JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

Abstract

אפיתל המעבר mesenchymal (EMT) מתאר את התהליך של האפיתל transdifferentiating לתוך mesenchyme. EMT הוא תהליך בסיסי במהלך ההתפתחות העוברית כי גם מופיע לרוב גליובלסטומה, שסבלה מגידול ממאיר במוח השכיח ביותר. EMT גם נצפה קרצינומות מרובות מחוץ למוח כולל סרטן השד, סרטן הריאות, סרטן המעי גס, סרטן קיבה. EMT קשורה מרכזי לממאירות באמצעות קידום הגירה, הפלישה והיווצרות גרורות. המנגנונים של אינדוקציה EMT אינם מובנים במלואם. כאן אנו מתארים מערכת במבחנה לבידוד סטנדרטי של תאי גזע עצביים בקליפת מוח (NSCs) ו EMT-האינדוקציה הבאה. מערכת זו מספקת את הגמישות להשתמש גם תאים בודדים או תרבות explant. במערכת זו, חולדה או עכבר עובריים NSCs המוח הקדמי מתורבתים בתווך מוגדר, נטול בסרום ואנזימים. NSCs הביע Olig2 ו Sox10, שני גורמי שעתוק שנצפתה oligodendrocתאי מבשר YTE (OPCs). באמצעות מערכת זו, אינטראקציות בין FGF-, BMP- ו TGFβ-איתות מעורבים Zeb1, Zeb2, ו Twist2 נצפו שם TGFβ הפעלה משופרת באופן משמעותי נדידת תאים, דבר המצביע על BMP- / TGFβ אינטראקציה סינרגיסטית. התוצאות מצביעות על רשת של FGF-, BMP- ו TGFβ-איתות להיות מעורב אינדוקציה ותחזוקה EMT. מערכת מודל זה רלוונטי לחקור EMT במבחנה. זה וחסכוני ומראה שחזור גבוה. זה גם מאפשר את ההשוואה של תרכובות שונות ביחס לתגובות ההגירה שלהם (מדידת מרחק כמותי), והקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות כדי לעכב או לשפר EMT (מדידה איכותית). המודל ולכן גם מתאים לבחון ספריות תרופה עבור חומרים המשפיעים EMT.

Introduction

במהלך מספר שלבים של התפתחות עוברית, תאי אפיתל לאבד הדבקות החזקה שלהם זה לזה (למשל, צומת הדוקים) ולרכוש פנוטיפ נודדת בתוך אפיתל תהליך שנקרא מעבר mesenchymal (EMT) 1. EMT נדרש להקמת סוגי תאים נוספים, כגון תאי הרכס העצבי mesenchymal, אוכלוסייה מבדלת מן neuroepithelium 2. EMT אינה הכרחית רק בשלבים עובריים אלא גם נדרש בשלבים מאוחרים יותר של החיים הבוגרים לקיים תהליכים פיזיולוגיים באורגניזם בוגר, כגון ריפוי פצעים 3 ומערכת העצבים המרכזית (CNS) התחדשות demyelinating נגעים 4.

גידולים אפיתל ידועים מחדש EMT כצעד חניכה הגירה, הפלישה גרורות, בסופו של דבר שמוביל להתפתחות הסרטן 1,3. EMT אכן קשור מרכזי כדי 1,3 הגירה חזקה. השלבים הסלולר של גonditioning, ייזום, עובר ושמירת EMT אינו מובנה במלוא וצריך לחקירה נוספת.

כאן, מערכת מודל EMT סטנדרטית במבחנה המבוססת על NSCs, עם גורמי גדילה מוגדרות ומדיה (לא בסרום ולא שימוש אנזים) מוצגת. מערכת מודל זה של רלוונטי עבור מדענים עובדים על EMT. משפחות חלבון החילזון, זב טוויסט הוכחו להיות קריטי עבור EMT הוא בפיתוח ומחלות 1. החילזון, משפחות זב טוויסט מעורבים גם במערכת הציג. המערכת מבוססת על אזור מסוים של המוח הקדמי שבדרך כלל אינו עובר מתן EMT יתרון מסוים לחקר אירועים ראשוניים במהלך אינדוקצית EMT.

מערכת המודל ניתן להחילו ללמוד EMT ב epithelia מחוץ CNS, מאז מעוררים EMT מפתח, כגון חילזון, זב וחלבונים טוויסט, מצויים גם במהלך EMT במערכות רקמות מחוץ למערכת העצבים המרכזית. במודל זהystem מאפשר בידוד סטנדרטי של NSCs מהקורטקס בפיתוח ללמוד תכונות תאי גזע בכלל EMT בפרט. באמצעות מערכת זו, אנו מבודדים EMT NSCs, מושרה ולומדים הגירה שלאחר מכן תחת השפעת FGF2 ו BMP4. הבחנו כי FGF- ו- BMP-איתות אינטראקציה עם TGFβ-איתות לקדם נדידת תאים, ובכך אימות מערכת מודל.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הנהלים כל חיה בעקבות 'מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה "(פרסום NIH, 8 המהדורה ה 2011) ואושרו על ידי ועדת צער בעלי חיים של באזל (הנחיות שוויצרי עבור טיפול ושימוש בחיות). בהנחיות אלה פרוטוקול החיה נחשב של "דרגת חומרת החיה הנמוכה ביותר".

1. הכנת בינוני הרחבה

הערה: עבודה בתנאים ספטית כסטנדרט עבור בתרבית רקמה.

  1. קח שני 15 מ"ל צינורות, ולהוסיף 5 מ"ל של L- גלוטמין ללא DMEM / F12 (1: 1) מבקבוק בינוני 500 מ"ל לתוך כל אחד משני 15 מ"ל צינורות. כדי שפופרת 15 מ"ל הראשון, להוסיף 50 מ"ג apo-transferrin אדם, 50 μl של פוטרסין 1 M המניות (0.1 מ"מ ריכוז סופי) ו -30 μl של סלניום נתרן 500 מיקרומטר המניות (הריכוז הסופי 30 ננומטר).
    1. סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק לתוך הבקבוק DMEM / F12 המקורי.
  2. כדי שפופרת 15 מ"ל השני, להוסיף 12.5 אינסולין מ"ג. לְהוֹסִיף6 - 9 טיפות של 1 M NaOH. וורטקס לפזר אינסולין לחלוטין. סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק לתוך הבקבוק DMEM / F12 המקורי.
    הערה: NaOH הוא רעיל ומאכל. יש להשתמש בכפפות מגן, מעיל, ומשקפי בטיחות.
  3. הוסף 5 מ"ל פניצילין (10,000 יחידות / מ"ל) / סטרפטומיצין (10,000 מיקרוגרם / מ"ל) / amphotericin B (25 מיקרוגרם / מ"ל) אל בקבוק בינוני DMEM / F12.
  4. הוסף 5 מ"ל של 200 מ"מ המניה L- גלוטמין מופשר טרי או oligopeptides המכילים גלוטמין (200 מ"מ dipeptide L-alanyl-L- גלוטמין) אל בקבוק בינוני DMEM / F12.
  5. נער היטב. כן 50 מיליליטר aliquots.
    הערה: בינוני הרחבה יכול להיות מאוחסן במשך 2 שבועות לפחות על 4 מעלות צלזיוס. צינורות aliquoted להראות שינויי pH פחות לעומת בינוני שמור על 500 מיליליטר בקבוקים.

2. הכנת Passaging בינוני

  1. עד 1 L Ca 2 + - ו Mg 2 + -חינם התקשורת HBSS, להוסיף 990.85 גלוקוז מ"ג (5 הריכוז הסופי מ"מ) 840.10 מ"ג NaHCO 3 (10 מ"מ ריכוז סופי). התאם ל- pH 7.3 עם HCl (1 M מלאה). סנן לעקר עם 0.2 מיקרומטר מסנן ולעשות 50 מ"ל aliquots.
    הערה: בינוני passaging יכול להיות מאוחסן במשך 4 שבועות לפחות על 4 מעלות צלזיוס.

