Ex vivo הדמיה חיה של ריאות גרורה microenvironment שלהם

Summary

אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית עבור הדמיה vivo לשעבר החי של אינטראקציות תא-stroma הגידול בתוך גרורות ריאה, ניצול כתבים ניאון בעכברים. באמצעות מיקרוסקופ confocal ספינינג-דיסק, טכניקה זו מאפשרת הדמיה של תאים חיים לפחות 4 שעות ויכול להיות מותאם ללמוד תנאים ריאות דלקתיות אחרות.

Abstract

גרורה היא אחד הגורמים העיקריים לתחלואה ותמותה מסרטן. גרורה הוא תהליך רב שלב ובשל מורכבותו, התהליכים התאיים והמולקולריים המדויקים שולטי הפצה וצמיחה גרורתי עדיין חמקמקים. הדמיה חיה מאפשרת הדמיה של האינטראקציות הדינמיות המרחבי של תאי microenvironment שלהם. גידולים מוצקים גרורות בדרך כלל אל הריאות. עם זאת, המיקום האנטומי של הריאות מציבה אתגר בפני הדמיה intravital. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ומהירה יחסית הדמיה vivo לשעבר החי של אינטראקציות דינמי בין תאים סרטניים stroma הסובבת אותם בתוך גרורות ריאה. באמצעות שיטה זו, תנועתיות של תאים סרטניים כמו גם יחסי הגומלין בין תאים סרטניים ותאים סטרומה ב microenvironment שלהם ניתן דמיינו בזמן אמת במשך כמה שעות. באמצעות עכברי כתב ניאון מהונדסים, שורת תאי פלורסנט, בזריקות שכותרתו fluorescentlyמולקולות ו / או נוגדנים, מספר רכיבים של microenvironment הריאות יכולות להיות חזותי, כגון כלי דם ותאי חיסון. כדי לדמות את סוגי התאים השונים, דיסק מסתובב מיקרוסקופ confocal המאפשר הדמיה רציפה ארוכת טווח עם מהירה, רכישת תמונה בארבעה צבעים נוצל. הזמן לשגות סרטים מלוקטים מתמונות שנאספו במשך מספר רב של עמדות ומטוסים מוקדי להראות אינטראקציות בין גרורה חיים ותאי חיסון במשך שעה לפחות 4. טכניקה זו יכולה לשמש כדי להוסיף ולבדוק כימותרפיה או טיפול ממוקד. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מותאמת לחקר פתולוגיות הקשורות ריאה אחרת שעלולים להשפיע על המיקרו-סביבת הריאות.

Introduction

The deadliest aspect of cancer is metastasis, which accounts for more than 90% of cancer-related morbidity and mortality¹. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular mechanisms that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. To metastasize, tumor cells in the primary tumor must detach from their neighboring cells and basement membrane, cross through the extracellular matrix, intravasate, travel via blood or lymphatic vessels, extravasate at the secondary site, and finally, survive and establish secondary tumors. In addition to the properties of the tumor cells, the contribution from the microenvironment, which includes the adjacent stroma along with the normal counterparts of the cancer cells, is crucial for the seeding and establishment of metastatic lesions².

Traditional methods to study metastatic seeding and growth examine static states, as tissues are excised and sectioned for histology. These data only generate a snapshot of this highly dynamic process. Although some useful information can be gained from these studies, the complicated process by which tumor and stromal cells interact during metastatic formation cannot be adequately assessed by these methods. Furthermore, it is not possible to gain insights into tumor or stromal cell migration patterns, which are important in establishing a colony at the distant site. In order to effectively study the metastatic process, it is essential to visualize various interactions between cancer cells and their microenvironment in a continuous manner and at real time.

The lung is a common site for metastases from solid tumors as breast, colorectal, pancreatic cancer, melanoma and sarcoma³. Intravital imaging was previously used to study cell-cell interaction in various primary tumor and metastatic models^4,5. Methods of lung imaging in mice, including intravital imaging, lung section imaging, and an ex vivo pulmonary metastasis assay have been published^6–9. Intravital imaging of mouse lungs utilizes a thoracic suction window to stabilize the lungs⁶. This method is used for time-lapse imaging of the lung microcirculation and alveolar spaces. The anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. In order to access the lungs, the chest cavity must be opened which leads to loss of negative pressure and collapsed lungs. This method only allows the visualization of a small part of the lungs and is technically demanding; an unnecessary complication in studies that examine processes that are independent of blood flow. Moreover, this method also requires gating out movement caused by breathing. This is done either by collecting images between breaths or during post image acquisition analyses¹⁰. The alternative ex vivo lung section imaging provides stability and depth, and also prepares lung parenchyma for immunostaining⁷. However, the lengthy sectioning process leads to an extensive delay between the time of animal sacrifice and the start of the imaging session. Moreover, the process of sectioning a mouse lung causes considerable amount of cell death⁸, thus interfering with the quality and quantity of imaging samples and perhaps needlessly altering tumor-stroma interactions. In order to technically bridge between the methods of intravital imaging and lung section imaging, while exploiting the advantages of the two techniques, a relatively fast and easy method for ex vivo lung imaging was developed. This method was achieved by imaging of non-sectioned whole lung lobes. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours.

Protocol

כל ההליכים המתוארים חייב להתבצע בהתאם להנחיות והתקנות לשימוש בעלי חיים בעלי חוליות, כולל אישור מראש על ידי טיפול מוסדי בעלי חיים הוועדה המקומית שימוש (IACUC).

דור 1. ריאות גרורות עבור vivo לשעבר הדמית חיה (מהונדס או זנב וריד הזרקה)

הערה: גרורות ריאות יכול להיווצר על ידי ניצול מודלים עכבר מהונדס גנטית או על ידי תוך ורידי (IV) הזרקה של תאים סרטניים.

1. צור גרורות סרטניות בריאות הדמיה ידי חצייה במודל של עכברי גידול מהונדס גנטית לעכבר כתב מהונדס, למשל, לחצות את במודל העכברי של סרטן שד, המסוף ארוך וירוס גידול חלב העכבר החוזר-polyoma אנטיגן באמצע T (MMTV-PyMT) ¹¹ לתוך ACTB-ECFP עכבר מודל ^12.
   הערה: מודל ACTB-ECFP מבטא משופרת חלבון פלואורסצנטי ציאן (ECFP) תחת β-המעשהב אמרגן כך שכל התאים לזרוח בערוץ כחול, CFP. עם זאת, תאים סרטניים הם ללא ספק הבולטים ונראים כמו הארי של תאים ECFP חיובי תחת מיקרוסקופ. מודל עכבר MMTV-PyMT מפתחת מחלה מתקדמת, שבה צמיחת גידול חלב קשורה להפצת תאים סרטניים לפריפריה, במיוחד אל ריאות. בעכברים MMTV-PyMT על FVB / n רקע, micrometastases ניתן לצפות סביב 10-11 שבועות של גיל. באופן כללי, התקדמות אלה macrometastases בסביבות 14 שבועות של גיל ^13.
   אוֹ
2. צור גרורות ניסיון באמצעות תאים ראשוניים או שורות תאי syngeneic. השתמש בתאי גידול ראשוני מניפולציות במבחנה או שורות תאים (למשל., תמרה) ואחריו הזרקת iv ^14.
   1. בקצרה, בפרוטוקול זה, להזריק חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -expressing (+) שורת תאי MMTV-PyMT לעכברי כתב ניאון (ACTB-ECFP) או עכברי wildtype. אז,לדמיין תאים אלה מכונים ¹⁵ תאים VO-PyMT באמצעות המסלול הירוק, GFP.
      הערה: שורת תאי VO-PyMT המקורי נגזרו על אורתופדיה ונדרבילט בנשוויל, טנסי. VO מייצג אורתופדיה ונדרבילט.
   2. בעקבות הזרקה של 10 ^{6 תאים} (200 μl), להתבונן extravasation תא סרטני מיד ועד כמה שעות לאחר ההזרקה; להתבונן micrometastases בין 1-3 שבועות לאחר ההזרקה וכדי לזהות macrometastases 3 שבועות לאחר ההזרקה ^15.
      הערה: פחות תאים ניתן להזריק להאריך את הזמן בין הזרקה לצמיחה גרורתי.

2. תיוג של רכיבי ענייני microenvironment גרורתי (טרנסגניים ו / או הזרקה)

הערה: תיוג יכול להיות מושגת על ידי עכברים מהונדסים ו / או על ידי הזרקה שונה. הקפד להשתמש בצבעי ניאון שונים עבור תיוג של סוגי תאים שונים.

1. רכיבי תווית של microenvironment גרורתי באמצעות עכברים מהונדסים. נחצה את מודל הגידול העכבר שהוזכרו לעיל (למשל., MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) למודל עכבר מהונדס שבו תאים סטרומה עניין מסומנים על ידי חלבון פלואורסצנטי שהוא לא ECFP, למשל., ג-FMS-EGFP ^4,16.
   הערה: בנוסף להדמיה של תאים סרטניים בערוץ CFP, זו מאפשרת הדמיה של תאים מיאלואידית ב GFP ערוץ ^4.
   ו / או
2. לייבל רכיבים שונים של microenvironment גרורתי באמצעות הזרקה לעכברי כתב ניאון מהונדסים או (לא ניאון) עכברי wildtype.
   הערה: תרכובות כמה ניתן להזריק לתייג רכיבים שונים של microenvironment גרורתי, למשל, נוגדן AF647 מצומדות Gr-1 משמש כאן לתייג נויטרופילים וכמה מונוציטים ¹³ ו dextrans המשקל המולקולרי שונים משמשלתייג נימי ריאות. להכנת ההזרקה אלה ראו שלב 4.

3. הכנת חומרים לפני החיתוך

1. 2% Agarose
   1. לשקול 0.2 גרם של agarose ולהוסיף 10 מ"ל 1 x PBS. מחממים את הפתרון לפזר את agarose. Agarose יהיה לגבש ב RT, אז לשמור אותו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד בשימוש לאינפלציה.
2. CO _{2 ו} בקר טמפרטורה
   1. בדוק _DDH 2 O בתא humidification. מילוי בעת הצורך. הכנס צלחת תצורה לתוך בעל צלחת במת טמפרטורה (תא האקלים). הפעל את בקר _ה- CO 2 ולהגדיר ₂ CO ב -5%. ודא שקצב זרימת האוויר מוגדר 0.4 NL / min.
   2. פתח את האוויר ושסתום ₂ CO. הפעל את בקר הטמפרטורה. צריך להקפיד שהטמפרטורה של החדר האקלים והמכסה נקבעים על 37 מעלות צלזיוס.
   3. שחרר לחץ אוויר על מטר ₂ CO. בדוק CO ₂ הגדלה, דוארquilibration עשוי להימשך עד 30 דקות.
3. דיסק confocal ספינינג מיקרוסקופ
   הערה: פרטים על הגדרת מיקרוסקופ תוארו בעבר ^4,17.
   1. הפעל לייזרים (הלייזר ארגון עבור עירור 488 ננומטר ננומטר של מצב מוצק 405, 561 ננומטר ו 640 nm לייזרים). הפעל את המיקרוסקופ, מצלמה, יחידת בקרת דיסק ספינינג, AOTF, יחידת בקרת הליזר לבין בקר המצלמה.
   2. פתח את תריס מיקרוסקופ, להדליק את המחשב פועל המיקרוסקופ ולפתוח את התוכנה.
4. הכנת הכלים והפלטפורמה לנתיחה.
   1. הפעל מעקר את החרוז החם ולתת לו להגיע 250 מעלות צלזיוס. 2 זוגות נקיים של מספרי מלקחיים כירורגית עם מים וסבון. לעקר את הכלים שניים 30 לפחות. תנו את הכלים להתקרר. השתמש מכסה פוליסטירן כפלטפורמה לנתיחה. כסה אותה בפיסת שתיין במעבדה.

4. הכנת זריקות

הערה: בהתאם את זמן מחצית החיים ואת התגובה המועדפת, להזריק fluorescently שכותרתו נוגדנים ו / או מולקולות ניאון או מיד לפני להקריב בעלי חיים או כמה שעות עד ימים לפני.

1. חזרה לתמונה Gr1 חיובי נויטרופילים ומונוציטים, להכין מזרק עם 7 μl של AF647 מצומדות המניות Gr-1 נוגדנים (1 מ"ג / מ"ל) לתוך 100 μl של PBS סטרילי מתחת למכסה המנוע. מניחים מחט G ½ 27 על המזרק.
2. כדי נימים ריאות תמונה, להכין מזרק השני והשלישי עם 100 μl של 70 או dextran rhodamine מצומדות KD (4 מ"ג / מ"ל) או 10 KD dextran AF647 מצומדות (4 מ"ג / מ"ל). מניחים מחט G ½ 27 על המזרקים.
3. להזריק את hr iv 5 פתרון נוגדן AF647 מצומדות לפני כריתה של הריאות.
4. להזריק אחד או שני פתרונות dextran iv הערב 'כריתת הריאות.

5. הכנת הריאות עבור vivo לשעבר הדמיה חיה

הערה: נסה לעבוד סטרילי וזהירה ככל האפשר כדי להימנע אתגרים מיותרים של תאים חיסוניים בתוך הריאות.

1. להזריק את intraperitoneal העכבר (IP) באמצעות מנת יתר קטלנית של הרדמה המותר על פי פרוטוקול חיה שאושר על ידי IACUC, למשל., 1 מ"ל של 2.5% Avertin. חכה בעכבר כדי להפסיק לנשום ולהיות שאינם מגיבים לחלוטין לגירויים מזיקים (קמצוץ כפה אחורי).
   הערה: נקע בצוואר הרחם המתת חסד פחמן דו חמצני יש להימנע כפי שהוא יכול להשפיע לרעה על כדאיות התא ריאות.
2. לשתק את העכבר על קרש חיתוך לעקר את העכבר עם אתנול 70%.
3. השתמש במספריים כירורגית שיחולל תחילה חתך רוחבי ברום הבטן דרך העור, ואחריו חתך דומה דרך הצפק. החזק את קרש החיתוך במצב אנכי וחתך את אבי העורקים יורד, כך מצטבר דם למטה בבטן ולא בתוך חלל החזה.
4. Sלגדוע פתח קטן בסרעפת לשחרר ואקום. גזור לאורך הצלע -10 וה -12 שיחתוך את הסרעפת ולקבל גישה ויזואלית אל הריאות.
5. השתמש במספריים כירורגית לחתוך את העור עד קנה נשימה מעל צלעותיו אבל לעזוב את בית החזה ללא פגע. הפרד את העור מפני בית החזה. לחשוף את קנה הנשימה על ידי הסרת רקמת החיבור שמסביב, נזהר שלא לפגוע קנה הנשימה עצמו (איור 1 א).
6. לגזור פתח קטן כ 1 מ"מ הקוטר במקביל קנה נשימה החשופה טבעות הסחוסים, קרוב הגרון ככל האפשר (איור 1 ב). היזהר שלא לחתוך לחלוטין דרך קנה הנשימה.
7. קח מחט 20 G ו בעדינות להכניס את המחט מ"מ 4-5 לתוך קנה הנשימה ללא כוח נגדי (1D איור). סופו של מחט צריך להיות גלוי דרך קנה הנשימה (איור 1 ג). שימוש במלקחיים כדי לייצב את המחט בתוך קנה הנשימה. לחלופין, תפר עשוי להיות קשור Around קנה הנשימה להחזיק את המחט במקום.
   הערה: על ידי הוספה עמוקה מדי, קארינה ניתן טראומה או רק צד אחד של ריאות עלולים להיות מנופח.
8. ממלאים מזרק עם 400 μl של 37 ° C 2% agarose התכה נמוכה בטמפרטורה (נלקח ישירות מאמבט טמפרטורה קבועה). ודא קרש החיתוך בעמידה ולאט לאט להחדיר את agarose חם דרך המחט אל תוך הריאות, השתמש ~ 400 μl כדי לנפח את הריאות.
   הערה: צופה ריאות הניפוח בתוך בית החזה. אל מעל לנפח את הריאות כפי שהוא יהיה קרע.
9. לאחר הריאות מנופחות, מילוי ~ ⅔ של כלוב צלעות, לנתק את המזרק ולשמור את המחט בתוך קנה הנשימה כדי למנוע כל agarose מ דולפת.
10. יוצק כ 50 מיליליטר של 20 ° C PBS מעל הריאות המנופחות כדי לאפשר agarose בתוך הריאות להגדיר לחזק. לאט להוציא את המחט ולסגור את קנה הנשימה עם מלקחיים כדי למנוע כל אי-הקרושה agarose מ דולף.
11. לחשוף את הריאות על ידי ביצוע sternotomy ובהמשך שיחתוך את הריאות. עבור כריתה של הריאות, על מנת להחזיק את קנה הנשימה תוך חיתוך דרך קנה הנשימה לחלוטין. משוך בעדינות את קנה הנשימה, לחתוך את רקמת החיבור והוושט תוך משייכת הריאות מתוך חלל החזה עד הריאות מופרדות העכבר (איור 1E).
12. לטבול את הריאות ב RPMI-1640 חם לשטוף דם מוגזם בעדינות להפריד את האונות באמצעות מספריים מלקחיים לחתוך את הסמפונות הגבעול המרכזי 'האונות ב hilum (איור 1F).
13. מניח את האונות, עם המשטח השטוח למטה על מנת למקסם את שטח הדמיה, בעוד גם צלחת הדמיה 24 גם (1G איור). הוספת 100 μl של 37 ° C RPMI-1640 על גבי האונות. מניחים כמה 15 מ"מ שקופיות כיסוי מיקרוסקופ עגול על גבי האונות כדי למנוע ממנה צף.
14. יוצקים PBS חם לתוך הבארות שמסביב למנוע התקשורת RPMI-1640 מ EVAPנואם. הכנס את צלחת 24 גם לתוך תא אקלים equilibrated ולתחזק את אונה של הריאות ב 37 מעלות צלזיוס עם% אוויר ו -5 CO _2. הכנס את קאמרית האקלים על הבמה של המיקרוסקופ confocal.
    הערה: תערובות גז אחרות (למשל, 5% O _2, 5% CO ₂ ב N ₂ לבחון התנהגות תא בתנאים של היפוקסיה / חמצן נמוך) יכולה להיות גם נחשבת.

איור 1. פרוטוקול להכנת ריאות הדמיה לחיות. (א) חשיפה של קנה נשימה לאחר הכנה של עכבר. (ב) חיתוך קטן שנעשה במקביל קנה נשימה החשופה טבעות הסחוסים. (ג) 20 מחט G מוכנס 4-5 מ"מ לתוך קנה הנשימה. (ד) החדרה של 400 μl 2% נמוכים היתוך בטמפרטורה agarose לריאות. (E) Inflריאות ated מופרדות העכבר. (F) אונות נפרדו לאחר האינפלציה. (G) לאונות להציב גם צלחת הדמיה 24 באר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

6. רכישה וניתוח של תמונות

הערה: תמונות ניתן לרכוש עם מגוון רחב של ספינינג מיקרוסקופים confocal דיסק נתמך על ידי תוכנות שונות. בפרוטוקול זה, או μManager עם מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב מחוייט או זן עם מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב, זמין מסחרית משמש לרכישת התמונה, בעוד Imaris משמש לעריכת סרטים וניתוח.

1. לרכוש תמונות באמצעות μManager. צעד מפורט על-ידי פרוטוקול צעד לרכישת תמונות באמצעות תוכנת μManager מתואר בעבר ^18.
   אוֹ
2. לרכוש תמונותתוכנת ניתוח תמונה באמצעות כגון זן (ראה איור S1).
   1. לחץ על הכרטיסייה 'אתר', ולבחור אובייקטיבי (10x או 20x) בכלי 'נתיב האור' (איור S1A, תיבה אדומה). בהמשך לכך, לחץ על 'עיניים - DAPI' להסתכל על ערוץ CFP דרך עיני (האיור S1A, קופסא כחולה). למקם את המדגם באופן ידני באמצעות מיקרוסקופ. לחץ על 'כל Off'after הרקמה במרכז שדה הראייה.
   2. לחץ על הכרטיסייה 'רכישה' כדי להגדיר את כל הפרמטרים לרכישת התמונה.
   3. בכלי 'ערוצים', לחץ על '+' כפתור (איור S1B, תיבה אדומה). תפריט מוקפץ מופיע ולחפש את צבען (ים) הנוכחי במדגם ב 'מסד דיי' (איור S1B). בחר את הצבע ולחץ על 'הוסף'.
      הערה: התוכנית תקבע את כל המסננים להיות מותאם. ניתן למחוק לצבועעל ידי בחירה בו ואחריו לחיצה על כפתור פח האשפה (האיור S1B, תיבה צהובה).
   4. בתפריט 'מצב רכישה', להגדיר 'binning' כדי 5x5. לחץ לחיצה כפולה על ECFP בתפריט הערוצים כדי לבחור בו. מנמיכים את כוח לייזר עד 20% כך המדגם לא יהיה מולבן בעת ​​הגדרת הפרמטרים לרכישת התמונה.
   5. סמנו את התיבה 'האריחים' בקטע 'מנהל ניסוי' וכלי האריחים מופיע בקבוצת הכלי 'הרכישה רבה הממדית "(האיור S1C). לחץ על כפתור 'הגדרות מתקדמות' כדי להציג את התמונה בזמן אמת מהמצלמה. לחץ על הכפתור 'הוסף' בקטע 'ועמדות להוסיף 4 עד 6 עמדות הניסוי. להסיר עמדה, בחר מיקום כי ולחץ על כפתור פח האשפה.
   6. בקבוצת הכלי 'פרמטר הרכישה', פתח את הכלי "אסטרטגית הפוקוס ', ובחר' אבסולוטדואר קבוע Z-עמד מהרשימה נפתחת.
   7. סמן את התיבה Z-Stack במקטע 'מנהל ניסוי' והכלי-סטאק Z מופיע בקבוצת כלי 'רב מימדי רכישת' (איור S1D). לחץ לחיצה כפולה על אחת מעמדות במקטע 'הפוזיציות' ולחץ על 'בשידור חי'. הגדר באופן ידני הראשונה ולהגדיר בתפקידו האחרון של בתחום ההדמיה. הגדר את המרווח ב 4 מיקרומטר.
      הערה: התכנית תקבע את מספר הפרוסות עבור מגוון מרווח הנבחר. באופן אידיאלי, 5-7 פרוסות נוחות כדי לאפשר ויזואליזציה מספיק ורכישת תמונה מהירה.
   8. סמנו את התיבה 'סדרות עתיות' בקטע 'מנהל ניסוי'. בקבוצה הרצויה 'משך' ושעות 'מרווח' בכלי 'סדרות עתיות "שהופיעו בקבוצת כלי' רכישת רב ממדית" (איור S1E).
   9. בשנות ה Acquisition מצב 'התפריטים, להגדיר' binning 'כדי 2x2. לחץ לחיצה כפולה על fluorophore בתפריט ערוצים כדי לבחור בו ולהגביר את כוח לייזר עד 100%. לחץ 'בשידור חי' ולהתאים את 'זמן חשיפה'. חזור על פעולה זו עבור כל fluorophore.
   10. סמן את התיבה 'אפשר שמירה אוטומטית'. בחר תיקייה ולהקליד את שם הקובץ. כל התמונות רכשה יישמרו באופן אוטומטי בתיקייה זו.
   11. לחץ על 'התחלת ניסוי' בקטע 'מנהל ניסוי' כדי להתחיל רכישת התמונה.
3. לאחר רכישת תמונה, לקמפל את הנתונים הגולמיים בתוכנת Imaris. המרת תמונות .ims קבצים יכולות להתבצע התאמות. צעד מפורט על-ידי פרוטוקול צעד לגיור של קבצים, ביצוע התאמות וסרטי חיסכון באמצעות Imaris מתואר בעבר ^18.
4. בעת שמירת הסרט, להגדיר את 'מסגרת השיעור' עד 5 פריימים לשנייה (fps).

תוצאות

באמצעות מיקרוסקופ confocal ספינינג-דיסק, מערכות במודל של עכברים שונים הזרקה, במיקרו-סביבה של גרורתי ניתן דמיינו מסומנים לאורך זמן. שימוש MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; ג-FMS-EGFP במודל עכבר משולשת מהונדס, מרכיבים תאיים שונים מסומנים fluorescently (איור 2 א, סרט 1). המבנה הטיפוסי ...

Discussion

כתב יד זה מתאר שיטה מפורטת עבור הדמית vivo לשעבר חיים של גרורות ריאה בעכברי מודל של גרורות. פרוטוקול הדמיה זו מספקת להדמיה ישירה של אינטראקציות stroma תאים סרטניים דינמית מרחבית במיקרו-סביבה של הריאות. זוהי השיטה קלה ומהיר יחסית המאפשר הדמיה אמינה של גרורות ריאה במשך...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MMTV-PyMT/FVB mice	Jackson Laboratory	2374	Female mice
ACTB-ECFP/FVB mice	UCSF Werb lab		Female mice
c-fms-EGFP/FVB mice	UCSF Werb lab		Female mice
FVB mice	Jackson Laboratory	1800	Female mice
GFP+ VO-PyMT cells	UCSF Werb lab
70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated	Invitrogen	D1818	Dilute to  4mg/ml in 1 x PBS and store at -20  °C. Use 0.4 mg per animal.
10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated	Invitrogen	D22914	Dilute to  4mg/ml in 1 x PBS and store at -20  °C. Use 0.4 mg per animal.
Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647	UCSF Monoclonal antibody core		Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal.
Anesthetic			Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia
1X PBS	UCSF cell culture facility
PBS, USP sterile	Amresco INC	K813-500ML	Ultra pure grade for i.v. injection
Styrofoam platform			Will be used as dissection board
Fine scissors sharp	Fine Science Tools	14060-11
Forceps	Roboz Surgical Store	RS-5135
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn ON 30min before use
Air	UCSF
Oxygen	UCSF
Carbon dioxide	UCSF
1 mL syringe without needle	BD	309659
27 G x 1/2 needle	BD	305109	for i.v. injection
20 G x 1 needle, short bevel	BD	305178
Low-melting-temperature agarose	Lonza	50111	To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation.
RPMI-1640 medium without phenol red	Life Technologies	11835-030
24 well Imaging plate	E&K scientific	EK-42892
Glass cover slides, 15 mm	Fisher Scientific	22-031-144
Digital CO2 and temperature controller	Okolab	DGTCO2BX	http://www.oko-lab.com
Climate chamber	Okolab		http://www.oko-lab.com
Cell Observer spinning disk confocal microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Inverted microscope	Carl Zeiss Inc	Zeiss Axiovert 200M
ICCD camera	Stanford Photonics	XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal scan-head	Yokogawa Corporation	CSU-10b
Imaris	Bitplane
mManager	Vale lab, UCSF		Open-source software