מנגנון הוויסות של מספרי adipocyte למבוגרים אורגניזמים באמצעות בידול הומאוסטזיס אפופטוזיס

Summary

Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.

Abstract

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of adipocytes, which in turn induces abnormal secretion of adipokines, triggering metabolic syndromes such as obesity, dyslipidemia, hyperglycemia, hyperinsulinemia, insulin resistance and type 2 diabetes. Therefore, investigating the molecular mechanisms behind adipocyte dysregulation could help to develop novel therapeutic strategies. Our protocol describes methods for evaluating the molecular mechanism affected by hypoxic conditions of the AT, which correlates with adipocyte apoptosis in adult mice. This protocol describes how to analyze AT in vivo through gene expression profiling as well as histological analysis of adipocyte differentiation, proliferation and apoptosis during hypoxia exposure, ascertained through staining of hypoxic cells or HIF-1α protein. Furthermore, in vitro analysis of adipocyte differentiation and its responses to various stimuli completes the characterization of the molecular pathways behind possible adipocyte dysfunction leading to metabolic syndromes.

Introduction

על פי הדיווח 2014 של ארגון הבריאות העולמי, 39% מהאוכלוסייה הבוגרת בעולם סובלים מעודף משקל, ו -13% הם ¹ שמנים. בעתיד הקרוב, אנשים הסובלים מעודף משקל יהוו חלק משמעותי של אוכלוסיית הקשישים. תכונה חשובה של השמנה והזדקנות היא חוסר ויסות של שומן ביחס לתחלואה ותמותה ^2. Adipokines, חלבונים המופרשים על ידי רקמת השומן (AT), יכול לעורר התסמונת המטבולית כמו השמנה וסוכרת מסוג 2 ^3. מחלות מטבוליות נגרמות בעיקר על ידי אחסון אנרגיה מופרז טיפות השומנים של adipocytes, שתוצאתה AT הרחבה ^4. לכן עניין לקבוע את הסיבות ואת המנגנונים המולקולריים של רחבת AT כדי למצוא הזדמנויות לשלוט בו.

יתר התזונה מוביל התרחבות AT, אשר מווסתת על ידי שני אירועים: אחסון אנרגיה מוגזם לתוך טיפות השומנים של adipocytes, תהליךמוביל היפרטרופיה (גידול בגודל adipocyte), ו adipogenesis גדל, הידוע גם בשם adipocyte היפרפלזיה ^5. Adipogenesis הוא תהליך של התמיינות של תאי גזע mesenchymal מולטיפוטנטיים (MSC) לתוך adipocytes. ראשית, MSCs להתפתח preadipocytes בשלב המחויב. שנית, preadipocytes נוספת להבדיל לרכוש את התכונות של adipocytes בוגרת ופונקציונלי ^6. כמה גורמי שעתוק זוהו רגולטורים לקביעת preadipocyte, כגון חלבון אצבע אבץ 423 (Zfp423) גורם תא מוקדם B 1 (Ebf1). בעוד Zfp423 גורם התחייבות מוקדמת, Ebf1 נדרש עבור הדור של אבות adipocyte ^6. בידול מסוף נתונה לפיקוח הדוק על ידי מפל תעתיק, לפיה γ קולטן peroxisome המופעל proliferator (PPARγ) הוא הגורם ⁷ תעתיק חיוני. גורמי תעתיק מפתח נוספים הם חלבון CCAAT / מחייב המשפר (C/ EBP בני משפחה) (כלומר, C / EBPα, C / EBPβ, ו- C / EBPδ), גורמים דמויי kruppel (KLFs), חלבון מחייב אלמנט תגובה cAMP (CREB) ותגובה הצמיחה המוקדמים 20 (Krox20) ^6.

לאחרונה, הוכיח כי מפעיל חלבון-1 (AP-1) המשפחה מעורבת ^8,9 תהליך התמיינות adipocyte. מש' AP-1 נוצרה על ידי קומפלקס חלבון dimeric, מורכב Fos, יוני ו / או גורם שעתוק הפעלה (ATF) חברים. Fos הקשורות אנטיגן 1 ו -2 (FRA-1 והאח-2) מסוגלים לווסת בידול adipocyte. פרה-1 פוגעת בידול adipocyte ידי עיכוב C / EBPα ^8, ואילו adipocyte שולטת פרא-2 מחזור ^9. פרה-2 ובכך לא רק מקטין את מספר adipocyte ידי דיכוי הביטוי PPARγ2 במהלך התמיינות adipocyte, אלא גם מקטין אפופטוזיס adipocyte באמצעות דיכוי ישיר של גורמים מושרה היפוקסיה (HIFs) הביטוי. משפחת HIF הוא heteמורכבות גורם שעתוק rodimeric, מורכבת-1α HIF, HIF-2α ו-1β HIF. Heterodimers מורכבת למקטע HIF-1β חמצן רגיש HIF-α חלבון (HIF-1α או HIF-2α) ואת רגישות-חמצן ^10. במהלך normoxia, חלבונים-α HIF הם פולי-ubiquitinylated והם מושפלים לבסוף על ידי פרוטאזומים ^11. בתנאי חוסר חמצן, המתרחשים AT במהלך התרחבות, חלבונים-α HIF כבר לא hydroxylated. לכן הם הופכים הדימרים התייצב טופס עם HIF-1β הביע constitutively. הפעלת תעתיק של גנים בשליטת האלמנטים בתגובת HIF היא מעורבת בוויסות של אנגיוגנזה, מטבוליזם, ודלקת ^12. ואכן, HIF-1α מקדם AT תפקוד ידי גרימת סבילות לגלוקוז, עיכוב הוצאה אנרגטית ושימוש היקפי של שומנים בדם, כמו גם על ידי הגדלת הרמה לפטין HFD-induced ¹³ steatosis בכבד. יתר על כן, HIF-1α מסדיר adipocyte אפופטוזיס in vivo ו במבחנה ^9.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות ללימוד AT המעמד לפענח את המאפיינים המולקולריים של הומאוסטזיס adipocyte בעכברים בוגרים. זה מראה עד כמה אפופטוזיס, שגשוג והתמיינות של adipocytes in vivo ו in vitro יכול להיות מוסדר על ידי היפוקסיה. לשם כך, אנו משתמשים בעכברים עם מחיקת adipocyte הספציפית של פרה-2 שנוצרה על ידי חציית עכברים שנשאו את אללים floxed פרא-2 עם Fabp4-CreERT עכברי ^9. באמצעות Fabp4-Cre עכברי ERT, המחיקה היא adipocyte ספציפית מושרה בזריקת טמוקסיפן ^14. עבור הדגם המבוגר, זריקות הצפק תוך של טמוקסיפן מבוצעות מעל 5 ימים רצופים החל בגיל 6 שבועות. כך, העכברים חשופים דיאטה רגילה או דיאטה עתירת שומן במשך 6 שבועות לפני הניתוח מתבצע. העכברים השתמשו במחקר זה זכר התבססו על רקע C57BL6 להימנע הורמונים נשיים, כגון אסטרוגניםלעין, כדי להסדיר את חלוקת השומן בגוף ^15. שימוש אחר רקע גנטי עשויה גם לשנות את הפנוטיפ ומטבוליזם, בגלל הבדלים הקשורים למתח שומנים וניהול ^16.

פרוטוקול זה מדגים כיצד לנתח AT תחת היפוקסיה באמצעות היסטולוגיה וכיצד לכמת אפופטוזיס adipocyte, התפשטות והבחנה in vivo באמצעות פרופיל אימונוהיסטוכימיה וגן מנתח. המחקר הושלם על ידי ניסויים במבחנה, מראים כיצד לנתח בידול adipocyte ראשוני אפופטוזיס לשנות על ידי חשיפה היפוקסיה.

Protocol

מסר אתיקה: בעלי חיים הם שוכנו בתנאים סטנדרטיים ביצוע ההנחיות של חוק צער בעלי החיים הגרמנים. בעלי חיים ניזונים מודע דיאטה ומי תקן כהרצון והמשיכו עם מחזור 12 שעות יום / לילה. כל הניסויים בבעלי חיים מאושרים על ידי ועדת האתיקה המקומית.

1. ניתוח Vivo של הומאוסטזיס adipocyte ב זכרים בוגרים

1. כדי לכמת היפוקסיה in vivo, יש לקבוע תחילה את משקל הגוף של עכברים, ואז מזריקים 60 מ"ג / ק"ג משקל גוף של hydrochloride pimonidazole מוצק התוך peritoneally (למשל: להזריק 1.5 מ"ג לעכבר 25 גרם). Pimonidazole מהווה סמן היפוקסי יעיל, המהווה adducts עם קבוצות תיאול בחלבונים, פפטידים וחומצות אמינו, והוא זוהה על ידי נוגדן ספציפי.
2. קורבן עכברים ולהסיר את רפידות שומן perigonadal (איור 1).
   1. 45 דקות לאחר ההזרקה, להקריב עכברים על ידי ה- CO ₂ מחנק ו נקע בצוואר הרחם לאחר מכן.
   2. להצמיד את הגפיים של העכברים (כפי שמודגם באיור 1) ולפתוח את חלל הצפק. הסר שמאל כרית perigonadal (epididymal) שומן ממש בתוך חלל הצפק.
      הערה: כרית שומן מאוגדת יותרת האשך על ידי הכרוזים הצפק כפי שמוצגת באיור 1 (perigonadal רפידות שומן מסומנים על ידי חצים).
   3. תשמור על עצמך כדי להסיר את רקמות אשכים מפנקס השומן. לקבוע משקולות כרית שומן כדי לחשב את היחס: משקל כרית שומן (ז) לפי משקל גוף (ז).

איור 1: מיקום של רפידות שומן perigonadal בתוך חלל הבטן של עכברים. תמונה של לוקליזציה שומן perigonadal בעכברים בוגרים לאחר הקרבה. רפידות שומן Perigonadal מסומנות על ידי החצים. נא ללחוץ כאן נiew גרסה גדולה יותר של דמות זו.

3. לזהות פרופילים ביטוי גנים כמותיים, השתמש באחת כרית השומן perigonadal לבודד RNA. הערה: עד הרקמה מעובדת, דגימות רקמת חנות בתמיסת ייצוב RNA ב -80 ° C או בחנקן נוזלי.
   1. כדי homogenize כרית שומן, להוסיף את כרית השומן עד 1 מ"ל פתרון חד פאזיים של isothiocyanate guanidine ו פנול. השתמש צינורות המכילים חרוזי קרמיקה (1.4 מ"מ) כדי למחוץ את רקמת homogenizer 6,500 סל"ד (2 פעמים 20 שניות, עם 30 הפסקה שנייה).
   2. לבודד את הרנ"א כדלקמן (שיטה בשלב יחיד על ידי Chomczynski ו סאקי ^17).
      1. כדי להפריד את שלבי, להעביר כרית השומן הומוגני צינור microcentrifuge, להוסיף כלורופורם נפח 0.2 מ"ל, ללחוץ במשך 15 שניות, דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר צנטריפוגות XG 12,000 במשך 5 דקות. מעבירים את השלב מימית העליון (כ -400 μl), המכיל את הרנ"א, לתוך צינור microcentrifuge חדש. אין לכלול את ה- DNA-מכיליםשלבי ing או בשלב פנול המכילים חלבון.
      2. כדי לזרז את הרנ"א, להוסיף 1 נפח של isopropanol, לערבב דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C (אפשר גם כדי לדגור לילה -20 ° C). צנטריפוגה XG ב 12,000 במשך 10 דקות. הסר isopropanol supernatant בזהירות. שטפו פעמיים עם אתנול 75% בצעדים צנטריפוגות של XG 12,000 במשך 10 דקות.
      3. לאחר ייבוש RNA זירז עבור כ -10 דקות בטמפרטורת החדר, לפזר אותו 50 μl H ₂ O (RNase ללא). כדי להקל על זה, דגירה במשך 2 דקות ב 65 מעלות צלזיוס.
         הערה: שמור RNA באתנול 75% ב -80 ° C או בחנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.
      4. לכמת את הכנות RNA על ידי A _260/280 (מנה אופטימלית היא בין 1.8 ו -2.2) ולחשב את הריכוז ידי _260:
         
   3. כדי למנוע זיהום DNA, לעכל 1 מיקרוגרם של הכנת RNAעם 1 U DNase אני במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בהיקף של 10 μl. להשבית ב 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      הערה: שלב זה הוא אופציונלי.
   4. השתמש 10 μl של הכנת RNA המכילה RNA 1 מיקרוגרם עבור תגובת transcriptase ההפוכה כדי ליצור cDNA חד גדילים, מתאים ליישום PCR כמוני. הרכיבים והיקפן מפורטים בטבלה 1.
   5. להשתמש בשילוב PCR מאסטר לתגובה PCR כמותי בזמן אמת. כדי לקבוע שינויים מטבוליים כרית השומן שלם, השתמש פריימרים ספציפיים עבור גנים המעורבים הומאוסטזיס AT (טבלה 2) ואת התנאים PCR המפורטים בטבלה 3.
   6. ניתוח נתונים בזמן אמת PCR.
      1. הגדר את הבסיס (איור 2), בדרך כלל מחזור 1 עד 15, שבו אין שינוי אותות קרינה. תוכנת real-time PCR מנרמלת אותות קרינה ספציפיים קרינת הבסיס וכדי לצבוע התייחסות הפנימית, רוקס, וכתוצאה מכךסדר הגודל של אותות ספציפיים על ידי פריימרים, דלתא Rn (ΔRn).
      2. הגדר את הסף במסגרת שלב המעריכים של עקומת ההגברה. ההצלבה מגדירה את מחזור הסף (CT). בהתבסס על השווי CT, לחשב את הביטוי היחסי (ΔCt) והשינוי לקפל (ΔΔCt):
         
         

רְכִיב	μl נפח / תגובה
10x RT חוצץ	2.0
מערבבים 25x dNTP (100 מ"מ)	0.8
Primers 10x RT אקראי	2.0
MultiScribe הפוך transcriptase	1.0
Nuclease ללא H 2 O	4.2
1 מיקרוגרםRNA	10
תגובה לכל סה"כ	20

טבלה 1: רכיבים עם נפח בהתאמה עבור התגובה transcriptase הפוכה כדי ליצור cDNA חד-גדילי.

	שם מלא רשמי	סֵמֶל	רצף 3'-> 5'
			קָדִימָה	לַהֲפוֹך
Adipogenesis	דלתא דמוי 1 homolog (pref-1)	Dlk1	GACACTCGAAGCTCA CCTGG	GGAAGGCTGGGACGG GAAAT
	גורם תאי B מוקדם 1	Ebf1	CCACCATCGACTACGG CTTC	TCCTGGTTGTTGTGGGG catc
	אצבע אבץ חלבון 423	Zfp423	GTGCCCAGGAAGAAGA CGTA	GGCGACGTGGATCTGA ATCT
	חומצת שומן חלבון מחייב 4 (AP2)	Fabp4	TCACCTGGAAGACAGCT CCTC	AAGCCCACTCCCACTTC TTTC
	CCAAT / חלבון מחייב משפר (C / EBP), אלפא	Cebpa	AAGAGCCGCGACA AGGC	GTCAGCTCCAGCACCT TGTG
	CCAAT / חלבון מחייב משפר (C / EBP), בטא	Cebpb	TTTCGGGACTTGATGC AATC	CCGCAGGAACATCTTT AAGG
	אלמנט תגובה cAMP חלבון מחייב 1	Creb1	ACTCAGCCGGGTACT ACCAT	TTGCTGCCTCCCTGTT CTTC
	CCAAT / חלבון מחייב משפר (C / EBP), דלתא	Cebpd	CAGCGCCTACATTGAC TCCA	GTTGAAGAGGTCGGCG AAGA
	Kruppel דמוי גורם 4	Klf4	GCAGTCACAAGTCCCC TCTC	TAGTCACAAGTGTGGG TGGC
	בתגובה 2 הצמיחה הקדומה (Krox20)	Egr2	AGGCGGTAGACAAAATC CCAG	GATACGGGAGATCCAG GGGT
	גמא קולטן peroxisome מופעל proliferator	Pparg	AGAGGTCCACAGAGCTG ATTC	GATGCACTGCCTATGAGC ACTT
Lipogenesis	אצטיל-קואנזים A אלפא carboxylase	Acaca	TGGGGACCTTGTCTTCA TCAT	ATGGGCGGAATGGTCTC TTTC
	synthase חומצת שומן	Fasn	ACATCCTAGGCATCC קוּקוּ	CCGAGTTGAGCTGGGT Tagg
	Stearoyl-קואנזים A desaturase 1	Scd1	CGGGATTGAATGTTCTTG TCGT	TTCTTGCGATACACTCTG GTGC
lipolysis	containi תחום פוספוליפאז Patatin דמויng 2	Pnpla2	AAGGACCTGATGACCA CCCT	CCAACAAGCGGATGGT גאאג
ספיגת חומצות שומן	lipase lipoprotein	LPL	GTATCGGGCCCAGCAA CATTATCC	GCCTTGCTGGGGTTTTC TTCATTC
	אנטיגן CD36	CD36	GTCTTCCCAATAAGCATGT CTCC	ATGGGCTGTGATCGGA ACTG
היפוקסיה	היפוקסיה מושרה גורם 1, למקטע אלפא	Hif1a	CCTGCACTGAATCAAGAG GTGC	CCATCAGAAGGACTTGCT GGCT
	חלבון 1 תחום האנדותל PAS (ידוע גם בשם: HIF-2alpha)	Epas1	CAAGCTGAAGCTAAAG CGGC	TTGGGTGAATTCATCG gggg
	פון היפל-לינדאו מדכא גידולים	VHL	ACCGAGGTCATCTTTG GCTC	TTCCGCACACTTGGGT AGTC
	translocator גרעיני קולטן פחמימנים Aryl (ידוע גם בשם: HIF-1beta)	Arnt	TGGGTCATCTTCTCGC GGTT	TGTCCTATCTGAGCAT CGTG

טבלה 2: רשימת גנים עם רצף של פריימרים בהתאמה המשמשים לניתוח הומאוסטזיס adipocyte.

שלב			טמפרטורה (° C)	זמן (שניות: דקות)
הפעלת פולימראז		לְהַחזִיק	95	10:00
PCR	40 מחזורים	Denaturize	95	00:15
		חישול / רחבה	60	01:00
עקומת התכה			60 כדי 95	0.5 ° C / sec

טבלה 3: תנאי PCR בזמן אמת.

איור 2:. מאפייני עקומת הגברה בזמן אמת PCR אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

4. כדי לבצע ניתוח היסטולוגית של הומאוסטזיס adipocyte, השתמש כרית שומן perigonadal השנייה. אל לייבש הרקמה!
   1. תקן את כרית שומן 3.7% פורמלדהיד PBS שנאגר לילה, להטביע פרפין (פעל בהתאם להוראות תארו במקום ¹⁸⁾ וחותך את הרקמה מוטבעת לתוך 2-5 חלקים עבים מיקרומטר (מיקרומטר מקסימום 5).
   2. לקבוע את מספר adipocytes לכל שדה וגודל adipocyte מיקרוסקופ שדה בהיר לאחר hematoxylin ו eosin (H & E) מכתים:
      1. Deparaffinize סעיפים ידי שטיפת 3 פעמים במשך 5 דקות קסילן ו רעננותם בסעיף 2 פעמים במשך 2 דקות ב 100% אתנול ו -2 פעמים במשך 2 דקות באתנול 96%. לבסוף, לשטוף את הסעיף ב H המזוקק ₂ O למשך 5 דקות.
      2. הכתם עם hematoxylin, מדולל 1: 5 עם H ₂ O מזוקקים, במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לשטוף ב H ₂ O למשך 5 דקות. הכתם עם פתרון eosin (20 מ"ל 5% eosin Y / 210 מ"ל מזוקקים H ₂ O / 25 μl חומצה אצטית קרחונית) למשך 30 שניות ולשטוף שוב עם H ₂ O למשך 5 דקות.
      3. מייבשים חלקים באמצעות 96% אתנול ו 100% אתנול 2 פעמים בכל למשך 2 דקות, קסילן 3 פעמים במשך 5 דקות. הר החלק עם סוכן הרכבה נטול מים.
      4. להעריך את הסעיפים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. דוגמה מייצגת של איך לנתח adipocytes עם ImageJ 1.48v ¹⁹ מוצג באיור. 3: מספר התאים לכל אזור (מיקרומטר ^2), באזור תא (x 10 ³ מיקרומטר ² ), גודל התא (מיקרומטר).
         1. פתח את התמונה של הקטע עם 1.48v ImageJ. אם הפרמטרים של התמונה מסומנים בפיקסלים במקום יחידת אורך, להתאים את קנה המידה.
         2. בחר * קו ישר * בסרגל הכלים ולהתאים את הקו למרחק ידוע בהתייחס סרגל קנה המידה. עבור אל לנתח -> Scale Set המרחק של קו מוצג פיקסלים;. להוסיף את המרחק ידוע יחידת אורך, למשל, מיקרומטר. אשר עם אישור. הגודל של התמונה ואת הניתוח של הפרמטרים מצוינים יחידת האורך הנתונה.
         3. כדי לקבוע את הפרמטרים של adipocytes, להתאים את הסף. עבור אל תמונה -> התאם -> סף כדי לפתוח את חלון הסף. בחר את ההגדרות הבאות: שיטת קביעת ערכי סף: ברירת מחדל; צבע סף: B & W; מרחב צבע: HSB. התמונה מוצגת כעת שחור על גב לבן. התאם אתבהירות כדי לנקות adipocytes לבן לסגור חללים שחורים אינטר, כמו באיור. 3 ב.
         4. ספירת adipocyte לכל מיקרומטר ² (3E איור) עם מבחר * ריבוי נקודות * בסרגל הכלים וסמן כל תא לספור.
         5. כדי לקבוע את גודל adipocyte, בחר * * קו ישר שוב בסרגל הכלים לצייר את הקוטר של (איור 3c) adipocyte. עבור אל לנתח -> מדוד וחלון חדש יופיע, עם אורך של בקוטר מיקרומטר.
         6. כדי לקבוע את אזור adipocyte, בחר * שרביט (התחקות) כלי * ולחץ בתוך adipocyte. הקיר הפנימי של adipocyte נבחר (איור 3D) אדום. עבור אל לנתח -> מדוד וחלון חדש יופיע, עם שטח של adipocyte זה מיקרומטר ^2.
   3. לקבלת immunohistochemistry, להכין את הסעיף נוגדן ו- TDT בתיווך תיוג dUTP ביוטין ניק סוף (TUNEL) מכתים כדלקמן:
      1. Deparaffinize סעיפים ידי שטיפת 3 פעמים במשך 5 דקות קסילן ו רעננותם בסעיף 2 פעמים במשך 2 דקות ב 100% אתנול ו -2 פעמים במשך 2 דקות באתנול 96%. לבסוף, לשטוף את הסעיף ב מזוקק H ₂ O.
      2. לאחזור אנטיגן, לעכל את קטע רקמה למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם proteinase K הפתרון עובד (20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב 10 מ"מ טריס / HCl, pH 7.4-8) ולשטוף עם PBS.
   4. בצע מכתים נוגדן בתא רטוב:
      1. כדי לחסום את peroxidase אנדוגני, להשתמש במי חמצן 3% ב PBS במשך 10 דקות, עם ובהמשך שטיפת 2 פעמים במשך 5 דקות ב- PBS. כדי לחסום את הכריכה של נוגדנים נוקבים, להשתמש בסרום 10% ב PBS. השתמש בסרום של המארח של נוגדנים משני, עז במקרה זה.
      2. עבור מכתים, השתמש נוגדנים אפופטוזיס, תפוצת נשק זיהוי היפוקסיה ( לוח 4). מדולל נוגדנים ב PBS / 10% נסיוב עז. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. שטוף את הסעיפים 3 פעמים במשך 5 דקות ב- PBS.
      3. כדי לשפר את האות להשתמש נוגדנים משני biotinylated, עם דילול כמפורט בטבלה 5. לגילוי היפוקסיה, השתמש ארנב HRP מצומדות אנטי FITC כמו נוגדנים משני. דגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר. שטוף את הסעיפים 2 פעמים 5 דקות עם PBS.
         הערה: מכתים היפוקסיה עם FITC-MAb1, לדלג על שלב 1.4.4.4) ולהמשיך עם צעד 1.4.4.5).
      4. עבור כל שקופית, טרום דגירה פתרון avidin 50 μl עם 50 μl biotinylated peroxidase H במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (שיטה זו נקראת גם בתור avidin / ביוטין כתרכובת ABC) ולאחר מכן להוסיף את הסעיפים במשך 45 דקות אחר. לשטוף 2 פעמים במשך 5 דקות עם PBS.
      5. דגירת מקטעי פתרון מצע peroxidase עד מכתים להיות אינטנסיביים יותר (בין 5 עד 10 דקות). שטפו במשך 5 דקות עם מזוקקיםH ₂ O.
      6. לקבלת counterstaining, הכתם עם hematoxylin מדולל 1: 5 עם H ₂ O מזוקקים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לשטוף ב H ₂ O למשך 5 דקות.
      7. מייבשי סעיפים 96% אתנול ו 100% אתנול 2 פעמים בכל למשך 2 דקות, קסילן 3 פעמים במשך 5 דקות. חותם את החלקים עם coverslips וסוכן הרכבה נטול מים. להעריך את הסעיפים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר.
   5. לקבוע אפופטוזיס על ידי assay TUNEL אחרי הוראות היצרן:
      1. הוסף פתרון אנזים 50 μl לתוך 450 פתרון תווית μl. ואז להחיל 50 μl תערובת התגובה TUNEL על סעיפים היסטולוגית ו דגירה במשך 60 דקות ב 37 ° C באווירה humidified בחושך. שטוף את הסעיפים 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות ו הר עם הרכבת קרינה בינונית כולל DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) עבור counterstaining.
      2. להעריך בסעיף תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם 100 מגניפיקט פי יוֹן. למדידת והעמסת להשתמש גל עירור של 488 ננומטר לזהות בין 515-565 ננומטר (לייזר ירוק); DAPI שמרגש בסביבות 360 ננומטר ופולט בסביבות 460 ננומטר כאשר חייב DNA (לייזר כחול).
      3. לכמת את השכבות של DAPI ו והעמסה:
         

איור 3:. ניתוח מאפייני adipocyte בסעיפי כרית שומן תמונות סעיף של כרית שומן perigonadal של עכברי זכרים שטופלו דיאטה עתירה שומן (HFD) או דיאטה רגילה (ND) עם מיקרוסקופ שדה בהיר (א); סף מותאם לשחור ולבן (ב) ואת גודל adipocyte (אורך; ג), אזור (ד) ומספר התא adipocyte לכל מ"מ ² (ה) הם לכמת עם 1.48v ImageJ.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

	ריכוז מניות	מְהִילָה
אפופטוזיס	ביקע caspase-3 (Asp175) (5A1E) הארנב מב	1: 2,000
שִׂגשׂוּג	מטוהרים עכבר אנטי אנושי Ki-67 Clone B56 (RUO)	01:50
היפוקסיה	נוגדן אלפא HIF-1	1: 100
	FITC-MAb1	1: 100

לוח 4: נוגדנים בדילול בהתאמה המשמש מכתים immunohistological סעיפי AT.

נוֹגְדָן	מְהִילָה
אנטי biotinylatedעכבר IgG (H + L)	1: 200
IgG עכבר אנטי biotinylated (H + L)	1: 200
HRP conjugates ארנב נגד FITC	1: 100

לוח 5: נוגדנים משני בדילול המשמש מכתים immunohistological.

2. במבחנה ניתוח של הומאוסטזיס adipocyte בהשפעת היפוקסיה

1. קורבן עכברים להסיר את רקמת השומן התת עורית.
   1. להקריב את העכברים בחנק CO ₂ ו נקע בצוואר הרחם לאחר מכן.
   2. להצמיד את הגפיים של העכברים כפי שמודגם באיור 4. הפרידו את העור מהרגל, ירך ו האגף העליון ולהצמיד אותו עם מחטים כמו באיור 4. לאחר מכן להסיר את רקמת השומן התת עורית, הנמצא האחורי בבסיס של הרגליים האחוריות, המקיפים את בלוטות הלימפה מפשעתי (כפי שמוצג באיור 4, לשמאל: כרית השומן התת עוריתשעות על ידי החצים; מימין: בלוטת לימפה מפשעתי המצוין על ידי החץ).

איור 4: מיקום של רפידות שומן תת עורי. תמונה של כרית השומן התת עורית; החיצים שמאלה לציין את כרית השומן התת עורית ועל החץ הימני מציין את הלימפה מפשעתי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. לבודד תאי גזע שמקורם שומן (ADSC) כפי שתוארו לעיל ^20.
3. ADSC Seed 4,000 תאים / ² ס"מ ב Dulbecco שונה של הנשרים בינוני-שינקין של F-12 בתוספת 10% עגל בסרום נורמלי, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, B amphotericin 0.5%, 16 מיקרומטר ביוטין, 18 מיקרומטר חומצה פנטותנית ו -100 מיקרומטר חומצה אסקורבית לגדול תרבות מפגש סביב 70 עד 80%, אשר מגיע לאחר 4 עד 6 ימים של התרבות.
4. להשרות Adipogenic בידול.
   1. הסר את ADSC החסיד מפני השטח על ידי טריפסין טיפול.
      1. הסר בינוני, לשטוף עם PBS ולהוסיף פתרון טריפסין 0.025% (שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס) במשך 2 דקות (עד תאים להתנתק פני השטח). מיד להוסיף בינוני לשטוף את התאים.
   2. ספירת התאים באמצעות תא נויבאואר.
      1. החזר את מכסה הזכוכית על האזור המרכזי של חדר נויבאואר. לדלל את השעית תא 1:10 ו לטעון את החדר עם 10 μl מדוללים השעית תא. ספירת התאים ב 4 ריבועים ממוקמים בפינות, כל אחד מורכב 16 ריבועים קטנים יותר. לחשב את מספר התאים לכל מ"ל:
         
   3. ADSC Seed (כמתואר נקודת 2.2) צלחות תרבות 12 גם ולגדול תרבות מפגש סביב 70 עד 80% (הגיע לאחר 4 עד 6 ימים).
   4. להשרות adipogeבידול nic ידי הוספת אינסולין 5 מיקרוגרם / מ"ל, 1 dexamethasone מיקרומטר ו -5 מיקרומטר 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) לתרבויות. Renew המדיום כל 2 ימים. תאים יהיה להיות מובחן מלא לאחר 7 ימים.
5. כדי לנתח את בידול adipogenic, כתם עם שמן אדום O, אשר מכתים טריגליצרידים של adipocytes הבוגרת.
   הערה: העבודה חייבת להתבצע תחת במנדף!
   1. הסר בינוני, לשטוף את adipocytes בעדינות עם PBS לתקן את התאים למשך 60 דקות עם פורמלין 2 מ"ל 10%.
   2. כדי להכין פתרון מכתים שמן האדום O, לערבב 3 חלקים של פתרון המניות האדום שמן O (300 מ"ג אבקת האדום שמן O מומס 100 מ"ל 99% isopropanol) עם 2 חלקים מזוקקים H ₂ O ו דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. סנן את הפתרון עובד שמן האדום O דרך פילטר הזרקת 0.2 מיקרומטר.
      הערה: הפתרון עובד יציב במשך שעה 2.
   3. עבור מכתים O אדום שמן, להסיר את פורמלין, לשטוף adipocytes עם H ₂ O, דגירה עם 2 מ"ל 60% isopropanol במשך 5 דקות, להסיר את isopropanol ולהוסיף 2 מ"ל פתרון שמן האדום O עובד במשך 5 דקות. שוטפים את התאים עם מי ברז עד שהמים צלולים. Counterstain עם hematoxylin כמו נקודת 1.4.4.5).
   4. להעריך את הצלחות תחת מיקרוסקופ לעומת שלב עם 100 בהגדלה של פי. השומנים של adipocytes יופיעו אדום ואת הגרעינים יופיעו כחול.
6. שלב אופציונלי: להשתיק את הגן של עניין על ידי transfection עם shRNA.
   1. שנה את בינונית ומוסיפים סרום ללא בינוני.
   2. עבור transfection של adipocytes, השתמש lipofection. פעל על פי הוראות היצרן ולהשתמש 1 מיקרוגרם shRNA לכל צלחות רקמת 12 גם. לאחר תוספת של שומני DNA הקומפלקס, דגירת adipocytes במשך 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
7. כדי לנתח adipocytes נתון היפוקסיה, להשתמש תחנת עבודה היפוקסי או חממה היפוקסי לשמור על התאים בתנאי חוסר חמצן. בהתאם המחקר, ג היפוקסיהולד להיות חמצן% 0.5, 1 או 2.
   1. לנתח אפופטוזיס על ידי V Annexin שכותרתו FITC ותזרים עוקב cytometry מנתח.
      1. אסוף adipocytes עם מגרד תא רך נוספת, לשטוף עם PBS ולהוסיף 1 x 10 ⁶ תאים עד 100 μl Annexin חיץ V מחייב (10 מ"מ Hepes / NaOH, pH 7.4, 140 מ"מ NaCl; 2.5 מ"מ CaCl _2). מוסיפים את כמות Annexin V-FITC המומלץ על ידי היצרן ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
      2. עבור זרימה cytometry המדידה, להוסיף 200 μl חיץ V מחייב Annexin ו -1 מיקרומטר של counterstain גרעיני. קבע את הקרינה בערוץ ירוק וסגול. Annexin V ⁺ / גרעיני counterstain ⁺ תאים מוגדרים נמקי משני Annexin V ⁺ / counterstain גרעיני ^- תאים מוגדרים תאים אפופטוטיים (איור 5).
   2. כמותית לנתח ברמת RNA adipocyte לקבוע את הומאוסטזיס בתנאי חוסר חמצן.
      1. לְהוֹסִיףפתרון חד פאזיים 1 מ"ל של guanidine isothiocyanate פנול היטב כל ולבודד את RNA [בשיטה בשלב יחיד על ידי Chomczynski ו סאקי ¹⁷ (שלב 1.3.2)] והמשך כמו צעדים 1.3.2.1) כדי 1.3.5.2) .

איור 5: ניתוח אפופטוזיס adipocyte ידי cytometry הזרימה. מצגות העלילה Dot של FACS עבור Annexin FITC-V ו- TO-PRO-3 מכתים של adipocytes. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תוצאות

אנו מראים כיצד לקבוע הומאוסטזיס adipocyte in vivo ו במבחנה באמצעות הדוגמה של פרה-2 ^{fl / fl} עכברים Fabp4-CreERT לעומת להמלטה wild-type. פרוטוקול שלנו מגדירה כיצד ביטוי HIF עלה ב היפוקסיה מתואם עם תפקוד לקוי adipocyte כפי שצוין על ידי אפופטוזיס adipocyte מוגברת.

גודל adipocyte מוגברת ושטח בתזונה עתירת שומן (HFD) העכברים שטופלו

יתר תזונה, בין היתר, כתוצאה מכך היפרטרופיה adipocyte, הנגרמת על ידי אחסון אנרגיה מופרזת טיפות השומנים. גודל adipocyte והאזור מהווה אינדיקטור היפרטרופיה. סעיפים של כרית השומן מן הרגיל (ND; איור 6 א) ו דיאטה עתירת שומן (HFD; 6b איור) עכברים וכן quantifications של גודל adipocyte ואזור מראים בבירור היפרטרופיה adipocyte לאחר 6 שבועים של HFD, אשר מסומן על ידי גודל adipocyte מוגברת העכברים שטופלו HFD (איור 6 ג ו-ד).

היפוקסיה מוגברת ברקמת השומן (AT) של מבוגר פרא-2 ^{fl / fl} עכברים Fabp4-CreERT מוביל ברמה אפופטוזיס adipocyte HIF-1α גדל

כדי לקבוע את המצב vivo של היפוקסיה ב AT, האח-2 ^{fl / fl} עכברים Fabp4-CreERT מנותחים 6 שבועות לאחר המחיקה פרא-2 בגיל 12 שבועות לעומת להמלטה wild-type. Pimonidazole מנוהל על עכברים intraperitoneally כסמן היפוקסיה יעיל; זה לא רעיל ומסוגל להפיץ לתוך AT. Adipocytes היפוקסי ב AT in vivo מוגדרים על ידי מכתים נוגדן immunohistochemical (איור 7 א). יתר על כן, את מצב חוסר החמצן המוגבר של AT בעכברים מלווה ADIP החיובית HIF-1α גדלocytes כפי שצוין על ידי 7b איור מכתים immunohistochemical), אשר אושר על ידי כימות של רמות הביטוי HIF-1α וגנים ביעדיה ^9. בנוסף, מכתים TUNEL סעיפים AT מן פרה-2 ^{fl / fl} עכברים Fabp4-CreERT ו להמלטה מלאה (7c איור) מראה כי גדל אפופטוזיס adipocyte מתואם עם נוכחות של היפוקסיה וביטוי-1α HIF.

גברת ביטוי HIF-1α ב adipocytes הראשוני באמצעות אפופטוזיס adipocyte מושרה היפוקסיה

כדי לנתח אפופטוזיס adipocyte במבחנה, אנו משתמשים adipocytes המופק רפידות שומן תת עורי כמתואר במקום אחר ^20. כצפוי, הביטוי HIF-1α ב adipocytes הוא גדל לאחר 24 שעות של היפוקסיה (איור 8 א). כדי להמשיך לנתח פעילויות HIF-1α, רמות RNA של היעד HIFגנים כגון אינוס (synthase תחמוצת החנקן מושרה) הם לכמת ידי qPCR. איור 8b מראה כי ביטוי מוגבר של HIF-1α בתנאים היפוקסי המוביל לעליה ברמת ה- mRNA אינוס. מכיוון שאנו כבר הראינו in vivo (איור 8) כי גדל ביטוי HIF-1α ב adipocytes בקורלציה עם אפופטוזיס adipocyte גדל, אפופטוזיס מכמת גם בתרבויות חוץ גופייה על ידי מכתים Annexin V בתנאי חוסר חמצן. בקנה אחד עם הנתונים vivo ב (איור 7), רמת HIF-1α הגדילה מלווה אפופטוזיס adipocyte מוגברת הנגרמת על ידי תנאי חוסר חמצן (איור 8 ב). יתר על כן, כדי להוכיח כי אפופטוזיס מושרה-היפוקסי הוא HIF תלוי; HIF-1α או HIF-2α מושתק על ידי התערבות RNA ב adipocytes נגזר wild-type או עכברים לקוי פרא-2. אפופטוזיס adipocyte גדל משוחזר ידי השתקת HIF-1α או-2α HIF כפי שמוצג על ידי Annexin מכתים V ב איור 8b, להוכיח כי חיישן היפוקסיה-α HIF מסדיר את אפופטוזיס adipocyte.

איור 6: מתגבר גודל adipocyte ואזור בתזונה עתירת שומן (HFD) עכברים (a, b) H & E מכתים סעיפים מהפנקס שומן perigonadal של עכברי-בר זכר נמאס עם תזונה נורמלית (ND) (א) או גבוה. דיאטת -fat (HFD) (ב) במשך 6 שבועות. ברים מייצגים 500 מיקרומטר. (ג, ד) Quantifications של גודל adipocyte (ג) ואזור (ד) מהפנקס שומן perigonadal של עכברי-בר נמאס עם ND (א) או HFD (ב) במשך 6 שבועות. n = 10. הנתונים מוצגים ערכים ממוצעים כמו ± SEM. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות Student's t -test. *** P <0.0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg "Target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7: רמת HIF-1α הגברת אפופטוזיס adipocytes של מבוגר פרא-2 ^{fl / fl} עכברים Fabp4-CreERT. היפוקסיה (א) ו- HIF-1α (ב) מכתים את AT של ^fl פרא-2 זכר ^{/ fl} עכברים Fabp4-CreERT ו להמלטה שליטה גברית 6 שבועות לאחר ההזרקה טמוקסיפן. הגדלה 20X, הכנס 40X. חיצים שחורים מציינים אזורים היפוקסי ותא חיוביים-1α HIF. (ג) מכתים TUNEL ב פרא-2 ^{fl / fl} עכברים Fabp4-CreERT ו להמלטה מלאה AT 6 שבועות לאחר ההזרקה טמוקסיפן. הגדלה 20X, הכנס 40X. חיצים שחורים מצביעים תאים חיוביים TUNEL. נתון זה יש הבדל בין et לוותרal. ^9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 8:. הביטוי HIF-1α מוגברת adipocyte אפופטוזיס adipocytes העיקרית הנגרמת על ידי היפוקסיה (א) ניתוח PCR בזמן אמת של-1α HIF ויעד HIFs אינוס mRNA רמות adipocytes העיקרי להציב תאי היפוקסי ניתח בנקודות הזמן המצוין. (ב) כימות של אפופטוזיס על ידי מכתים Annexin V FACS ב adipocytes העיקרי שבודד פרא-2 ^{fl / fl} עכברים Fabp4-CreERT או בקרות wild-type טרנספקציה עם שליטה sh או פלסמיד sh נגד HIF-1α או HIF-2α והניח תחת היפוקסיה (1% O ₂₎ עבור 24 שעות. נתון זה יש הבדל בין והאח לוותר. ^{9. נתונים מוצגים ערכים ממוצעים כמו ± הניתוח סטטיסטי SD בוצע באמצעות מבחן T- של הסטודנטים. * P <0.05 ו ** P <0.01 התקבלו משמעותי. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.}

Discussion

Adipocytes מאופיין phenotypically על ידי גודלם, מספרים באזור, חושף היפרפלזיה adipocyte ו היפרטרופיה, הנגרמת על ידי אחסון אנרגיה מוגזם בשל יתר התזונה ^5. אירועים אלה המוביל dysregulation חומצות שומן ו תסמונת המטבולית לאחר מכן הם גם קובעים של מסת שומן גדלה עם חילוף חומרים משומרים, אשר גם הוא המכונה רחב שומן "בריא". לדוגמה, Kusminski et al. ²¹ הראו שעכברים עם התרחבות שומן מאסיבית להישאר בריאים מבחינה מטבולית, דבר המצביע על כך הרחבה שומן אינו קשור בהכרח התסמונת המטבולית ועליו להיות נחוש בקפידה כדי להעריך את המאפיינים של adipocytes. הרקמה השומנית (AT) ממלא תפקיד מרכזי בוויסות חילוף החומרים בגוף. AT הוא האיבר הגדול ביותר האנדוקרינית שיכול להשפיע דיסליפידמיה, טרשת עורקים, היפראינסולינמיה והיפרגליקמיה ^3. הערכת AT הומאוסטזיס ואת מ המולקולריתechanisms ויסות זה יכול לאפשר הבנה טובה יותר של הפרעות במערכת חילוף חומרים. לכן, לפרום את מנגנוני ויסות בידול adipocyte, גודל adipocyte ומסת כרית שומן יעזרו לפתח טיפול טיפולי חדש לטיפול בהפרעות להשמנה. שימוש in vivo ו שיטות במבחנה, אפשר לקבוע את התפקיד של השפעות מזון ביטוי גנים על בידול adipocyte ופעילות. כדי לקבוע את הומאוסטזיס AT, קביעת האיזון בין דיפרנציאציה adipocyte, התפשטות אפופטוזיס כפי שהוצע על ידי פרוטוקול שלנו חשובה כמו בניתוח מטבולית גלוקוז ואינסולין בתגובה ^22-24.

פרופיל ביטוי המנתח של גני המעורבים adipogenesis, lipogenesis, ליפוליזה, ספיגת חומצות שומן, היפוקסיה, אפופטוזיס ובחלוקה ב adipocytes העיקרי ו- AT הקרבי הוא שיטת תפוקה גבוהה לקבלת סקירה על הומאוסטזיס adipocyte וחוסר התפקוד האפשרי שלהם.יש לנתח מועמדים מעניינים נוספים ברמת החלבון על ידי כתם המערבי או מכתים immunohistological. כדי להשיג תוצאות אופטימליות באמצעות מערכת בזמן האמת PCR באמצעות צבעים לא-סימטרית cyanine, הריכוזים של cDNA בטווח שבין 1 ל 10 ng ועל ריכוזי פריימר האופטימליים הנעים בין 50 ל 900 ננומטר צריכים להיבדק כדי למזער הגברה ספציפית. הרכיבים הקריטיים הם פריימרים; עבור כל מחזור, עקומות ההיתוך צריך להיות מבוקרת בקפידה כדי להבטיח את הספציפיות, ובו בזמן למנוע היווצרות של הדימרים פריימר. לכן, באמצעות בקרה שלילית באות O H ₂ במקום cDNA מומלץ. יתר על כן, צבעי cyanine לא-סימטרית מסחריים זמינים ניתנים תערובות מאסטר המכילים צבע הפניה פסיבי (כגון רוקס) לספק אות ייחוס פנימית. את cDNA האות מנורמל במהלך ניתוח הנתונים לאותות רוקס לתקן תנודות האות גם ל-כן. נקודה נוספת שיש לקחת בחשבון על מנת להקים gooמערכת ד qPCR היא הבחירה של גן המשק. עבור כל תנאי, גני משק כמה משמשים, למשל, HPRT, β-תקטין, GAPDH, β-2-MG או Hsp90.

חלבוני HIF על מנת לייצב את תנאי חוסר חמצן הם רגולטורים בקביעה לא רק הישרדות adipocytes, אלא גם שינויים מטבוליים, כגון גלוקוז, סבילות לאינסולין ומטבוליזם שומנים ^11,25,26. כדי לברר אזורים היפוקסי של כרית השומן, HIF-1α נקבע בקטעים ידי אימונוהיסטוכימיה. מאז חלבוני HIF מפורקים במהירות בתוך 5 עד 10 דקות בתנאי normoxic, ההליך ואת הקיבעון של כרית השומן לניתוח היסטולוגית יש פיקוח הדוק כדי למנוע זמן חביון. לכן, כדי להבטיח היפוקסיה לא רק באמצעות מכתים HIF, pimonidazole משמש לקביעת אזורים היפוקסי של AT. Pimonidazole הוא מסוגל להפיץ לרקמות, כפי שהוא כבר הוצג בעצמות ²⁷, וביעילות לסמן אזורים היפוקסי באמצעות קשירה המכיל חלבונים תיאול ספציפי בתאי חוסר חמצן, אשר מזוהים יותר בסעיפים היסטולוגית על ידי נוגדנים ספציפיים מחייבים ^28. עם זאת, סמנים ושיטות אחרים ניתן להשתמש כדי לנתח את מסלול היפוקסיה. לדוגמה, מעורבות של hydroxylase prolyl (PHD) אנזים, אשר לגרום hydroxylation של שאריות פרולין תחת normoxia, כמו גם את פון היפל-לינדאו (VHL) חלבון, אשר מכירים prolines hydroxylated וגם להביא את-ubiquitination פולי לתווך HIF proteasomal שפלה, צריכה להיות מנותחת עבור סקירה מלאה של ^29,30 המסלול. יתר על כן, איתור בכל מקום של HIFs היה גם לקבוע את יציבות החלבון והשפלה שניתן לשנות ^31,32.

יתר על כן, התפשטות ידי Ki67 ו אפופטוזיס על ידי מכתים TUNEL נקבעים in vivo באמצעות מכתים סעיפים היסטולוגית AT. כימות של התפשטות ידי Ki67 וpoptosis ידי TUNEL או Annexin מכתים V באמצעות ניתוח תזרים cytometry מתבצעת גם ^33. הפצת נשק יכול כמובן להיות נמדדת טכניקות אחרות כגון ניתוחים של מחזור התא adipocyte, אשר אינה מקבלת מענה מדידת תאים חיוביים Ki67. יתר על כן, מחקר אפופטוזיס על ידי TUNEL ניתן להשלים על ידי FACS המנתח של V Annexin ו TOP-PR-3 אשר יקבע את הרמות של נימק מול תהליך המוות של תאי אפופטוזיס. אפופטוזיס הוא תהליך בסיסי עבור התוכנית של מוות של תאים, שהינה חשובה הומאוסטזיס AT. אכן, חוסר וויסות של אפופטוזיס adipocyte היה מעורב בעבר בתהליכי תורם להשמנה lipodystrophy ^34. יתר על כן, בשנת 2011, ואח Keuper. צמוד דלקת רקמת שומן לאפופטוזיס adipocyte. הם הראו כי מקרופאגים לאפופטוזיס ב preadipocytes ו adipocytes, אשר בתורו למשוך מקרופאגים. הגיוס של מקרופאגים מאיץ דלקת, אשר contributes כדי התסמונת המטבולית כגון סבילות לגלוקוז ואינסולין ^35. עם זאת, אפופטוזיס adipocyte הוא עדיין תופעה גרועה למדה, למרות ההשערה לאפופטוזיס adipocyte יכול להביא לפגיעה במשקל.

הפרוטוקול הנוכחי משתמש גישות immunohistochemical לחקור תופעה שונה כגון התפשטות, אפופטוזיס היפוקסיה in vivo. לכן, הרקמה הייתה קבועה עם 4% פורמלדהיד, אשר הוא שלב קריטי. זמן קיבעון רקמות מורחב מוביל לשנות של אפיטופים, אשר הופכים בלתי נגיש עבור הנוגדן. לעומת זאת, זמן קצר קיבעון מגביר את הרגישות של אפיטופים כדי ריאגנטים. הזמן האופטימלי המומלץ של קיבעון הוא 24 שעות. יתר על כן, העובי של החלקים גם משפיע על הנוגדנים מחייבים אפיטופים שלהם; עובי אופטימלי הוא בין 2 ל 5 מיקרומטר. סעיפים עבים מ -5 מיקרומטר ינתנו תוצאות חיוביות כוזבות בשל אתרי קישור גדלו. לעומת זאת, זהections יותר רזה 2 מיקרומטר מכילים פחות אתרי קישור ושטחים חיוביים אינם מוגדרים היטב. גורמים קריטיים נוסף הם הנוגדן עצמו, זמן דגירה, הריכוז ואפילו הטמפרטורה, אשר משפיע על האיכות הספציפית מחייב את אפיטופים. לכן, אימות שעת ריכוז דגירת נוגדן היא הכרחית עבור כל תנאי.

כדי להשלים את המחקר, אנו מספקים פרוטוקול בידול במבחנה adipocyte, אשר יכול להיות מורחבת על ידי טיפולים שונים, גירוי או שיתוף תרבויות. באמצעות בתרבויות adipocyte במבחנה, זה אינו ריאלי לקבוע פגמים בידול adipocyte ופונקציות. להשגת תוצאות מהימנות, כמו עבור כל התאים הראשוניים, את ההתנהגות והמראה הבריא של ADSCs ו adipocytes חשובה למדי. הגרעיניות, vacuolations cytoplasmic ו / או ניתוק הם סימנים של הידרדרות, המציין בינוני לקוי, זיהום מיקרוביאלי או הזדקנות של בפריימריזתאים. פרוטוקול זה משתמש adipocytes מבודד מן רקמת כרית שומן, בעוד הוא גם ניתן להשתמש בתאי גזע mesenchymal המבודדים מח עצם כפי שתואר על ידי פרוטוקולים אחרים ^36. האחרון כולל ובתאי סטרומה, אשר עשוי לשקף בעיות בידול נוספות המתרחשות הצעד מאוד מוקדם של בידול adipocyte, זה עלול לפספס בפרוטוקול הנוכחי שלנו. יתר על כן, ADSCs ניתן להרחיב במהירות (יותר מ -10 פעמים בתוך שבוע אחד), ו ADSCs בתרבית לטווח ארוך לאחר בקטעים מסוימים עדיין שומרים mesenchymal שלהם pluripotency ^37,38. יתרון נוסף באמצעות ADSCs הוא שאפשר לעבור אדם בקלות, מאז ADSCs ניתן לקצור מחולים ידי שאיבת שומן שהיא שיטה פשוטה פולשנית.

ליום משפיע כמה איברים אחרים בצורה האנדוקרינית, הפרוטוקול צריך להיות מורחב adipokines. Adipokines, כגון לפטין, אדיפונקטין, נמק הגידול-α גורם (TNF) אnd resistin, מופרש על ידי adipocytes ידועים בהשפעתם מחלות מטבוליות ידי שליטה חילוף החומרים של השומן, הומאוסטזיס אנרגיה אינסולין רגישות ^39. לכן, סרום וניתוחי adipocyte secretome צריכות להתבצע. במקרה של חוסר תפקוד AT, adipokines וציטוקינים פרו-דלקתיים, כגון IL-6, יכול להוביל חוסר ויסות של איברים כמו הכבד והלבלב, ושל שריר פונקציה ^4. על מנת לשלול בעיות בתפקוד איבר מערכתיים, במודלים של בעלי חיים או תרביות תאים יכולים להיבדק לתגובתם לגלוקוז גירוי ספיג.

כאן אנו מספקים פרוטוקול לניתוח המדינה היסוד של AT ו adipocytes in vivo ו במבחנה כדי לחשוף את המנגנונים המולקולריים של הומאוסטזיס adipocyte ופונקציונליות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNAlater solution	Ambion	AM7021	RNA stabilization solution
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368813
SYBR Select Master Mix	4472908
Purified Mouse Anti-Human Ki-67	BD Biosciences	550609	Clone B56 (RUO)
Purified Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO)	550609	Proliferation marker
FITC Annexin V	BioLegend	640906
Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb	Cell signalling	9664S	Clone 5A1E
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	9664	Apoptosis marker
Lipofectamine2000 Reagent	Invitrogen	11668-027
TO-PRO-3 Iodide	T3605	Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation⁄Emission: 642⁄661 nm
Mayer’s hemalum	Merck	109249	hematoxylin
pegGOLD TriFast	Peqlab	30-2030	TRIzol, single-phase solution of guanidine isothiocyanate and phenol
Percellys Ceramic Kit 1.4 mm	91-PCS-CK14	tubes containing ceramic beads (1.4 mm)
Precellys 24	91-PCS24	homogenizer
HIF-1 alpha Antibody	Pierce	PA1-16601
HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13	700505	Hypoxia marker
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein	Roche	11 684 795 001	TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL)
Eosin	Sigma	318906
DNase I Solution (1 unit/µl)	Thermo Scientific	EN0525
biotinylated anti mouse IgG (H+L)	Vector Laboratories	BA-9200
biotinylated anti mouse IgG (H+L)	BA-1000
Vectastain ABC Kit	PK-4000
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI	H-1200