3. הכנת גורמי גדילה

  1. הכן PBS 1x סטרילי עם 1% BSA (PBS-BSA) לבד או עם חומצה הידרוכלורית (HCl) בשעה 4 מ"מ (PBS-BSA-HCl).
    זהירות: HCl הוא מאכל רעיל דורש אמצעי בטיחות מיוחד (מעיילים, משקפי מגן, כפפות, ברדס).
  2. ממיסים 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​צמיחה פיברובלסטים אנושי רקומביננטי 2 Factor (rhFGF2) ב- PBS-BSA (10 ng / הריכוז הסופי מ"ל), 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​חלבון המוךפו"גנטי שהולך עצם אנושי רקומביננטי 4 (rhBMP4) ב- PBS-BSA (10 ng / ml הסופי ריכוז), ו -20 מיקרוגרם / מיליליטר צמיחת Transforming אנושי רקומביננטי פקטור בטא 1 (rhTGFβ1) ב- PBS-BSA-HCl (40 ng / ריכוז סופי מיליליטר).
    1. אל תסנן לעקר. כן aliquots.
      הערה: aliquots גורם גדילה ניתן לאחסן-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות 2 שנים.

4. ציפוי של צלחות תרבית תאים

  1. ממיסים 1,875 מ"ג פולי-L-ornithine (אש"ף) ב 500 מ"ל מזוקקים H 2 O להכין מלאי אש"ף 250x. סנן לעקר באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר ולעשות 2 מ"ל aliquots.
    הערה: אלה aliquots ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך 2 שנים לפחות.
  2. ממיסים 1 מ"ג פיברונקטין שור ב 1 מ"ל סטרילי-מזוקקים H 2 O להכין מלאי פיברונקטין 1,000x. לא מערבולת מכיוון שהדבר עלול להיקרש החלבון הדביק. לנער בעדינות ביד במשך 10 דקות.
    1. דגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר עם רעד מדי פעם. בדקו פירוק מוחלט. לחמם הפתרון פחות מ -37 מעלות צלזיוס במשך הפירוק המוחלט של פיברונקטין. אל תסנן לעקר.
      הערה: הפתרון עשוי להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
  3. השתמש תרבות מנות תא פלסטיק פלזמה pretreated (100 מ"מ או בגדלים אחרים כנדרשהניסוי). כדי להעריך הגירה, השתמש 35 מ"מ צלחות עם רשת 500 מיקרומטר. דגירה מנות לילה עם 2 מ"ל 1x אש"ף במשך 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס חממה בתרבית רקמה 5% CO 2. שטפו פעמיים עם 2 מ"ל 1x PBS.
  4. הוסף 2 מ"ל 1x פיברונקטין (1 מיקרוגרם / מ"ל ריכוז סופי) ו דגירה מנות למשך תקופה מינימלית של 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס חממה 2 5% CO. הסר פיברונקטין רק לפני ציפוי התאים.
    הערה: מנות מצופות פיברונקטין יכולות להיות מאוחסנות במשך 2 שבועות לפחות על 37 מעלות צלזיוס.

5. סטנדרטי Dissection והכנה של אזור קורטיקלי Subventricular (SVZ)

  1. השג עובר חולדת יום 14.5 (E14.5, ספראג-Dawley) ו E13.5 העכבר (C57BL / 6) העובר על ידי-הזדווגות מתוזמן. Mate חיות בין השעות 18:00 עד 08:00 למחרת בבוקר. בצהריים לאחר יום של ההזדווגות נחשב E0.5.
  2. להרדים את החיה בהריון עם 5% Isoflurane ו 0.8 L / זרימת חמצן דקה. בדוק תגובה על ידי דחיסה כפה עם diss חדהמלקחי שיקוף. לערוף את החיה. הימנע מחנק CO 2 כמו CO 2 משפיע גזע התאוששות התא.
  3. חזר העובר על ידי ניתוח קיסרי.
    1. מניחים חיה במצב שכיבה ולחטא פרווה עם אתנול 70%. שימוש במלקחיים כירורגיים מספריים לעשות חתך בעור בצורת V של כ -8 ס"מ בבטן התחתונה מעל הרחם. לחתוך עור רק עם פרווה, תוך שמירה על שלמות קירות שרירים.
    2. שימוש במלקחיים ומספריים טריים לחתוך את השרירים ואת הדופן השרירי בטן להיכנס הצפק.
    3. זהה את הרחם ב הצפק האחורי התחתון. הסר את הרחם ידי הפרדה חדה מן הרקמות הסובבות.
    4. שטפו את הרחם עם העוברים עם 1x PBS והמקום סטרילי ב PBS 1x קר כקרח.
    5. השתמש במספרי קנס שקצו כדי לפתוח את קירות הרחם לשחרר העוברים על ידי עובר תחת מיקרוסקופ לנתיחה (גדלת 3X, איור 1B). השתמש זוג מלקחיים כדי להסיר את הקליפות העובריות ( איור 1B). שמור עוברים במדיום הרחבת על הקרח.
    6. בדוק את השלב ההתפתחותי הנכון על ידי אטלס של מערכת העצבים עכברוש פיתוח 5. גודל העובר הנכון מוצג באיור 1 ב.
    7. בדוק בגיל המתאים עוד יותר על ידי נוכחות של תחילת היווצרות ספרתית forelimb חולדה (פל) כפי שמודגם באיור 1 א.
      ההערה: הגפיים האחוריים (HL) עדיין לא להראות הפרדת ספרות (איור 1B).
  4. לנתיחה, להעביר עוברים מנות ללא ציפוי פטרי מלא PBS 1x קר כקרח. בצע לנתיחה תחת מיקרוסקופ לנתיחה סטריאו (3X כדי 20X הגדלה) באמצעות מלקחיים בסדר autoclaved.
    הערה: צלחות פטרי למנוע התקשרות של רקמה אל פני שטח הצלחת כפי שעלול לקרות עם מנות תרבית תאי פלזמה מצופית. מחטי תיל טונגסטן חדדו או דומה הם גם מועילות עבור צעדים מסוימים של לנתיחה.
  5. הסר את עור ראש הגולגולת החל על intersection של telencephalon מתפתחות (אביב) diencephalon (DI) (איור 1B) על ידי משיכת זמנית anteriorly ו בדיעבד עם שני מלקחיים כדי לקבל גישה הצינור העצבי פיתוח (איור 1 ג).
  6. זהה את גבולות המוח התיכון למוח האחורי (MHB, ראש החץ השחור באיור 1 ב- D), הפרדת mesencephalon (MES) מן rhombencephalon. חותכים את rhombencephalon פשוט או מתחת (1D איור, חץ משולש) MHB.
    הערה: השטח תת עורית הנוספת בבית MHB מקלת הסרת עור מבלי לפגוע בצינור העצבי.
  7. לנתק את הקשר בין telencephalon / diencephalon בבסיס הגולגולת עם שלד הפנים (איור 1E). התוצאה היא האזור שכולל את telencephalon, diencephalon ואת mesencephalon (תל-DI-MES) (דמויות 1F-H).
  8. מעביר את גוש התל-DI-MES לתוך מדיום הרחבה על קרח. שמור את זה completאיליי מכוסה בינוני התרחבות צלחת פטרי ללא ציפוי. החזק את הבלוק על mesencephalon עם זוג מלקחיים כדי להימנע מלגעת telencephalon המכיל את SVZ קליפת המוח עם NSCs.
  9. חזור על שלבים 5.5 כדי 5.8 עם כל העוברים (איור 1F-H).
  10. עבר אחד TEL-DI-MES לחסום לתוך PBS 1x קר כקרח טרי. גזור לאורך הקו המקווקו mesencephalon הקדמית (איור 1F-H), הפרדת mesencephalon מן diencephalon, כפי שמוצג באיור 1 ט.
  11. הפרד את DI מהתל ידי חיתוך לאורך קווים מקווקווים באיור 1F. ראה telencephalon מבודד באיור 1J.
  12. פיצול שתי ההמיספרות telencephalic, חיתוך לאורך הקו המקווקו באיור 1J. התוצאה היא שתי ההמיספרות מופרדים כפי שמודגם באיור 1 יא.
    הערה: מחצית המוח השמאלית מוגדל באיור 1 ליטר.
  13. זהה את הכנופיה המדיאלייואיל הוד lionic (MGE, איור 2 א; *) ו יואיל הוד ganglionic לרוחב (LGE, איור 2 א; +) גלוי דרך interventriculare foramen בעתיד.
    1. בעזרת מלקחיים או מחט, לנתח לאורך קו ישר בצומת בין MGE ו- LGE ואת הקליפה הקדמית (נמלי CTX, איור 2B). חותכים קו ישר דרך הקורטקס, ההיפוקמפוס (ירך) ואת מקלעת דמית (CP). זה מפריד את הקליפה הקדמית כולל נורת חוש הריח (OB) מן תואיל הוד ganglionic (GE, דמויות 2B, C).
  14. חותכי קו ישר שני בצומת של רוממות ganglionic הזנב (CGE, האיור 2C, ד) ואת הקליפה האחורית (איור 2 ג), שוב חיתוך דרך קליפת מוח, ההיפוקמפוס מקלעת דמתה.
  15. ומיישרים את telencephalon. להסיר לחלוטין את בקוטב האחורי ואת פקעת ההרחה (איור 2 ד). לזהותאמרת קליפת המוח המכילה את ההיפוקמפוס המקלעת דמתה (איור 2 ג), כהגדרתה למעלה 6,7.
    הערה: יש ההיפוקמפוס neuroepithelium רזה יותר בקליפת המוח. המחסום מכיל כלי אדום.
    1. הפרד את שולי קליפת מוח מהקורטקס, עוזב את גודל קליפת זהה לגודל של יואיל הוד ganglionic (איור 2 ד). התוצאה היא גוש של הקורטקס (רקמת היעד) ואת תואיל הוד ganglionic (GE, איור 2 ד).
  16. תהפוך את הגוש-GE הקליפה עם חדרית (פנימי) לצד אל פני שטח הצלחת.
    הערה: המשטח החיצוני של האונה יתמודד הנסיין (האיור 2E). על פני השטח החיצוניים הם קרומי מוח הדם המכיל כלי הדם (איור 2E).
    1. הצמד את GE אל פני השטח צלחת ביד שמאל ואת לקלף את קרומי המוח את עם זוג מלקחיים בפינה הימנית (הדומיננטית) יד (איור 2F ).
      הערה: זהו הצעד התובעני ביותר מהבחינה הטכנית בגלל קרומי המוח בחום לדבוק הקורטקס. הפרדת קרומי המוח מהקורטקס הוא הקל על ידי חיתוך בקו ישר לחלוטין (לא משוננת) ב 5.13.1 צעדים 5.14.
  17. חזור על שלבים 5.12 כדי 5.16 עבור חצי הכדור השני וכל העוברים. חותך את הקליפה לאורך LGE ב מרחק של מחצית הקוטר הראשי של LGE (האיור 2G, 2H). קליפת המוח הגזורה משתרעת על שטח של 1.2 מ"מ x 2.4 מ"מ (2H איור) וכוללת שכבת SVZ / נבטיה עם NSCs.

6. הכנת תרבויות explant

  1. חותך את הקליפה לתוך explants של פחות מ -400 מיקרומטר קוטר (איור 2I). להשתמש ברשת 400 מיקרומטר (משלים איור 1) ממוקם מתחת צלחת פטרי לנתיחה לעיון (איור 2H ו 2I). להעביר את כל explants לתוך צלחת פטרי טריה עם שיתוף קרחבינוני הרחבת ld.
  2. הסר את פיברונקטין מצלחת בתרבית רקמה (שלב 4.4). אפשר לו להתייבש. הוסף 1 מ"ל של מדיום הרחבת קר במרכז צלחת 35 מ"מ עם מימד רשת של 10 מ"מ x 10 מ"מ (איור 3). אפשר המדיום כדי ליצור טיפה כדורית (איור 3).
  3. הכנס עד 8 explants למרכז של ירידה. את explants צריך להיות ממוקם באופן אידיאלי על הרשת עם לפחות מרחק 3 מ"מ בין אחד לשני לניתוח ההגירה (ראה סעיף 8).
  4. דגירת הצלחת כ 1 hr חממת תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 21% O 2, CO 5% 2) עבור התקשרות של explants. אפשר explants להתיישב ולצרף אל פני השטח מצופה פיברונקטין. אין לטלטל את המנה, מאז explants יכול לנתק ולעבור מחוץ למרכז הרשת האופטימלית.
  5. לאחר 1 דגירת שעה (37 ° C, 21% O 2, 5% CO 2), למלא את המנה כדי בהיקף כולל של מדיום הרחבה 2 מיליליטר בתוספת f הצמיחהשחקנים או חומרים של עניין לבדוק דגירה.
    הערה: גם עיכול אנזימטי, ולא בסרום או צנטריפוגה נחוץ להכנת explant. זה הוא אופטימלי עבור שלמות התא.

הכנת 7. התרבות תא בודד המל"ל

  1. לחמם את הרחבה ובינוניים passaging על 37 מעלות צלזיוס.
  2. מעבירים את חתיכות קליפת גזור (משלב 5.17) לתוך צינור 15 מ"ל עם מדיום הרחבת קר (צינורית). צנטריפוגה חתיכות הקליפה במשך 5 דקות ב 1200 x גרם. לשאוב supernatant. הוספת 200 בינוני הרחבה מחוממת מראש μl כדי resuspend את חתיכות הקליפה.
  3. הוסף 700 μl של המדיום passaging מחומם מראש ל שפופרת 15 מ"ל עם קצה P1,000 (צינורית). בעדינות resuspend הגלולה. הניחו את קצה בתחתית הצינור 15 מ"ל. בעדינות ולאט לאט לנתק את פיסות הרקמה על ידי שאיבת שלוש פעמים עם קצה P1,000.
    הערה: passaging בינוני קדם הפרדת התא נדרש, כדי למנוע את השימוש של אנזימים.
  4. אפשר הצינור לשבת במשך 30 עד 60 שניות עבור גדול חתיכות undissociated (כבדות) כדי ליישב בתחתית. תאים ניתקים יחיד יישארו supernatant. העבר על 700 μl של supernatant לצינור 15 מיליליטר טרי (צינור B).
  5. חזור על שלבי 7.3 ו -7.4 לנתק את החתיכות הגדולות.
  6. חזור על שלבי 7.3 ו -7.4 בשנית כדי לנתק את החתיכות הגדולות. להעביר את כל supernatant אל צינור 15 מיליליטר הטרי (צינור B).
  7. הוסף בינוני הרחבה כדי בהיקף כולל של 5 מ"ל. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. להעריך תאים מתים על ידי מכתים trypan הכחול.
    הערה: NSCs הקטן לסבול את הצעדים 7.2 כדי 7.6 טוב יותר מאשר תאים גדולים. מתוך 10 עוברים לצפות על 4 x 10 6 תאים עם 10 תאים מתים%.
  8. להרחבה של NSCs, צלחת 1.5 x 10 6 תאים לכל 10 ס"מ צלחת בתרבית רקמה מצופה פיברונקטין בנפח של מדיום הרחבת 8 מ"ל. להרחבה סטנדרטית, להוסיף 8 μl של מניית 1,000x rhFGF2. הוסף 8 μl rhFGF2 כל יום לשנות אותיdia פעם ביומיים.
    הערה: קליפת המוח בשלב התפתחותי זה מכיל רוב NSCs ורק מיעוט של תאים מובחנים. תאי המיעוט המובחנים אינם מגיבים לטיפול-rhFGF2 ולמות במהלך התרבות הרחבה.
  9. המעבר הרחיב NSCs ב 60% מפגש.
    1. כדי NSCs מעבר, להסיר בינוני הרחבה. לשטוף את התאים במהירות שלוש פעמים עם המדיום passaging 5 מ"ל. חכה 2 - 4 דקות. ללא Ca 2 + ו Mg 2 + התאים לנתק לאט מפני השטח, עיגול כלפי מעלה. ודא ניתוק של התאים תחת המיקרוסקופ שלב. חכו עוד כמה דקות, אם יש צורך, עד ניתוק חזותי מפני השטח הוא ציין.
      הערה: תאים בודדים תנתק לחלוטין, אבל רוב התאים עדיין ידבקו אל פני שטח הצלחת. משך דרושי ניתוק תלוי משך ציפוי פיברונקטין. ציפוי פיברונקטין קצר (12 שעות או פחות) התוצאה היא ניתוק התא מהר. בניסויים ארוכים יותר (>; 1 בשבוע) פיברונקטין ציפוי של יותר מ -24 שעות מומלץ.
  10. השתמש פיפטה 10 מ"ל כדי לנתק את התאים בעדינות מפני השטח. אסוף מדיום passaging 5 מיליליטר עם תאים ולהעביר אותו צינור 15 מיליליטר טרי. חזור עם מדיום 5 מיליליטר של passaging נוסף.
  11. לנתק את התאים בצינור 15 מ"ל על ידי pipetting למעלה ולמטה שלוש פעמים, הצבת 10 מ"ל pipet בתחתית של התחתית. לסובב את הצינור במשך 15 דקות ב 1200 XG בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant ו resuspend גלולה במדיום הרחבת 2 מ"ל. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. השתמש כחול trypan להעריך תאים מתים.
    הערה: לאחר התרחבות 60 מפגש%, מצפה 4 - 5 x 10 6 תאים עם ספירת תאים מתה בסביבות 10%.
  12. פלייט 8 x 10 5 תאים לכל צלחת 10 ס"מ עבור פסקאות נוספות.

8. הערכת הגירה

  1. להערכת הגירה, לבודד explants פי זרע סעיף 5. את explantsמנות 35 לרשת מ"מ. שעה אחת לאחר ציפוי, להוסיף FGF2 (rhFGF2). מניחים את הכלים בתוך 37 ° C חממה עבור 2 ימים.
    הערה: מצורף explant אופטימלי, למנוע העברת המנות.
  2. הסר בינוני ב -1,000 טיפ μl. הוסף 2 מ"ל של מדיום הרחבת ב -1,000 טיפ μl החל המעגל הפנימי (איור 3). פעולה זו מפחיתה מתח הפנים על explants.
  3. הוסף גורמי גדילה לבד או בשילוב כנדרש לצורך הניסוי. השתמש FGF2 / BMP4 / TGFβ1 כביקורת חיובית. הערה: בניסוי זה, 2 FGF2 μl לכל צלחת 35 מ"מ, 2 μl BMP4 ו -4 μl TGFβ1 נוספו לבד או ביחד (איור 5).
    1. להוסיף גורמים נוספים ו / או חומרים לבדיקה. שמור מנות שוב ללא שינוי במשך 2 ימים ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. קח צילומי explants על מיקרוסקופ הפוכה.
    הערה: explants Living להניב תמונות בניגוד השלב טובות יותר מאשר תאים קבועים. שניהם יכולים לשמש.
  5. עבור הגירההערכה, להשתמש בתוכנת גרפיקה המאפשרת מדידות פיקסל (למשל, פיג'י 8).
  6. מדוד את רשת הצלחת של מרחק 500 מיקרומטר בפיקסלים ולהשתמש בו כנקודת התייחסות פנימית.
  7. הגדר את המרכז של explant כנקודת התחלת הגירה. למדוד את המרחק בין המרכז של explant והקבוצה החיצונית של 10 תאים.
    הערה: כל התאים נודדים centrifugally מן explant. הם ספונטני ליצור גיליון בשולי בנסיבות שנבדקו (איור 5).

9. הערכת פלישה

  1. כן בתרבית רקמה מצופה פיברונקטין 24 גם צלחות פי פרוטוקול סעיף 4.
  2. מניח 300 μl של מדיום הרחבה חם לתוך הבאר העליונה של תאי פלישת תא. דגירה לתאי למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  3. סור בינוני ההרחבה מהבאר העליונה ומקום הקאמרי בוידן לתוך צלחת 24 גם המצופית.
  4. הוסף 500 μl של מדיום הרחבה חם עם 0.5 μl של rhFGF2 ו -0.5 μl rhBMP4 לתחתי היטב.
  5. NSCs מעבר ולספור כמתואר בסעיף 7. מעברים 1 עד 4 מתאימים.
  6. פלייט 5 x 10 5 תאים בנפח של 300 μl של מדיום הרחבה חם עם 0.3 μl של rhFGF2 ו 0.3 μl של rhBMP4 בבאר העליונה של חדר בוידן.
  7. תרבות NSCs זרעה למשך 24 שעות.
  8. להוסיף גורמים נוספים ו / או חומרים לבדיקה לתא ותרבות התאים למשך 48 אחר שעה.
    הערה: אם התאים פולשניים, הם יעברו מלמעלה גם דרך שכבת קרום המרתף אל קרקעית הבאר. תאים פולשים ייצמדו התחתון של החדר בוידן.
  9. פעל על פי פרוטוקול שסיפק היצרן. השתמש צמר גפן (כלול בערכת assay פלישה) כדי להסיר את התאים הלא-פולשני בבאר העליונה על ידי ניקוי פעמים.
  10. הסר בינוני מבארות ולהוסיף 500 בינוני הרחבת μl עםכתם הממברנה עבור תאי חיים ועם DAPI לצבוע הגרעיני על הבארות.
  11. דגירה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    הערה: הצבע ישתלב הממברנה הגרעין של התאים פולשניים, בהתאמה, אופטימלית עבור להדמיה 8. אפשרות: צבע קרום פלזמה השמט אם immunocytochemistry ססגוניות מתוכנן.
  12. סור הבינוני עם הצבעים ולשטוף פעמים עם מדיום רחב. דמיינו ולספור תאים פולשני עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כפי שהוכח בעבר 8.
    הערה: כמה תאי פולשני ייתכן מנותק מהחלק התחתון של החדר ואת ירדו אל פני השטח היטב מתחת למקום שבו הם מקלים על המשטח המצופה. עבור ניתוח מלא שכלל את התאים על פני השטח היטב.
  13. סור הבינוני ולתקן את תאי% PFA 4 טריים קר קרח למשך 10 דקות. לשטוף 3x עם 1x PBS. בצע immunocytochemistry על תאי פולשני, כפי שתואר לעיל 8-10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מערכת מודל EMT זה מבוסס על בידוד סטנדרטי של NSCs הן תאים בודדים או כמו explants מאזור מסוים של הצינור העצבי בפיתוח, הקורטקס (איורים 1 ו -2). לקבלת הערכה כמותית, explants היו זורעים ממש במרכז של צלחת תרבות הרשת 500 מיקרומטר (איור 3). Explants מהק?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

במחקר זה מערכת סטנדרטית עבור NSCs ניצול ניתוח EMT מתואר (שהעיקריים בהם פורטו משלים איור 3). הסטנדרטיזציה מבטיח שחזור (טבלה 1 ו -2). NSCs נגזרת הקליפה בפיתוח, רקמה שבדרך כלל אינו עוברת EMT. זהו יתרון לניתוח צעדים מוקדם EMT. צעדים ראשוניים EMT לא ניתן ללמוד כראוי בתא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

המחקר נתמך על ידי האוניברסיטה של ​​הקרן הלאומית למדע באזל ואת השוויצרי הקרן הלאומית למדע ידי מענק MHS ו AG (SNF IZLIZ3_157230). אנו מודים: ד"ר טניה רינלדי Burkat למתן תשתית בנדיבות; כל חברי הקבוצה Bettler לדיונים והערות. אנו מודים גרהרד Dorne (Leica Microsystems, שוויץ) עבור התקנה מקצועית המוסמכת של מצלמת וידאו HD MC170 המלאה (Leica Microsystems, שוויץ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BMP4, rhBMP4RnD Systems 314-BP-01M
Bovine pancreas insulinSigma I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assayCell BiolabsCBA-11024 well plate system
Cell culture dish with gridIbidi 500 mm dish, 35 mm80156
CellMask OrangeLife TechnologiesC10045Plasma membrane dye, use at 1:1,000.
DAPILifeTechnologiesD1306Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottleGibco Invitrogen21331-020
FGF2, rhFGF2RnD Systems233-FB-01M
Fibronectine, bovineSigma F4759
Glutamax supplement Gibco Invitrogen 35050-061
Graphics software with pixel measurement featureFijifiji.sc/Fijiversion 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS mediaSigma H9394
Human apo-TransferrinSigmaT1147Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamineGibco Invitrogen 25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibodyGenetexGTX26142Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibodyProvided by Hirohide TakebayashPersonal stockUse at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/FungizoneGibco Invitrogen 15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibodyAcrisDM3614PUse at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithineSigma P3655
PutrescineSigma P5780Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium seleniteSigma S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibodyMillipore ChemiconAB5774Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1RnD Systems240-B-010
Uncoated Petri dishesFalcon Corning351029

References

  1. Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
  2. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
  3. Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14(2015).
  4. Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
  5. Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. Atlas of the developing rat nervous system. , 2nd edn, Academic Press. (1994).
  6. O'Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
  7. O'Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
  8. Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
  9. Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
  10. Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
  11. Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
  12. Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
  13. Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
  14. Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
  15. Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
  16. Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
  17. Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
  18. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
  19. Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
  20. Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
  21. Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
  22. Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
  23. Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
  24. Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
  25. Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
  26. McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763(2014).
  27. Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
  28. Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
  29. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  30. McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
  31. Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
  32. Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
  33. Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
  34. Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment - migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

114mesenchymalSnail1FGF2BMP4TGF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved