR-50E	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470	Rapp Optoelectronic	L70-000	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter	Rapp Optoelectronic	inquire with company	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation)	AHF, Germany	F49-560	Filters can be bought as set F46-008
(beamsplitter)	AHF, Germany	F48-585	Filters can be bought as set F46-008
(emission)	AHF, Germany	F47-630	Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation)	AHF, Germany	F39-472	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
(beamsplitter)	AHF, Germany	F43-495W	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
(emission)	AHF, Germany	F76-490	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter	Coherent, USA	1098293
IgorPro Software, Version 6	Wavemetrics, USA		for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used
Neuromatic suite of macros for IgorPro	http://www.neuromatic.thinkrandom.com		for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA)	Roth, Germany	0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain	Invitrogen	N-21479
agar-agar for embedding and resectioning	Roth, Germany	5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding	SPL Life Sciences		alternatives can be used
Slides, Super Frost	R. Langenbrinck, Germany	61303802	alternatives can be used
cover slips	R. Langenbrinck, Germany	3000302	alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium	Vector Laboratories, USA	H-1000	alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation	Satorius Stedim Biotech, Germany	11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710	Zeiss, Germany