זמן לשגות Extended הדמיה Intravital של Dynamics תאיים בזמן אמת ב microenvironment הגידול

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ multiphoton לבצע הדמית הזמן לשגות מורחבת של אינטראקציות רבות-תאי בזמן אמת, in vivo ברזולוצית תא בודד.

Abstract

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

Introduction

הפצת תאים סרטניים מגידול החלב הראשוני הוכחה לערב תאים סרטניים רק לא, אבל לארח תאי סטרומה כוללים מקרופאגים ותאי האנדותל. יתר על כן, בכלי הדם של הגידול הוא לא נורמלי עם חדירות מוגברת ^1. לפיכך, קביעת האופן שבו תאים סרטניים, מקרופאגים ותאי האנדותל אינטראקציה לתווך חדירות כלי הדם ואת intravasation תאים סרטניים ב במיקרו-סביבה של הגידול הראשוני הוא חשוב עבור גרורות הבנה. הבנת קינטיקה של חדירות כלי דם, intravasation תאים סרטניים ואת מנגנון האיתות הבסיסי של אינטראקציות רבות-תאי ב microenvironment הגידול יכול לספק מידע חיוני בדבר ההתפתחות והמנהל של טיפולים אנטי סרטניים.

האמצעי העיקרי של לימוד חדירות כלי הדם הגידול in vivo כבר למדידת צבעים extravascular כגון אוונס ² כחול, dextrans משקל מולקולרי גבוה (155 KDA)³ ו fluorophore או חלבונים מצומדות radiotracer (כולל אלבומין) ⁴ בנקודות זמן קבוע לאחר ההזרקה של צבע. התקדמויות מיקרוסקופיה, במודלים של בעלי חיים ו צבעי ניאון אפשרו הדמיה של תהליכים תאיים ו חדירות כלי הדם בבעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ intravital ^5.

הדמיה חייה עם רכישת תמונות סטטיות, או רצפי זמן לשגות קצר על מספר נקודות זמן אינה מאפשרת ההבנה המלאה של אירועים דינמיים במייקרו-הסביבה של גידול ^6,7. אכן, רכישת תמונה סטטית במשך 24 שעות הראו כי בכלי הדם של הגידול הוא דולף, אולם הדינמיקה של חדירות כלי הדם לא נצפתה ^6. לפיכך, זמן לשגות הדמיה רציפה המורחבת עד 12 שעות לוכדת את קינטיקה של אירועים דינמי במיקרו-סביבה של הגידול.

פרוטוקול זה מתאר את השימוש multiphot זמן לשגות המורחבתעל מיקרוסקופיה intravital ללמוד אירועים רב-תאיים דינמי במיקרו-סביבה של הגידול. סוגי תאים מרובים במיקרו-סביבה של הגידול מסומנים עם צבעי בזריקות או באמצעות חיות טרנסגניות להביע חלבוני ניאון. באמצעות קטטר וריד זנב צבעי כלי דם או חלבונים ניתן להזריק לאחר תחילת הדמיה לרכוש נתונים הקינטית של אירועים רבים-תאי ב microenvironment הגידול. עבור הדמית תא חי גידול החלב חשוף תוך הכנת הכירורגית של דש עור. תמונות נרכשות עבור עד 12 שעות באמצעות מיקרוסקופ multiphoton מצויד צינורות מכפיל מרובים (PMT) גלאי ^8. באמצעות מסננים מתאימים, אלגוריתם חיסור מאפשרת 4 גלאי PMT לרכוש 5 אותות ניאון במיקרו-סביבה של הגידול בו זמנית ^9. מיקרוסקופיה intravital multiphoton ברזולוציה גבוהה לוכדת הדמיה ברזולוציה תא בודד של אינטראקציות גידולים stroma ב במיקרו-סביבה של הגידול, מה שמוביל טוב understanding של חדירות כלי הדם תאים סרטניים intravasation ^10-13. באופן ספציפי, חשף הדמית intravital מורחב מקומי מאוד, אירועים חדירים כלי דם חולפים המתרחשים באופן סלקטיבי באתרים של אינטראקציה בין תאים סרטניים, מקרופאג ו תא האנדותל (מוגדר כגידול microenvironment של גרורה, TMEM ^{14) 13.} יתר על כן, intravasation תאים סרטניים מתרחש רק TMEM והוא במרחב ובזמן בקורלציה עם חדירות כלי דם ^13. ברזולוציה תא בודד של הדינמיקה של האירועים הללו התאפשרה באמצעות מיקרוסקופיה multiphoton זמן לשגות המורחבת של תאים שכותרתו fluorescently ב במיקרו-סביבה של הגידול.

Protocol

כל ההליכים המתוארים חייב להתבצע בהתאם להנחיות והתקנות לשימוש בעלי חיים בעלי חוליות, כולל אישור מראש על ידי ע"ש אלברט איינשטיין טיפול בבעלי חיים מוסדיים לרפואה ועדת שימוש.

1. גידולים יצירת שכותרתו fluorescently ו המקרופאגים גידולים הקשורים

1. צור תאים סרטניים שכותרתו fluorescently ידי חציית מודל סרטן שד הספונטני, קדומות, מהונדסים גנטיים עכבר שבו חוזר מסוף ארוך וירוס גידול עכבר החלב שמניע את אנטיגן T באמצע polyoma (MMTV-PyMT) עם עכברים טרנסגניים עם כתבי ניאון [כלומר, פלואורסצנטי ירוק משופר חלבון (EGFP), חלבון פלואורסצנטי ציאן משופרת (ECFP) או Dendra2] ^8,9.
2. מקרופאגים תווית fluorescently בחיות PyMT עם שכותרתו fluorescently תאים סרטניים על ידי חציית במודלים של עכברים מהונדסים גנטית עם כתבים ניאון ספציפיים myeloid- ו macrophage- [כלומר, MacGreen ¹⁵ או עכברים MacBlue Csf1r -GAL4VP16 / כטב"מ-ECFP ^16].
3. לחילופין, ליצור שכותרתו fluorescently גידולים באמצעות השתלת orthotopic של שכותרתו fluorescently תאים PyMT הגידול (syngeneic), שורות תאי סרטן שד אנושיים או גידולים שמקורם בחולה אדם מן המעלה הראשונה (xenografts) ^11,17.
   1. שתל fluorescently שכותרתו תאי PyMT גידול לעכברי syngeneic עם תאי מיאלואידית ניאון שכותרתו חלבון כדי ליצור חיות עם תאים סרטניים ותאים מיאלואידית שכותרתו fluorescently ^13.
4. להזריק 100 μl של 10 מ"ג / 70 dextran kDa פלורסנט ק"ג ידי וריד הזנב תוך ורידי (iv) לתוך כשל חיסוני חמור עכברים (SCID) עם גידולים xenograft של שורות תאים אנושיים או גידולים ראשוניים הנגזרות למטופל מקרופאגים תווית fluorescently 2 hr לפני תחילת של הדמיה intravital.

התקנת מיקרוסקופ 2. הכנת ההדמיה

הערה: הליך זה מתאר את ההגדרההדמיה intravital על מיקרוסקופ multiphoton ^8.

1. הפעל את כל מרכיבי מיקרוסקופ ליזר כולל לייזרי שני פוטונים ואת הגלאי.
2. הפעל את תיבת חימום עד 30 מעלות צלזיוס מראש לחמם את הבמה. שלב זה הוא קריטי לשמירה על הטמפרטורה הפיזיולוגית של החיה.
3. לשימוש על מקום מיקרוסקופ הפוך להכניס בשלב מחוייט על במת מיקרוסקופ. את כנס המנהג הוא גיליון 1/8 "אלומיניום עבה במכונה כדי להתאים את החלל הבימתי הכנס ועם 1" קוטר דרך חור במרכז הדמיה.
   1. נגב את במת מיקרוסקופ כנס במה עם 70% אתנול ו אוויר יבש.
   2. מניחים ירידה גדולה של מים על המטרה מיקרוסקופ NA 20X, 1.05 לשמור על קשר אופטי עם מכסה זכוכית.
   3. זכוכית מכסה מקום (# 1.5 עובי) מעל נמל ההדמיה על להכניס במת מיקרוסקופ. Secure במקום עם קלטת מעבדה.
   4. השתמש ניקוב חורים אגרוף חור 2 ס"מ X 2 ס"מב רפידת גומי גמישה למקם את רפידת הגומי על הבמה מיקרוסקופ עם חור הכרית מיושרת עם החור להכניס בשלב המותאם אישית.

3. הכנת זנב וריד צנתר ריאגנטים עבור הזרקה במהלך הדמיה

1. חותכים באורך 30 ס"מ פוליאתילן צינורות (PE).
2. בעזרת מלקחיים, להזיז את המחט מתכת של מחט 31 G הלוך ושוב עד שהוא קוטע את דבריו של פלסטיק חלק חיבור לצנרת.
3. בעזרת מלקחיים, הכנס את הקצה הקהה של המחט מנותקת לתוך צינורות PE.
4. הכנס מחט 31 G אל הקצה השני של צינור PE.
5. ממלאים מזרק 1 סמ"ק עם בופר פוספט סטרילית (PBS) ולהכניס אותו לתוך 31 המחט G ולשטוף את כל האוויר מתוך צינור ומחט עם PBS. PBS משמש לשמירה הידרציה osmolarity דם ^9,18, לעומת זאת סליין איזוטוני יכול לשמש גם.
6. ממלאים מזרק 1 סמ"ק עם 200 μl של 3 מ"ג / ק"ג 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine (TMR) או נקודות קוונטיות עבור תיוג כלי דם.
7. הכן כל החלבונים בזריקות אחרות כגון איזופורם חומצה 165 אמינו של גורם (vascular endothelial growth VEGFA ₁₆₅₎ בתוך מזרק 1 סמ"ק ומניחים על קרח. להזריק 0.2 מ"ג / ק"ג VEGFA ₁₆₅ ¹⁹ בריכוז של 0.05 מ"ג / מ"ל.

קלטי 4. זנב שכינת צנתר וריד

1. מניחים את החיה תחת הרדמה באמצעות חדר אינדוקציה עם isoflurane 5% עם O ₂ כגז המוביל.
2. מעביר את העכבר על הפלטפורמה כירורגית לכשזו בהרדמה מלאה ולא מגיבה קמצוץ בוהן.
3. קו ההרדמה להרחיב isoflurane לפלטפורמה כירורגית, לסגור את קו ההרדמה לתא האינדוקציה ומקום חרטומו על החוטם של החיה. מנמיכים את isoflurane בין 5% ל -2.5%.
4. החל משחת עיניים לעיניים של העכבר כדי למנוע יובש במהלך הרדמה.
5. מחממים את החיה תחת מנורת חימוםעבור 2 דקות נוספות כדי להגביר את זרימת הדם בזנב כתפוצה מאטה עם הרדמה עמוקה.
6. לעקר וריד הזנב העכבר עם 70% אתנול.
7. הכנס את קצה המחט 31 G מן קטטר נבנה בסעיף 3 לווריד הזנב לרוחב של החיה ודחוף את מחט 2-3 מ"מ.
8. משוך את הבוכנה לראות דם, להבטיח את הקטטר ממוקם וריד הזנב.
9. השתמש אורך 1 סנטימטר של קלטת המעבדה הניחה על המחט להחזיק את המחט במקביל מקום הווריד לאורך הזנב.

5. עור דש הליך כירורגי כדי לחשוף את גידול החלב

1. עם החיה על הפלטפורמה כירורגית ספוגית הגידול ואת משטח הגחון עם אתנול 70%. הערה: כפי שתואר, הליך זה לא מבוצע לחלוטין בסביבה נקייה מחיידקים. הפעלות הדמיה ארוכות שבו זיהום יכול להיות גורם בלבול, מומלץ להשתמש בטכניקה מזוהמת נכונה.
2. שימוש Steriמלקחיים le, להרים את העור הגחון במספריים סטריליות לעשות חתך תת עורי לאורך קו האמצע הגחון כ 1 ס"מ אורך. הימנע ניקוב הצפק במהלך החתך.
3. בעדינות לחתוך את רקמת חיבור הצמדת בלוטת החלב ואת הגידול הרחק הצפק לחשוף את גידול החלב.
4. בעזרת מספריים מלקחיים, להסיר בעדינות וחתך את fascia ושומן מן השטח החיצוני של הגידול תוך שמירה על שלמות כלי הדם הגידול ומזעור דימום. שלב זה הוא קריטי בשמירה על אדריכלות גידול בכלי דם אספקת הגידול.

6. הכנת בעלי חיים למיקרוסקופיה

1. מעביר את החיה על במת ההדמיה המחוממת מראש עם הגידול החשוף דגש על coverslip על להכניס הבמה מעל המטרה מיקרוסקופ הדמיה. תשמור על עצמך כדי להעביר את הקטטר זנב וריד בעדינות עם החיה כדי לא לסלק את המחט.
2. ה מקוםחרטומו דואר הרדמה על החוטם של החיה לשמור סט הרדמת isoflurane 3%.
3. מקם את החיה כך שהגידול נח החור של כרית הגומי יוצר קשר עם coverslip הזכוכית.
4. השתמש בשתי כריות גומי כדי להחזיק את הגידול בעדינות במקום ולתקן אותם הבמה מיקרוסקופ עם קלטת מעבדה להפחית תנועה במהלך רכישת תמונה.
5. ממלא את החדר מפנקס הגומי עם PBS כדי לשמור על רקמת hydrated ולשמור על קשר אופטי עם coverslip.
6. התחל מעקב אחר הסימנים החיוניים של החיה עם בדיקת oximeter הדופק. צרף חיישן קליפ לירך של החיה. לחלופין צווארון כי הוא מוגדר כך שיתאים סביב הצוואר יכול לשמש.
7. מניחים את תיבת חימום על החיה לשמור 30 ° C ^20.
8. לאט להפחית את רמת isoflurane ל 0.5-1% כדי לשמור על הרדמה לשמור על זרימת הדם.

7. תמונה רכישה הזרקת Fluorescצבעי ent וחלבונים בזריקות

1. באמצעות המוקד העיני מיקרוסקופ על התאים סרטני ניאון על פני השטח של הגידול.
2. בחר שטח של ריבית על ידי מציאה באזורים עם זורם כלי דם. הבחירה של תחום העניין עם כלי דם זורמים היא קריטית להערכת בכלי דם של גידול.
3. לאחר באזור של עניין נבחר להחליף את המיקרוסקופ למצב ההדמיה multiphoton.
4. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של סדרת z. קבע את הגבול העליון של z-series באמצעות שמאי המוקד להעביר את המטרה למיקום ההתחלה הרצוי ולחיצה על מצבה Z "למעלה" כפתור. קבע את הגבול העליון של z-הסדרה על ידי הדמית רשת הסיבים קולגן על פני השטח של הגידול בדור הרמוני השני (SHG) הערוץ וההתבוננות כשאף תאים אבל רק סיב קולגן גלויים.
   1. הגדר את הגבול התחתון של z-סדרה על ידי הזזת המטרה לעומק הדמיה הרצוי (typically 50 - 150 מיקרומטר) ולחיצה על מיקום Z "תחתי" כפתור.
   2. הגדר את גודל הצעד ידי הקלדת הערך הרצוי בשדה גודל הצעד. לקבוע צעד גודל מבוסס על שיקולים לפתרון וזמן רכישה (בדרך כלל 2 מיקרומטר משמש לשיקום 3D ברזולוציה גבוהה 5 מיקרומטר אחר).
5. הגדר את מרווח זמן לשגות על ידי מעבר ללוח Time-lapse והזנת זמן לשגות הרצוי לתחום זמן לשגות. לקבלת החלטה זמנית אופטימלית להגדיר את מרווח הזמן 0 שניות הדמיה רציפה. הערה: הזמן לשגות הדמיה ארוכה מומלץ להגדיר את פרק הזמן עד 10 שניות בין רכישות כדי לחדש את נוזל הטבילה האובייקטיבי.
6. לאחר הפרמטרים הדמיה נקבעו, להזריק לאט 155 kDa dextran-TMR.
   1. הסר את המזרק עם PBS הקטטר זנב וריד ולהחליף עם מזרק המכיל מטפלת 155 kDa dextran-TMR לא להכניס שום בועות לתוך line.
   2. לאט לאט להזריק 155 kDa dextran-TMR לעכבר, עם עוצמת קול גבוהה יותר של 200 μl, ולהחליף את המזרק עם מזרק המכיל PBS. שלב קריטי: בצע את הזריקה לאט לנקוט באמצעי זהירות כדי להימנע מקבלת פתרון מחוץ הווריד.
7. הפעל את רכישת זמן לשגות הדמיה Z- מחסנית על ידי לחיצה על Z-Stack וכפתורים זמן לשגות לדכא אותם ולאחר מכן לחיצה על כפתור ההקלטה.
8. אם dextrans ניאון האחר, כלומר, 10 kDa dextran-והעמסת isothiocyanate (FITC), או חלבונים, כלומר, VEGFA _165, נערך מראש, להזריק אותם לאחר תחילת רכישת תמונה ב = 0 התחלה דקה.
   1. הסר את המזרק עם PBS ב קטטר וריד הזנב ולהחליף עם מזרק המכיל 10 kDa dextran-FITC או VEGFA ₁₆₅ נזהרת שלא להציג את כל בועות לתוך קו.
   2. לאט לאט להזריק הזרקה לתוך העכבר באמצעות קטטר וריד הזנבולהחליף את המזרק עם מזרק המכיל PBS.
9. כל 30-45 דקות, להזריק לאט 50 μl של PBS או תמיסת מלח כדי לשמור על לחות של החיה.

8. המתת חסד

1. עם סיום רכישת התמונה, להרדימו.
   1. הגדל את isoflurane עד 5%.
   2. שמור את החיה תחת isoflurane 5% עד 30 שניות לאחר שתפסיק לנשום ולהסיר את החיה מן הבמה.
   3. בצע נקע בצוואר הרחם כדי להבטיח המתת חסד מוחלט.

עיבוד תמונה 9.

1. לרכוש תמונות קבצי TIFF 16 סיביות לכל ערוץ הפרט בכל נקודת זמן ולשמור ברצף.
2. בצע הפרדת חפיפה ספקטרלית (כלומר, ה- GFP ו CFP), חיסול של סחיפה XY והדור של סרטים מתוך רצפי זמן לשגות בשיטות הוקמה בשנת ImageJ ^9. בצע שחזורי משטח 3D של תמונות ברזולוציה גבוהה ¹³.

תוצאות

מיקרוסקופיה intravital הזמן לשגות מורחבת מאפשרת הדמיה ברזולוצית תא בודדת של תהליכים רבים-תאי ב microenvironment הגידול. על ידי תאים סרטניים תיוג פלורסנטי, מקרופאגים, המרחב וסקולרית, באופן חזותי רשת סיבים קולגן באמצעות האות דור הרמונית השני, מספר תאים ב במיקרו-ס?...

Discussion

אינטראקציות הסלולר המתרחשות באופן ספונטני במיקרו-סביבה של הגידול יכול להביא לשינויים תנועתיות התא הגידול intravasation. הדמית intravital ברזולוציה גבוהה של רקמת גידול חייה מאפשרת ההדמיה של דינמיקה רבה תאית שיכול להיות ^10,13,24 חולף מאוד. סוף-טעם מבחני vivo או זמן לשג...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate	Sigma Aldrich	T1287	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
70 kDa dextran-Texas Red	Life Technologies	D-1830	reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS
10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate	Sigma Aldrich	FD10S	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Life Technologies	Q21561MP	Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection
MMTV-PyMT mice	Jackson Laboratory	2374
Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)	Jackson Laboratory	26051
Csf1r-EGFP mice	Jackson Laboratory	18549
1x PBS	Life Technologies
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
Oxygen	AirTech
1 ml syringe, tuberculin slip tip	BD	309659
30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle	BD	305128
Polyethylene micro medical tubing	Scientific Commodities Inc	BB31695-PE/1	0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D.
Microscope coverglass	Corning	2980-225	thickness 1.5, 22 x 50 mm
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors	Kent Scientific
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R
soft rubber pad	McMaster-Carr	8514K62	Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back
hard rubber pad	McMaster-Carr	8568K615	High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer
Microscope	Olympus		The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens.
7-Punch set	McMaster-Carr	3429A12	1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch