Method Article
This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.
הדמיה סופר-רזולוציה אופטית עם מיקרוסקופיה תאורה מובנה (SIM) היא טכנולוגיית מפתח עבור הדמיה של תהליכים ברמה המולקולרית בתחומי הכימיה ומדעי ביו. למרות שמערכות ה- SIM מסחריות זמינות, מערכות שמיועדות מותאם אישית במעבדה יכולה להכות מערכות מסחריות, האחרונות בדרך כלל תוכננו עבור קלות שימוש ויישומים למטרות כלליות, הן מבחינת נאמנות הדמיה ומהירות. מאמר זה מציג מדריך מעמיק בבניית מערכת ה- SIM המשתמשת השתקפות פנימית מוחלטת (TIR) תאורה והוא מסוגל הדמיה במהירות של עד 10 הרץ בשלושה צבעים ברזולוציה לרמה של 100 ננומטר. בשל השילוב של ה- SIM TIRF, המערכת מספקת ניגודיות תמונה טובה יותר מאשר טכנולוגיות מתחרות. כדי להשיג מפרטים אלה, כמה אלמנטים אופטיים משמשים כדי לאפשר בקרה אוטומטית על מבנה מדינת הקיטוב המרחבי של אור התאורה לכל wav העירור הזמיןelengths. פרטים נוספים על יישום חומרה ובקרה ניתנים להשיג סנכרון בין דור דפוס אור העירור, אורך גל, מדינת קיטוב, ושליטת מצלמה תוך שימת דגש על השגת קצב פריימי רכישה מרבית. צעד אחר צעד פרוטוקול ליישור מערכת כיול מוצג והשיפור ברזולוצית השגת מקבלת תוקף על דגימות מבחן אידיאליות. יכולת הדמיה סופר-רזולוציה וידאו שער מודגם עם תאים חיים.
במהלך המחצית האחרונה עשור, מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה התבגר ועבר ממעבדות אופטיקה מומחה לידיהם של הביולוג. פתרונות מיקרוסקופ מסחרי קיימות שלוש גרסאות עיקריות להשגת ברזולוציה סופר אופטי: מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה בודדת (SMLM), מגורה מיקרוסקופיה דלדול פליטה (STED), וכן במיקרוסקופ תאורה מובנית (SIM) 1,2. SMLM כגון מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivated (PALM) המיקרוסקופי שיקום אופטי סטוכסטיים (STORM) כבר הטכניקות הנפוצות ביותר, בעיקר בשל הפשטות של ההתקנה האופטית וההבטחה של רזולוציה מרחבית גבוהה, למטה בקלות ל -20 ננומטר. עם זאת מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה באמצעות לוקליזציה מולקולה בודדת מגיע עם trade-off מהותי: מה שניתן להשיג רזולוציה מרחבית תלויה צבירת מספר מספיק של localizations fluorophore הפרט, ומכאן הגבלת רזולוציה טמפורלית. תהליך ההדמיה דינמיes בתאים חיים ולכן הופך להיות בעייתי כאחד כראוי חייב לטעום את התנועה של מבנה ריבית כדי למנוע חפצי תנועה תוך רכישת אירועי לוקליזציה מספיק זמן כדי לשחזר את תמונה. על מנת לעמוד בדרישות אלה, הפגנות SMLM התא חיות שהשיגו הגידול הנדרש בשיעורי photoswitching fluorophore על ידי הגדלת כוח העירור מאוד, וזה מוביל בתורו phototoxicity סטרס חמצונים, וכך להגביל פעמי הישרדות מדגם ו -3 הרלוונטיות ביולוגיות.
יתרון ברור של STED על שני ה- SIM SMLM הוא שזה תמונה יכולה עם ברזולוציה סופר בדגימות עבות, לפתרון לרוחב דוגמא סביב 60 ננומטר הושג פרוסות מוח organotypic בעומקים של עד 120 מיקרומטר 4. הדמיה בעומקים כאלה עם הטמעות מטרה אחת של SMLM או SIM הוא אינו עומד על הפרק, אבל הופך אפשרי עם או גיליון אור מולקולה בודדת או מיקרופון סריג גיליון אורroscopy 5. וידאו-שיעור STED גם הודגמה והשתמשה למפת ניידות שלפוחית סינפטית, למרות שעד כה זה הוגבל הדמית שדות קטנים מבט 6.
עבור יישומים בביולוגיה של התא ותגובות הרכבה עצמית מולקולרית 7 - 12 הדורשים הדמיה עם רזולוציה גבוהה הזמני על מועדים לפי שעון רבים, מיקרוסקופיה תאורה מובנה (SIM) יכול להיות מתאים-גם זה לא תלוי את המאפיינים photophysical של פלורסנט בפרט בְּדִיקָה. למרות יתרון טמון זה של ה- SIM, עד עכשיו השימוש בו היה מוגבל בעיקר הדמית תאים קבועים או תהליכים זזים לאט. זאת בשל המגבלות של מערכות SIM זמינות מסחרי: שער מסגרת הרכישה של מכשירים אלה היה מוגבל על ידי מהירות הסיבוב של לגדרות השתמשו כדי ליצור את דפוסי תאורה סינוסי הדרושים, כמו גם את קיטוב שמירת אופטיקה. הדור החדש של ה- SIM המסחרימכשירים מסוגלים הדמיה מהר אבל הם יקרים לכל אבל מתקני הדמיה מרכזיים.
פרוטוקול זה מציג מדריך לבניית מערכת SIM גמישה הדמית תהליכים מהר בדגימות דקות סמכו לפני השטח הבסיסי של תאי חיים. היא מעסיקה קרינת השתקפות הפנימית מוחלטת (TIRF) כדי ליצור דפוס תאורה חודר לא עמוק יותר מאשר כ 150 ננומטר לתוך המדגם 13 אשר בהרבה מפחית את מתוך אות רקע מוקד. הרעיון של שילוב SIM עם TIRF הוא זקן כמעט כמו SIM עצמו 14 אך לא מומש באופן ניסיוני לפני 2006 15. הראשון in vivo תמונות שהושג עם TIRF-SIM דווחו בשנת 2009 16 מסגרת חליפין השגת של 11 הרץ לדמיין טובולין ו kinesin דינמיקה, ושתי מערכות צבע TIRF-SIM הוצגו 17,18. לאחרונה, מדריך לבנייה ושימוש SIM שני-קורה צבע יחיד שלystem הוצג שמציע מסגרת בקצבים של עד 18 רץ 19,20.
את ההגדרה המוצגת כאן היא מסוגלת הדמית SIM סופר-רזולוציה של 20 הרץ בשלושה צבעים, שתיים מהם יכול להיות מופעל TIRF-SIM. המערכת כולה בנויה סביב מסגרת מיקרוסקופ הפוכה ומשתמש הבמה תרגום XY ממונע עם במה z פייזו-ומונעת. כדי ליצור את דפוסי עירור סינוסי הנדרשים TIRF-SIM, המערכת הציגה משתמשת מאפנן אור מרחבי ferroelectric (SLM). דפוסי צורמת בינארי מוצגים על SLM והצווים העקיפים ± 1 וכתוצאה מכך מסוננים, העבירו וממוקדים לזירת TIR של העדשה האובייקטיבית. משמרות השלב הכרח הסיבובים של לגדרות מוחלות על ידי שינוי תמונת SLM מוצגת. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבנות וליישר נתיב עירור כזה, מפרט את היישור של נתיב הפליטה, ומציג דוגמאות בדיקה להבטחת יישור אופטימלי. זה גם לדה סופרים לנושאים ולאתגרים מיוחדים TIRF-SIM במהירות גבוהה בדבר בקרה וסנכרון של רכיבי קיטוב.
שיקולים ואילוצים עיצוב
לפני בניית מערכת TIRF-SIM שהוצגה בפרוטוקול זה, יש אילוצי עיצוב מספר לשקול הקובעים את הבחירה של רכיבים אופטיים. כל הקיצורים של רכיבים אופטיים לעיין ב איור 1.
מאפנן אור מרחבי (SLM)
SLM ferroelectric בינארי משמש התקנה זו כפי שהוא מסוגל מיתוג דפוס תת-אלפית השנייה. SLMs Nematic Grayscale ניתן להשתמש אך אלה מציעים הקטינה באופן משמעותי פעמים מיתוג. כל או ביטול פיקסל בשלב בינארי SLM יהיה להקנות גם שלב π או 0 בקיזוז מסעיף Wavefront מטוס אירוע, ולכן אם דפוס צורם תקופתי מוצג על SLM זה יפעל כמו עקיפת שלב צורמת.
אף אוזן גרון "> סך פנימית השתקפות (TIR) כדי להשיג TIR ולהפיק שדה חלוף, זווית האירוע של קורות עירור על ממשק זכוכית המדגם חייבת להיות גדולה יותר מאשר הזווית הביקורתית . זו מגדירה את זווית האירוע המינימלי הנדרש, ומכאן גם את המרווח המרבי, או תקופה, של דפוס תאורה חלוף. זווית האירוע מקסימלית
(זווית הקבלה) היא מוגבלת על ידי הצמצם המספרי (NA) של העדשה האובייקטיבית אשר ניתן לחשב מההגדרה
. זו קובעת את דפוס המינימום מרווח השגה לפי הנוסחא אבה
המקשרת NA ואורך גל
אל מרווח דפוס המינימום
. בפועל, מטרת 1.49 NA שמן טבילת TIRF מניבה זווית מקסימלית של שכיחות של כ 79 ° ותקופת דפוס מינימום על המדגם של 164 ננומטר באמצעות גל עירור של 488 ננומטר. זוויות שני אלה מגדירות טבעת הצמצם האחורי של המטרה על הענקת המכשיר משיג הארת טיר (כלומר. טבעת TIR) ושבהם שני מוקדי העירור חייבים להיות ממוקמים במדויק וסובב בדיוק כדי ליצור כל תבנית תאורה.
שחזור תמונות TIRF-SIM נדרש לרכישת מינימום של שלוש משמרות שלב בכל סיבוב דפוס ולכן בתקופת דפוס SLM חייבת להתחלק 3 (ראה איור 1). לדוגמא, לתקופה של 9 פיקסלים לתאורת 488 ננומטר ו -12 פיקסלים 640 תאורת ננומטר. לדיון מקיף של עיצוב דפוס SLM, כולל אופטימיזציה תת פיקסלים של דפוס ריווח באמצעות לגדר טעונה, לראות את העבודה הקודמת של קנר ואחות '. 16 ו Lu-ולטר et al. 20 עמדת מוקדי העירור השנייה חייבים להיות בתוך טבעת TIR עבור כל אורכי הגל, אולם הזווית העקיפה של ההזמנות ± 1 מן SLM הוא אורך גל תלוי. לקבלת SIM הסטנדרטי, הדמית ססגוניות יכולה להיות מושגת על ידי אופטימיזציה של התקופה הצורמת עבור אורך הגל הארוך ביותר, לסבול פסד בביצועים עבור ערוצים הקצרים. עבור TIRF-SIM עם זאת, אופטימיזציה עבור אורך גל אחד אומר כי מוקדים אחרים גל כבר לא בתוך הטבעת טיר. לדוגמא, על ידי שימוש בנקודה צורמת של 9 פיקסלים מספיק כדי לספק TIRF לבניית 488 ננומטר, כמו המוקדים נמצאים 95% מהקוטר של הצמצם הלוך בתוך טבעת טיר, אבל עבור 640 ננומטר תקופה זו הייתה למקם את המוקדים מחוץ הצמצם. מסיבה זו spacings השונה דפוס פיקסל חייבת לשמש עבור כל גל עירור.
היישור של נתיב עירור TIRF-SIMהוא רגיש מאוד לשינויים קטנים בעמדת המראה dichroic (DM4 באיור 1) בגוף מיקרוסקופ, הרבה יותר מאשר ב SIM קונבנציונאלי. שימוש צריח קוביית מסנן מסתובב אינו מומלץ, במקום להשתמש במראה dichroic יחיד, רב-band, אשר נשמר בתנוחה קבועה ועוצב במיוחד עבור אורכי גל העירור בשימוש. זה חיוני כי רק במראות dichroic באיכות הגבוהה ביותר משמשים. אלה דורשים מצעים עבים של 3 מ"מ לפחות, ולעתים קרובות מיועדים "שטוח הדמיה" על ידי יצרנים. כל המצעים האחרים להוביל סטייה בלתי נסבלת ושפלת תמונת TIRF-SIM.
בקרת קיטוב
כדי להשיג TIRF-SIM זה הכרחי כדי לסובב את מדינת הקיטוב של אור העירור בתאום עם דפוס התאורה כזה שהוא נשאר azimuthally מקוטב במישור התלמיד האובייקטיבי בנוגע לציר האופטי (כלומר. s-מקוטב). מערך של אופטיקה שליטת הקיטוב יהיה תלוי האלמנט האופטי המסוים המועסק, למשל תא Pockels 21, או צלחת גל חצי בשלב סיבוב ממונע 22. בפרוטוקול זה retarder משתנה גביש נוזלי מותאם אישית (LCVR) משמש, נועדו לספק מלא גל (2π) retardance מעל טווח אורך הגל 488 עד 640 ננומטר שכן היא מאפשרת מהר (~ msec) מיתוג. אם באמצעות retarder גביש נוזלי זה הכרחי להשתמש מרכיב באיכות גבוהה: רכיבים סטנדרטיים הם בדרך כלל לא יציבים מספיק כדי לתת retardance קבוע לאורך כל אורכו של זמן חשיפת מצלמה אשר מוביל טשטוש מתוך תבנית התאורה וניגודיות אפנון נמוכה . retarders גביש נוזלי גם הטמפרטורה מאוד תלוי ודורשים מובנה בקרת טמפרטורה.
סִנכְּרוּן
הלייזרים חייבים להיות מסונכרנים עם SLM. SLMs ferroelectric בינארי מאוזן באופן פנימי על ידי היםהכישוף בין על המדינה לסירוגין המדינה. ככל שמספר הפיקסלים לפעול רק חצי צלחות גל בשני שלהם דולק או כבוי, אבל לא בזמן מיתוג interframe. לכן הלייזרים צריכים להיות מופעלים רק במצבי הפעלה / כיבוי באמצעות LED אפשר אות מ SLM למנוע הפחתה בניגוד דפוס בשל מצב הביניים של פיקסלים. אפנן acousto האופטי (AOM) יכול לחלופין לשמש תריס מהר אם הלייזרים לא יכולים להיות מווסתים באופן דיגיטלי.
בחירה של עדשות
בהתבסס על המגבלות הללו, demagnification הנדרש של המטוס SLM למטוס מדגם לייצר דפוסי תאורה הרצוי ניתן לקבוע. זה מאפשר חישוב של אורכי המוקד של שתי העדשות L3 ו L4 ב הטלסקופ תמונת הממסר ואת עדשת קבל עירור L5. במערכת זו עדשה אובייקטיבית טבילת שמן 100X / 1.49NA משמשת עם 488 ננומטר ו 640 עירור ננומטר, ולכן משתמש אורכי מוקד של 300 ו -140 מ"מימעבור L4 ו L3, ו -300 מ"מ עבור L5, נותן demagnification הכולל של 357X, שווה ערך ל גודל פיקסל SLM של 38 ננומטר על המטוס מדגם. באמצעות השילוב הזה של עדשות, SLM צורמת תקופות של 9 עבור 488 תאורת ננומטר ו -12 פיקסלים עבור 640 ננומטר לתת spacings דפוס של 172 ו -229 ננומטר על המדגם, מתאימה זוויות פגיעות של 70 מעלות ו -67 מעלות בהתאמה. עבור ממשק זכוכית-מים, את הזווית הקריטית היא 61 מעלות, ואינה תלויה באורך הגל, ולכן שני אלה spacings דפוס לאפשר עירור TIRF לשני אורכי גל. עדשה אובייקטיבית מצוידת עם צווארון תיקון שימושית עבור תיקון של אברציה כדורית שהנהיגה וריאציות עובי coverslip, או אם הפעלה על 37 מעלות צלזיוס.
שחזור תמונה
לאחר ה- SIM נתוני גלם כבר נרכשו זה עניין של מאמץ חישובים ליצור תמונות סופרות-על פתרונו תהליך בן שני שלבים. ראשית, דפוס תאורה יש לקבוע עבורכל תמונה ושנית, מרכיבי ספקטרום SIM חייבים להיות מופרדים recombined כראוי כפי להכפיל את תמיכת OTF היעילה (ראה איור 6, ריבועים).
הידיעה מדויקת של תבניות תאורה המוקרנות היא בעל חשיבות עליונה, כמו רכיבי תדר נפתר-סופר צריך להיות מעורבב בצורה מדויקת ככל האפשר כדי למנוע חפצים הנגרמים על ידי החלקים שיורית של רכיבים חופפים. אנו קובעים את דפוס תאורת פרמטרים בדיעבד מנתוני התמונה גלם ביצוע ההליך שהנהיג גוסטפסון et al. 23 בקיצור, סט של פרמטרי תאורה מתאר סינוסואידה דו ממדי מנורמל צריך למצוא עבור כל אחד דפוסי העירור
:
בְּזֹאת ו
לתאר את הניגוד השולי ואת התבנית החלה שלב של כל תמונה בנפרד מ בהתאמה. הרכיבים של וקטור הגל,
ו
, לשנות עם אוריינטציות רק שונה
של הדפוס ואת הפחית הניח להיות קבוע אחר. כדי גס לקבוע את מרכיבי וקטור גל מתאם צולב של ספקטרה תמונת גלם מבוצע, אשר הוא מעודן ידי החלת משמרות subpixel לאחד התמונות הצולבות בקורלציה כדי לייעל את החפיפה. הדבר נעשה באמצעות הכפלה של הדרגתיים שלב אמת שטח
משרי משמרת subpixel ב frequency-שטח. שים לב כדאי לקבל הערכה טובה של-הווקטור הגל טרם אמיד דפוס המעשי המוכח וזה ניתן למצוא על ידי הדמית שכבת חרוז ניאון.
כצעד המופע בין דפוסי מוזז הוא , כלומר.
, הפרדת רכיבי תדר יכול להתבצע על ידי התמרת לאורך "ציר שלב". השלב העולמי
והניגוד השולי
לאחר מכן ניתן לקבוע באמצעות רגרסיה ליניארית המורכבת של מרכיבים שונים. הרכיבים מופרדים בודדים מצורפות יחד בשימוש מסנן וינר כללית. לתיאור מפורט של שני חילוץ הפרמטר והיישום של מסנן וינר הכללית אנו מפנים את הקורא גוסטפסוןet al. 23 שם באותו האלגוריתם משמש.
1. סידור יישור נתיב העירור
2. מערך של מסובבי קיטוב
יישור 3. נתיב הפליטה
4. סנכרון כיול מערכת
ססגוניות בקוטר 100nm חרוזי ניאון הם צילמו להשוות TIRF רגיל TIRF-SIM ולכמת השיפור השגה ברזולוציה לרוחב (איור 4 א - ב). שחזור מסגרות גלם לדימויים סופר-רזולוציה בוצעה באמצעות אלגוריתמים סטנדרטיים כפי שמתואר בספרות 27,28. ניתן לראות כי TIRF-SIM בבירור יש גבוה משמעותית לרוחב ברזולוציה לעומת TIRF. פונקצית התפשטות נקודה (כוחות הביטחון הפלסטיני) של מיקרוסקופ היא מקורבת היטב על ידי הדימוי של חרוז ניאון תת עקיפה יחידה בגודל, ולכן כוחות הביטחון הפלסטיני לבין ברזולוציה ניתן לכמת על ידי התאמת פונקציות גאוס 2D ל חרוזים בודדים עבור כל אורך גל. ההחלטה המוערכת של המיקרוסקופ בהתבסס על השווי הממוצע של הערך החצי ברוחב מלא (FWHM) היא 89 ננומטר ו -116 ננומטר עבור 488 ו 640 ננומטר TIRF-SIM בהתאמה (איור 4C). זה מתאים אימפרו כפולvement ברזולוציה לרוחב לשני אורכי הגל לעומת המקרה המוגבל העקיפה התיאורטית. Fluorescently סיבי עמילואיד שכותרתו הם גם מדגם הבדיקה מצוין עבור הוכחת ברזולוציה הוכפל (איור 4D). סיבי עמילואיד נוצרו במבחנה על ידי דוגרים β עמילואיד שכותרתו עם צבעי נגזרת rhodamine 10% (עירור 488 ננומטר) עבור 1 בשבוע, ובהמשך הדמיה עם TIRF-SIM. ראה התייחסות 12 לקבלת מידע נוסף.
מבנים subcellular עם ניגודיות גבוהה כגון emGFP שכותרתו microtubules (איור 5 ב, ז) או LifeAct-GFP (איור 5D) הם אידיאליים עבור הדמיה TIRF-SIM תשואה גבוהה לעומת תמונות סופר-רזולוציה. הדמית TIRF-SIM באמצעות ההגדרה המפורטת בפרוטוקול זה מאפשרת תצפית של אוכלוסיית משנה של microtubules ממוקם בקרבת הקורטקס של התאים הבזליים, ו פילמור depolymerization microtubule יכולים בדואר לראות לאורך זמן (אנימציה איור 1). לא כל הדגימות ניתנות הדמיה עם TIRF-SIM, בפרט, דגימות ניגודיות נמוכות ללא מבנים בדידים. תאים להביע GFP cytosolic חסרים מידע ברזולוציה גבוהה מלבד בקצוות של קרום הפלזמה (איור 5F, H ו אנימציה איור 2) והם ומכאן תת אופטימלית עבור TIRF הדמיה-SIM כמו שחזורים וכתוצאה מכך הם בעצם תמונות TIRF ועליהן חפצים. בדגימות כזה, הגידול לעומת לעתים קרובות ניתן לייחס לשלב deconvolution של אלגוריתם שחזור.
בניגוד אפנון גבוה חיוני הדמית SIM מוצלחת. התמרת פורייה של התמונה המשוחזרת מאפשר הדמיה של פונקציית תמסורת אופטית SIM (OTF) (איור 6 א, הבלעה). ללא למקסם את ניגוד האפנון עבור כל כיוון ידי הבטחת azimuthal קוטבization עם מסובבי קיטוב, יש אפנון מעט מאוד מהמידע ברזולוציה גבוהה במדגם המוביל יחס אות לרעש נמוך passbands SIM. אלגוריתמי שחזור אשר להשתמש בגישה המסננת וינר סטנדרטית פשוט להגביר את רעש passbands SIM ו להניב תמונה שהיא בעצם תמונת TIRF תקן ועליהן משושה (או "חלת דבש") צלצול חפץ (איור 6 א, פנל מימין). שיפור אפשרי יכול להיות שימוש באלגוריתמים שחזור איטרטיבי 29,30 או עיוור 31,32 להפחית לכלוכים אלה בהתאם לסוג של המדגם. אנו ממליצים על השימוש של ImageJ תוסף SIMcheck כדי לבדוק את איכות נתוני SIM לפני ואחרי שיקום 33.
איור 1:. פריסה של תכנית ההתקנה הססגונית TIRF-SIM TIRF-SIM המילcroscope מורכב משלושה חלקים עיקריים, יחידת דור קרן, יחידת הקרנת דפוס, ויחידת האיתור. ביחידת הדור הקורה, שלושה לייזרים שונים מיושרים על הנתיב קרן אותו באמצעות מראות dichroic (DM1 ו DM2) וביימו באמצעות ארבעה אלמנטים אופטיים לבקרת קיטוב. ראשית, מקטב (P) מבטיח את הטוהר של המדינה קיטוב ליניארי של כל אחת קרני לייזר. השלושה האלמנטים האופטיים הבאים נדרשים כדי לסובב את הקיטוב באופן מהיר ואוטומטי כמתואר בפירוט בטקסט. לאחר מכן, שתי עדשות (L1 ו- L2) בתצורה טלסקופ להרחיב את הקרן כדי להתאים את פני השטח הפעיל של מאפנן אור המרחבים (SLM) והם מתפזרים לשלוש beamlets ידי דפוסי הצורמת בינארי החזוי של SLM (דוגמאות מוצגות אריחי 1 9). מדינת הקיטוב של האור ביחס התאורה לדפוס SLM מוצגת כחץ. טלסקופ שני (L3 ו L4) דה-מעצים את הדפוס ומציע גישת thדואר פורה מטוס של דפוס SLM. במישור זה מסכה מרחבית (SM) משמשת כדי לסנן את המרכיב המרכזי ורכיבים עקיפים לא רצויים אחרים ממבנה pixelated של SLM-החוט הפנימי שלה. לפני שתי הקורות הנותרות הם התמקדו למטוס המוקד האחורי של המטרה (OB) דרך עדשת הקבל (L5), שתי מראות dichroic (dm3 ו DM4) כלולות ב- ההתקנה. DM4 מעשים כמו מראה dichroic קונבנציונלית מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי תאורה נפרדת מן אור הפליטה. עם זאת, המראה הזה המשרה סְגַלגַלוּת בלתי נמנע במדינת הקיטוב של אור התאורה אשר ניתן לפצות על ידי dm3, מראה dichroic מן אידיאלי באותו יצווה כמו DM4. מטרת טבילת שמן TIRF יש מספיק גדול NA להשיק ישירות בשני גלי הפצת מרשם על coverslip המשתקפים לחלוטין להצמיח שדה חלוף מובני coverslip. המדגם הוא רכוב על במת תרגום xyz. איתור הוא Performed דרך אותו ואת DM4 המטרה בהולכה, בתוספת סינון נוסף על ידי מסנני פליטת bandpass, מותקן בתוך גלגל מסנן מבוקרת מחשב (EFW). לבסוף, את התמונה מוקרנת על מצלמת sCMOS ידי עדשת צינור מיקרוסקופ הפנימי (L6). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. המערך של חופפים קורות (א) דפוס צורמת SLM חלונות עם פתח עגול שימושי יישור. אם שתי אלומות שאינן חופפות גלויות על המצלמה (משמאל), אזי המיקום של מטוס המדגם חייב להיות מיקומו איטרטיבי על ידי התאמת העמדות הציריות של העדשה האובייקטיבית והמצלמה לתת נקודת תאורה עגולה בודדת (מימין). קורה להיות חופפים ב יורדr ויוצר את תבנית עירור סינוסי הנדרשים TIRF-SIM. אם הקורות מלאים אינם חופפים זה מקטין את שדה הראייה, בן תבנית ההתאבכות נוצרת. (B ו- C) הזווית המדויקת של שכיחות של קורות חשוב TIRF-SIM. אם הזווית אינה נכונה, על אחת הקורות לא יהיה בזווית הדרושה TIRF וזה גלוי לכל מי שעובר כאשר הדמיה פתרון צבע פלואורסצנטי. יש קרן אחת בזווית של שכיחות גבוהה יותר מאשר הזווית הקריטית אשר מניבה את המקום העגול, והשני לא, מה שמוביל הפס הבהיר בצד השמאל של התמונה (B). (ד) כוונון זווית המראה dm3 מבטיח הם הקורות הן אירוע באותה הזווית, וזה יכול להיות מאומת על ידי defocusing המטרה: אם מיושר כראוי, היטל XZ של ערימת z של מדגם צבע פלואורסצנטי צריך להראות שני מצטלבים באופן סימטרי קורה עם רקע זניח בביתלהתמקד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. סנכרון תלות של רכיבי מערכת השונים (א) עבור רכישת SIM מהירה, סנכרון של מרכיבי המערכת באמצעות פתרון חומרה מבוסס חיוני. (ב) בכרטיס איסוף נתונים (DAQ) אמור לשמש כמפעיל מאסטר. אות TTL מלוח DAQ נשלחת הקלט החיצוני sCMOS והשתמשה כדי לעורר את חשיפת המצלמה. תפוקת החשיפה הגלובלית המצלמה ואז מפעילה את SLM להציג דפוס צורם, ואת SLM LED אפשר פלט משמש לווסת את עירור הליזר דיגיטלי כך הליזר הוא פולט רק כאשר פיקסלים SLM נמצאים במצב "על". בעקבות החשיפה הוא משלימהטה, פלט החשיפה הגלובלי המצלמה משמש לקדם את דפוס SLM אל השלב הבא הצורם או זווית. לוח DAQ גם פלטי מתח אנלוגי אל בקר LCVR לשלוט על מצב הקיטוב הליניארי של קורה התאורה. מתח זה מופעל לאחר רכישת 3 תמונות השלב עבור כל זווית דפוס. לאחר רכישת 9 תמונות עבור אורך גל יחיד, לוח DAQ פלטי אות אל בקר הגלגל לסנן פליטה, ומתגים כדי הגל הבא. לוח DAQ חל גם z-לקזז את המדגם על ידי פלט מתח אנלוגי אל בקר פייזו z-השלב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: הדמיה TIRF-SIM של דוגמאות מבחן של 100 ננומטר ססגוניות מחרוזות fluorescently Labelled עמילואיד הסיבים. (A ו- B) השוואה לסטנדרטים TIRF לעומת שחזורים TIRF-SIM עבור 488 ננומטר ו 640 עירור ננומטר. (ג) היסטוגרמה של ברוחב מלא למחצה לכל היותר (FWHM) של גאוס מתאים את החרוזים TIRF-SIM מראה את השיפור ברזולוציה צפוי. (ד) TIRF לעומת TIRF-SIM של הסיבים-עמילואיד β שכותרתו עם 10% לצבוע נגזרת rhodamine (488 עירור ננומטר). ברי סולם = 1 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5:. TIRF-SIM תא חי הדמיה השוואת TIRF קונבנציונאלי TIRF-SIM תמונות של (A, B) microtubules (emGFP טובולין) בתא HEK293, (C, D ) אקטין פילמנטיות (LifeAct-GFP) בתא COS-7 ו- (E, F) GFP cytosolic בתא HEK293. תמונות ב B ו- F הן נקודות פעם אחת מהסרטים. באזורים בקופסאות מוצגים מוגדל (G, H). ברי סולם = 3 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6:. השפעת הקיטוב Rotator על נבנה מחדש חרוז תמונות (א) ללא שימוש מסובב קיטוב כגון LCVR, את יחס אות לרעש של SIM passbands נמוך שתוצאתה חפצה משושה אופייני SIM משוחזר תמונות (מימין), (ב) 2D-SIM, דפוסי התאורה המובנים גלויות ישירות הפורהלהפוך של תמונות הגולמיות (משמאל, תדירות מרחבית עירור מסומנת) כפי שהם נופלים בתוך הרדיוס של תמיכת OTF הפליטה, אולם TIRF-SIM, הם מחוץ תמיכת OTF ולכן לא גלוי (מימין). במקרה זה, את ניגוד אפנון הדפוס חייב להיות הוערך באמצעות בשכבה חרוזה דלילה, כפי שמתואר בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7:. תבנית בהתבסס מאפנן אור מרחבי הדור מאפשר הטמעה של שיטות הדמיה אחרות כגון SIM מולטיפוקלית (א) MSIM, סריג של כיכר pointsdisplayed על SLM (ההבלעה) מניב סריג של מוקדים מוגבלים עקיפים על תמונת המטוס. שכבה דקה של 6G rhodamine ריכוז הנמוך הוא צלם כדי visua Lize המוקדים. הדפוס מתורגם על פני המדגם (B) ואת Z- מחסנית תמונת גלם שנרכשה משוחזרת להפקת תמונה עם קטינה מחוץ מוקד אור (C). ברי סולם = 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אנימצית איור 1:. סרט סדרות עתיות של EmGFP טובולין בתא HEK293 פילמור המהיר depolymerization של emGFP שכותרתו microtubules ניתן לצפות באמצעות TIRF-SIM. תמונות שנרכשו באמצעות 50 זמן חשיפה msec לכל מסגרת גלם (450 msec לכל מסגרת SIM) במרווחים של 0.5 שניות. זמן חשיפה לשמש הוגבל על ידי הבהירות של fluorophore, לא על ידי המהירות של המצלמה או SLM. "Target =" 3988movie1.mov _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
אנימציה איור 2:. סרט סדרות עתיות של Cytosolic GFP בתא HEK293 דוגמאות עם ניגודיות נמוכה כגון זה אינם דגימות אידיאלי עבור הדמיה TIRF-SIM. זרימת קרום מדרדר ניתן לראות את התמונות TIRF אבל TIRF-SIM אינו מספק כל מידע נוסף מלבד בקצוות התא. תמונות TIRF-SIM נרכשו באמצעות 50 זמן חשיפה msec לכל מסגרת גלם (450 msec לכל מסגרת SIM) במרווחים של 5 שניות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
קובץ קוד משלימה: קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (48449_300us_1-bit_Balanced.seq3).ד / 53,988 / 48449_300us_1-bit_Balanced.seq3 "> אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_001.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.
קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_002.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.
קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_003.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.
קובץ קוד משלימה: repertoi SLM דוגמהמחדש קובץ (period9_004.bmp). אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.
קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_005.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.
קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_006.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.
קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_007.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.
קובץ קוד משלימה:. קובץ הרפרטואר SLM דוגמה (period9_008.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.
קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_009.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.
קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_mask_1.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.
קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_mask_2.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה. >
קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_mask_3.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.
קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (TIRF-SIM_example.rep) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.
קובץ קוד משלימה:. קוד דור צורם דוגמא (1 מתוך 2) (generate_gratings.m) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.
קובץ קוד משלימה: קוד הדור צורם דוגמא (2 מתוך 2) (circular_mask.m).= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53988/circular_mask.m"> אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
קובץ קוד משלימה:. קוד דוגמה לחישוב בניגוד אפנון (calculate_contrast.m) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.
שהותקנו מערכות TIRF-SIM כגון ההתקנה המפורטת בפרוטוקול זה מסוגלות הדמיה סופר-רזולוציה ססגונית במהירות גבוהה לעומת מיקרוסקופים זמינים מסחרי. היתרון הגלום של SIM כטכניקת סופר-רזולוציה הוא כי ההחלטה הזמנית אינה מוגבלת על ידי photophysics של fluorophore, בהשוואה לשיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה בודדת (SMLM) או שיטות סריקת נקודה כגון מיקרוסקופיה דלדול פליטה מאולצת ( STED). שלא כמו טכניקות אחרות אלה, SIM אינו מחייב fluorophores photoswitchable או מתכלה כך ההדמיה ססגונית היא פשוטה. מערכות TIRF-SIM ללא, כגון אופטי חתך SIM ו- SIM מולטיפוקליות בדרך כלל ניתן להשיג שיפורים ברזולוציה של פי 1.7 או פחות בפועל בניגוד הגורם של שיפור 2 דיווחו כאן, ומערכות מסחריות הן גם בדרך כלל איטי יותר ופחות גמישה מאשר מערכת המובאים בפרוטוקול זה.
"> שני הקשיים העיקריים ביישום הטכניקה הזו הם ראשית את הצורך עבור מיקום מדויק של שש קורה SIM בתוך אזור TIR של הצמצם האחורי של המטרה, מחייב הליך יישור אופטי מייגע זמן רב. שנית, לייצר בניגוד דפוס גבוה על מדגם, סיבוב הקיטוב חיוני. עבור מערכות NA 2D-SIM נמוך, סיבוב הקיטוב יכול להימנע על ידי בחירה זהירה של האוריינטציה קיטוב ליניארי, אבל זה הופך להיות בלתי אפשרי עבור TIRF-SIM 25. עבור הדמיה ססגוניות במהירות גבוהה, אלקטרו שליטת קיטוב אופטית יש צורך וזה מגדיל את מורכבות חשבון המערכת.מגבלות הטכניקה
TIRF-SIM, כמו TIRF הקונבנציונלי, מוגבל באופן טבעי תצפית של מבנים ביולוגיים ותהליכים הממוקמים בקרום תאי הבסיס שיכול להיות מואר על ידי עומק חדירת 150-200 ננומטר של שדה החלוף. בזמןSIM מצוטט לעתים קרובות להיות פחות photodamaging לתאים מאשר כל אחד STED או SMLM, הכפלת רזולוציה לרוחב עדיין להגדיל את המספר הדרוש של פוטונים על ידי לפחות פי 4 5 לעומת מיקרוסקופיה TIRF קונבנציונאלי. עבור הדמית מסגרת חליפין גבוהים עם זמני חשיפות קצרים, עליית פוטון זה מחייבת שימוש בעוצמות תאורה מוגברת. בעוד כל fluorophore יכול לשמש הדמית SIM של דגימות מרגשות קבועות או איטיים, חלבוני ניאון בהירות גבוהה או צבע סינטטי הדור הבא עם photostability המשופרת מומלצי הדמית תא חי.
למרות שיישום זה מסוגל הדמית צבע אחד מסגרת חליפי SIM העולה על 20 הרץ, הדמיה ססגונית במערכת הציגה מוגבלת על ידי זמן המעבר של גלגל מסנן פליטה הממונע. בשל גודלו של שבב המצלמה sCMOS, השימוש של אופטיקה פיצול תמונה מסנן ופליטה multiband יהיה אפשרי ולאפשר אני סימולטניmaging עם אורכי גל מרובים ללא עונש מהירות. אפשרות נוספת תהיה לסירוגין לייזרי העירור השונים ומשתמש מסנן חריץ multiband לדחות את אור העירור. השימוש SLM בינארי ferroelectric ביישום זה גם אינו אופטימלי. יעילות דיפרקציה של SLM כזה הוא נמוך מאוד, ולכן רוב לאור האירוע הוא בהשתקפות אפס הסדר, אשר סוננו על ידי מסכה מרחבית. עבור יישומים הדורשים שיעור גבוה מסגרת מאוד, מהירות הדמיה ולכן היא מוגבלת על ידי הספק של דיודות לייזר. SLM גם מציג כמה סְגַלגַלוּת בקיטוב עבור אורכי גל מן גל עיצוב 550 ננומטר שבו פיקסלים אינם פועלים כמו צלחות גל חצי אידיאליות. אמנם זה יכול להיות מתוגמל על ידי שימוש LCVR נוסף, הפתרון האידיאלי עשוי להיות השימוש בהתקן מייקרו-ראי דיגיטלי (DMD) כמחולל דפוס.
שינויים אפשריים
Prese ההתקנהnted כאן הוא גמיש ומשתנה בקלות רבה יותר מאשר מכשירים מסחריים כך שיטות הדמיה אחרות כגון 3D-SIM, SIM-2D מהר, SIM מולטיפוקליות (MSIM) ו- SIM שאינו ליניארי (NL-SIM) יכולות להיות מיושמות 21,34,35.
2D-SIM יכול להיות גם מתאים הדמיה שטוח יחסית, זז מהר מבנים כגון reticulum endoplasmic הפריפריה. חדר המיון הפריפריה טמון עמוק בתוך התא מאשר אפשר להאיר באמצעות שדה TIRF חלוף אך בשל המבנה השטוח ניתן הדמיה באמצעות-SIM 2D רגיל עם רקע זניח מחוץ לפוקוס. בנוסף, השימוש של אלגוריתמי שיקום חתך אופטיים משופרים לדכא out-of-פוקוס אור להרחיב את שימוש 2D-SIM כדי דגימות עבות אופטי, אם כי שם הכפלת רזולוציה הצירית אינה נדרשו 21.
בשנת MSIM, המדגם הוא מואר על ידי שריג דליל של מוקדי עירור 36. טיפול זה יכול להיות מיושם על ידי הסרת המסכה מרחבית (SM) והחלפתו על ידי מקטב. SLM החברה פועלת כמו אפנן משרעת. בסורגי SIM בינארי מוצגים על SLM יכולים להיות מוחלף על ידי שריג 2D של כתמים, עם הגודל של הכתמים נבחרו להיות שווה לגודל של יכולת מיקוד עקיף במישור התמונה. באיור 7 א, סריג של 4 x 4 ריבועים פיקסל מוצג על SLM (ההבלעה) אשר כאשר demagnified על המדגם מייצר מוקדים עקיפים מוגבלים של 150 x 150 ננומטר, בהתחשב בגודל פיקסל SLM הפיזי של 13.62 מיקרומטר. מוקדי העירור אז יכולים להיות מתורגמים על ידי העברת דפוס הסריג על SLM וזה חוזר על עצמו מספר פעמים על מנת להאיר את השדה כולו מבט. תמונות נרכשות לכל תפקיד דפוס תורגם בערימה היא שלאחר עיבוד להניב תמונה משוחזרת עם רזולוציה משופרת של עד בפקטור של והקטן מחוץ מוקד אור לעומת תמונת widefield המקבילה30. טיפול זה יכול להיות שימושי עבור הדמיה עבה, דגימות צפופות עבורו SIM סטנדרטי אינו מתאים עבור מבנים ניגודיות נמוכים למשל כגון תאי דם אדומים מוכתמים (איור 7C), אם כי פעם הרכישה גדלה בשל מספר הרב של מסגרות גלם נדרש לכל שדה הראיה (במקרה זה N = 168).
לבסוף, ההתקנה יכולה להיות שונה כדי לאפשר או גבוה NA ליניארי TIRF-SIM או בדוגמת הפעלה שאינו ליניארי SIM (PA NL-SIM), כפי שהוצגה לאחרונה על ידי Li et al., על ידי שימוש אובייקטיבי ultrahigh 1.7 NA או תוספת של לייזר photoactivation 405 ננומטר ואופטימיזציה זהירה של דפוסי צורמת SLM 35.
יישומים עתידיים
SIM עדיין טכניקה המתפתחת במהירות ויישומים רבים במדעי החיים יופעלו בעתיד. מהירות, רזולוציה, ושיפורים הניגודיות של הטכניקה ואת יכולת השימוש מ fluorophores תקןEAN שעבור bioimaging, מוגדר SIM להחליף מערכות מיקרוסקופ רבות קונבנציונליות, כגון פלטפורמות שדה confocal ורחבות. מערכות SIM מסחריות זמינות כבר היום עם מפרט טכני יוצא מן הכלל, עם זאת, הם מעבר להישג ידם הכספי של מעבדות מחקר רבות, ואת, באופן מכריע, הם מאבדים את הגמישות להיות משונים פותח על מנת ליישם את התפתחויות המחקר העדכני ביותר בתחום. גם אין להם את היכולת החיונית "להיות מותאמת עבור הניסוי בהישג היד", לעתים קרובות צוואר בקבוק קריטי חיתוך מחקר מדעי חי קצה. המערכת המתוארת כאן יהיה מתאים במיוחד גם ללמוד תהליכים דינמיים ליד פני התא, עבור במבחנה של מערכות bilayer מחדש, ללמוד כימיה של פני השטח של חומרים מדעי הטבע, למשל. חומרי 2D, ויישומים רבים אחרים.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של האמון Leverhulme, הנדסה המדעים הפיזיקליים מועצת המחקר [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; אלצהיימר Research UK [ערוק-EG2012A-1]; קרן Wellcome [089,703 / Z / 09 / Z] המועצה למחקר רפואי [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. אנו מודים E. Avezov ומ Lu עבור transfection של תאים LifeAct-GFP ו cytosolic-GFP בהתאמה, וו צ'ן להכנת התרבות HEK293. אנו מודים גם ק O'Holleran לסיוע עם העיצוב של המיקרוסקופ, ול 'שאו ור Heintzmann לדיונים והצעות שימושיים.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
488 nm laser | Toptica | iBeam SMART | with digital modulation |
561 nm laser | Coherent | OBIS LS | with digital modulation |
640 nm laser | Cobolt | MLD | with digital modulation |
Long-pass dichroic mirrors | Thorlabs | for combining excitation beams | |
Quad band dichroic mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | 3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube |
Quad band dichroic mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | From same batch as above, 25 x 25 mm |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-860 | |
Glan-Taylor calcite polarizers | Thorlabs | GT5-A | For alignment of LCVR |
Glan-Taylor mount | Thorlabs | SM05PM5 | |
Achromatic half wave plate | Thorlabs | AHWP05M-600 | 400-800 nm |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1/M | For HWP |
Liquid Crystal Variable Retarder | Meadowlark Optics | SWIFT | Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm. |
LCVR controller | Meadowlark Optics | D3060HV | Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders |
Achromatic quarter wave plate | Meadowlark Optics | AQM-100-0545 | |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1P/M | For QWP |
10 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC080-010-A-ML | For beam expander |
200 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC254-200-A-ML | For beam expander |
Cage XY Translators | Thorlabs | CXY1 | |
Ferroelectric spatial light modulator | Forth Dimension Displays | M0787-00249 | SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1,280 x 1,024 pixels, with driver board |
SLM mounting frame | Forth Dimension Displays | M0787-10014 | Fixed to custom built aluminium mount |
Ø50.8 mm Gimbal Mirror Mount | Thorlabs | GM200/M | For SLM mounting |
Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform | Thorlabs | XYR1/M | For SLM mounting |
Rail carrier | Newport | M-PRC-3 | For SLM mounting |
Precision Optical Rail | Newport | PRL-6 | For SLM mounting |
300 mm achromatic doublet lens | Qioptiq | G322 273 322 | f = 300 mm, 31.5 mm diameter |
140 mm achromatic doublet lens | Qioptiq | G322 239 322 | f = 140 mm, 31.5 mm diameter |
Precision XY Translation Mounts | Thorlabs | LM2XY | |
Lens Mounting Adapters | Thorlabs | SM2AD32 | For mounting 31.5 mm lenses in 2" mounts |
Translation stages | Comar | 12XT65 | Dovetail, side drive |
XY Translator with Differential Drives | Thorlabs | ST1XY-D/M | for spatial filter |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1/M | for spatial filter |
300 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC508-300-A-ML | Excitation tube lens |
Automated XY stage with Z-piezo top plate | ASI | PZ-2150-XYFT-PZ-IX71 | with MS-2000 controller |
Inverted microscope frame | Olympus | IX-71 | |
Objective lens | Olympus | UAPON100XOTIRF | 100X/1.49NA |
High speed filter wheel | Prior Scientific | HF110A | with Prior ProScan III controller |
Bandpass emission filters | Semrock | FF01-525/30, FF01-676/29 | |
sCMOS camera | Hamamatsu | ORCA Flash v4.0 | |
Stage top incubator | OKO Lab | H301-K-FRAME | For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers |
Stainless steel optical posts | Thorlabs | TR series | for mounting optical components |
Post holders | Thorlabs | PH series | for mounting optical components |
Kinematic mirror mounts | Thorlabs | KM100 | for mounting 1" mirrors |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | |
100 nm fluorescent microspheres | Life Technologies | T-7279 | Tetraspeck |
Rhodamine 6G | Sigma Aldrich | 83697-250MG | |
8 well glass bottom dishes | ibidi | 80827 | with #1.5 coverglass |
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | with #1.5 coverglass |
0.01 mm microscope reticle slide | EMS | 68039-22 | |
CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific | C10613 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved