ביעור Cell סלקטיבי מן תרבות 3D מעורבת באמצעות טכניקה האדומה קרוב Photoimmunotherapy

Summary

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Abstract

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Introduction

ביטול תאים ספציפיים מבלי לפגוע בתאים אחרים קשה מאוד, במיוחד ברקמה הוקמה, ויש צורך דחוף שיטת חיסול תא בתחום הנדסת רקמות. כיום בתחום של רפואה רגנרטיבית, תרביות רקמה באמצעות תאי גזע עובריים (ES), תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs), או תאי גזע מושרים (iPS) הם חומרים מבטיח ^{1 - 3.}

למרות התחדשות רקמות זו נראית מבטיחה, זיהום עם תאים לא רצויים הוא דאגה עיקרית. יתר על כן, קיים חשש לשלומם של tumorigenicity לאחר ההשתלה ^4,5. למרות מחקרים רבים התמקדו בנושאים אלה לחסל תאים ספציפיים, במיוחד ברפואה רגנרטיבית ^{6 - 8,} אין שיטה מעשית פותחה.

photoimmunotherapy אינפרא אדום קרוב (NIR-PIT) הוא טיפול המבוסס על conjugat נוגדן-photoabsorberדואר (APC). נגמ"ש מורכב של נוגדנים חד שבטיים תא ספציפי (מב) וכן photoabsorber, IR700. IR700 היא נגזרת סיליקה-phthalocyanine הידרופילי לא לגרום phototoxicity בעצמה ^9. IR700 הוא מצומדות קוולנטית הנוגדן באמצעות שאריות אמידות על שרשרת הצד של מולקולות ליזין. הנגמ"ש נקשר מולקולות מטרה על קרום התא ולאחר מכן גורם כמעט תא נימק מיידי לאחר חשיפה לאור NIR ב 690 ננומטר. במהלך החשיפה NIR-אור, נקרע קרום הסלולר המובילה לתא פטירה ^{9 - 14.} NIR-PIT הוכיח כיעיל עם נוגדנים מרובים או שברי נוגדנים, כולל אנטי EGFR, אנטי HER2, אנטי PSMA, אנטי CD25, אנטי מזותלין, אנטי GPC3, ואנטי-CEA ^{15 - 21.} לכן, ניר-PIT יכול לשמש נגד מגוון רחב של מולקולות מטרה. יתר על כן, ניר-PIT הוא טיפול מבוקר היטב המאפשר טיפול סלקטיבית של אזורים ספציפיים על ידי הגבלת-תאורת NIRt הקרנה ^18,22.

כאן, אנו מציגים שיטה של ​​חיסול תאים ספציפיים באמצעות NIR-PIT מתרבויות 3D מעורבת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ההערה: הפרוטוקול הבא מתאר את הצעדים הדרושים כדי לחסל תאים ספציפיים באמצעות NIR-PIT. בקרות ופרטים נוספים על כדאיות NIR-PIT ותא ניתן למצוא במקום אחר ^18.

1. הצמיד של IR700 לנוגדנים חד-שבטיים (מב)

1. הכן מב עניין ב 2-5 מ"ג / מ"ל ב 0.1 M Na ₂ HPO ₄ (pH 8.6) פתרון.
2. מערבבים 6.8 nmol של מב עם 30.8 nmol של 10 מ"מ IR700 ב 0.1 M Na ₂ HPO ₄ פתרון (pH 8.6) בצינור microcentrifuge ו דגירה ב RT עבור שעה 1, מכוסה בנייר אלומיניום.
3. לשטוף את העמודה PD-10 (ראו טבלה של ציוד חומרים /) עם 15 מ"ל PBS, פעמיים. טען המדגם משלב 1.2.
4. לטהר את התערובת דרך עמודת PD-10 על ידי elution PBS על פי הוראות היצרן.
   הערה: כאן, elution היה לאורך צבע הלהקה של IR700. עבור מדגם 300 μl, חלק elution PBS הוא בדרך כלל בין 2.5 מ"ל ל -4.4 מ"ל.
5. לקבוע אתריכוז חלבון עם מכתים Coomassie על ידי מדידת הספיגה ב 595 ננומטר עם ספקטרופוטומטר ^9. קבע את הריכוז של IR700 עם הקליטה 689 ננומטר כדי לאשר את המספר של מולקולות fluorophore מצומדות לכל מולקולה מב ^9.
   הערה: חשוב לקבוע מספר נטיה אופטימלי של מולקולות IR700 ב 1 מב עם ספקטרופוטומטר. באופן כללי, כ -3 מולקולות IR700 במולקולת 1 מב הן אופטימליות עבור הן במבחנה בעבודת vivo. HPLC ושיטות SDS-PAGE ניתן להשתמש כדי לאשר את מב ו IR700 מאוגדים ובין אם לאו.
6. חנות ב 4 מעלות צלזיוס לאחר קביעת ריכוז החלבון.

2. הכנת תרבית תאים 3D מעורב (Mixed אליפטית)

1. החל מים סטריליים (סביב 1 מיליליטר) לתוך קטע מאגר הצלחת לתלות צלחות טיפה.
2. הכן יחסים שונים של סוגי תאים של עניין - תאים A431-לוק-GFP ותאי 3T3-RFP -עם כל דגימה המכילה 5,000 תאים בסך הכל, המרחפים 50 μl של התקשורת והתרבות.
   הערה: כן 1: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100, וכו 'יחסים של סוגי תאים של עניין תקשורת והתרבות תלוי תאים מהסוג.
3. דגירת התמהיל 5-7 ימים בצלחת הירידה 96 גם תלוי חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, פחמן דו חמצני 5%. שנה את התקשורת והתרבות כל 2 ימים. הערה: כדי להפוך את 3D אליפטית בדיוק, להתמודד עם הצלחת בעדינות, כמו טיפות המכילות תאים ליפול בקלות לפני להרכיב צורות 3D.
4. שים את המורפולוגיה והגודל של spheroids באמצעות מיקרוסקופ brightfield הפוכה ב 10X - הגדלה 40X. הערה: למרות שזה תלוי סוגי תאים וגודל-Drop Hanging, להבטיח כי הקוטר של אליפטית הוא סביב 400-600 מיקרומטר לאחר 7 ימי דגירה של 96 גם תלוי צלחת טיפה.

3. במבחנה NIR-בור תרבית תאי 3D מעורבת

1. שנה את התקשורת של חהnging צלחות ושחרר כדי המצומד 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​נוגדנים photoabsorber (APC) מדיה המכילה, דגירה במשך 6 שעות בתוך חממה humidified ב 37 ° C ופחמן דו חמצני 5%.
2. לאחר 6 דגירת hr, לשטוף את אליפטית פעמים עם תקשורת והתרבות הטריה (פנול האדום חינם). בעדינות להעביר את אליפטית לצלחת עם רצפת זכוכית 50 מ"מ עם 100 μl פנול טריים התקשורת והתרבות אדום ללא באמצעות קצה פיפטה סטרילית 200 μl עם קצה לחתוך. מניחים אליפטית אחת בכל צלחת.
3. שים לב אליפטית עם מיקרוסקופ brightfield הפוך להבחין בשינוי של מורפולוגיה. כדי לבחון את הכתבים האופטיים (למשל, ה- GFP ו RFP) להשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם גדרות המסנן הבאות: GFP - 469 מסנן עירור ננומטר, ואת מסנן פליטה 525 ננומטר; RFP - 559 מסנן עירור ננומטר, ו 630 מסנן פליטה ננומטר.
4. מניחים את אור דיודה (LED) מעל צלחת תחתית זכוכית עבור הקרנה.
   הערה: ניתן להיחשף Spheroids לנירלהדליק או על מיקרוסקופ או בשכונה למינרית.
   1. מדוד את צפיפות ההספק של אור NIR עם מד כוח אופטי ^9. על פי מדידה זו, מקרינים אור NIR באמצעות דיודות פולטות אור (LEDs) אשר פולטים אור באורכי גל של 670 עד 710 ננומטר 2 J / cm ^2.
      הערה: הנורית יכול לחדור לעומק מרבי של כ 5 ס"מ. השפעות ציטוטוקסיות של NIR-PIT תלויה רק אנרגיה נתון ללא קשר צפיפות הספק ומשך החשיפה ^23.
5. לאחר ההקרנה, להעביר את אליפטית לתוך צלחת Drop Hanging חדש עם 50 μl של התקשורת בתרבות טרי דגירה במשך יום 1 ב חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, פחמן דו חמצני 5%.
6. בעדינות להעביר את אליפטית לצלחת עם תחתית זכוכית עם 100 μl של התקשורת בתרבות טרי (פנול אדום חינם) באמצעות קצה פיפטה סטרילית 200 μl עם קצה לחתוך. שימו לב אליפטית עם יום פלואורסצנטי מיקרוסקופ 1 לאחר Fi באמצעות NIR-PITהגדרות LTER כמתוארות בשלב 3.3.
   1. זיהוי תאים מתים על ידי הוספת יודיד propidium לתקשורת בריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל, או על ידי אובדן של GFP הקרינה cytoplasmic באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2 ב) ^14,18,22.
7. חזור על שלבי 3.1-3.6 אם תאי יעד הם לא בוטלו לחלוטין.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כדי אופטית לפקח על השפעת NIR-PIT, שורת תאים A431, אשר overexpresses EGFR, שונה גנטית גם להביע GFP ו בלוציפראז (A431-לוק-GFP). כתוצאה היעד אי NIR-PIT, הקו הסלולרי Balb / 3T3 שונה אופטית להביע RFP (3T3-RFP). הנגמ"ש, וקטיביקס-IR700 (פאן-IR700), היה מסונתז. Spheroids מעורבת, אשר הורכבו יחסים שונים של ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

אנו מדגימים שיטת חיסול תאים ספציפיים מתוך תרבית תאים 3D מעורבת ללא נזק לתאים היעד הלא באמצעות NIR-PIT. עד כה, לא קיימת שיטה מעשית של חיסול תאים פעם הרקמה מוקמת או לאחר השתלה. לכן, ניר-PIT הוא שיטה מבטיחה לעשות זאת. טכניקה זו יכולה גם להיות מנוצלת in vivo ^18,22, מאז נג...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IRDye 700DX Ester Infrared Dye	LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)	929-70011
Na2HPO4	SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)	S9763
Sephadex G25 column (PD-10)	GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)	17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay	Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)	PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates	3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)	HDP1096-8
Optical power meter	Thorlabs (Newton, NJ, USA)	PM100
LED: L690-66-60	Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)	L690-66-60
Vectibix (panitumumab)	Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm	Cellvis (Mountain View, CA, USA)	D35-10-0-N