Method Article
We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.
Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier properties, chemical versatility and tunable physical characteristics. Typical methods used to prepare giant-sized (> 4 µm) vesicles, however, are both time and labor intensive, yielding low numbers of intact polymersomes. Here, we present for the first time the use of gel-assisted rehydration for the rapid and high-yielding formation of giant (>4 µm) polymer vesicles (polymersomes). Using this method, polymersomes can be formed from a wide array of rehydration solutions including several different physiologically-compatible buffers and full cell culture media, making them readily useful for biomimicry studies. This technique is also capable of reliably producing polymersomes from different polymer compositions with far better yields and much less difficulty than traditional methods. Polymersome size is readily tunable by altering temperature during rehydration or adding membrane fluidizers to the polymer membrane, generating giant-sized polymersomes (>100 µm).
יצירת שלפוחית unilamellar סינתטי בגודל התא, ענק (GUVs) הוא של הגדלת הריבית בשחזור במבחנה של תהליכים תאיים שונים כדי לבנות מסגרת עבור הדור של 1,2 מערכת מלאכותית דמויי תאים. בעוד GUVs מורכב ממברנות שומנים בדם הנו חקיינים מצוינים של ממברנות הטבעיות, ביולוגיות, הם אינם יציבים מפני תנודות סביבתיות ויש להם חיי מדף קצרים למדי. בשל מגבלות אלה, שמש קופולימרים לחסום amphiphilic כמו מחק שומנים כדי ליצור שלפוחית פולימר, או polymersomes. במסגרת זו, polymersomes הוא יתרון בפיתוח מערכות תא biomimetic בשל היציבות המוגברת שלהם 3, הצדדי כימית 4,5 ו תכונות פיסיות לשינוי 6 - 8.
השיטות הקיימות כיום ליצירת polymersomes ענק בגודל כוללים electroformation 9 ו התייבשות בתבניות 10, שניהם which צורך זמן, עתיר עבודה, דורש ציוד מיוחד ולייצר תשואות נמוכות של polymersomes הענק פגע. שיטה להחזרת נוזלים פשוט בסיוע ג'ל פותחה לאחרונה לייצור GUVs השומנים 11. כאן אנו מתארים עיבוד של טכניקה להחזרת נוזלים בסיוע ג'ל ליצור polymersomes ענק עם קומפוזיציות פולימר משתנים, גודל מבוקר, בקומפוזיציות חיץ שונים.
בקצרה, 1% w / v סרטי agarose ג'ל אלקטרופורזה תקן ה- DNA הם מיובשים על coverslip זכוכית. פתרונות פולימר ערוכים כלורופורם אז מפוזרים על פני סרט agarose המיובש ואפשרו להתאדות. בעקבות הסרת ממס מלאה, סרטי פולימרים הם rehydrated למאגר של בחירה עם חימום מתון (40-70 מעלות צלזיוס) וענקי (> 4 מיקרומטר) polymersomes בגודל נוצר תוך 30 דקות. שיטה זו במהירות מייצרת מאה לחלוטין ללא פגע, polymersomes הבנוי היטב באמצעות שימוש בציוד מעבדה סטנדרטי Reagents בעלויות מינימליות.
באיור 1. סכמטי המתאר את שיטת ההתייבשות בסיוע ג'ל. Polymersomes הענק המורכב של קופולימר diblock נוצר לאחר ~ 30 דק 'של התייבשות. הבלוק הידרופילי הוא כונה ב המשולהבים לחסום הידרופובי הוא כונה בירוק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
1. פולימר והכנת Agarose
הערה: כפפות וחלוק מעבדה צריך להיות משוחק בכל עת בכל פרוטוקול זה. משקפי בטיחות הם כמו כן נדרשו במהלך העבודה עם כל ממיס אורגני או כל צעד עם מתיז אפשרי.
2. הכנת סרט Agarose
3. גיבוש שכבת הפולימר
4. גיבוש Polymersomes
5. אפיון Polymersomes ידי שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP)
אפיון 6. Polymersome גודל
איור 6. תהליך לניתוח גודל polymersomes באמצעות תוכנת הדמיה. צעד אחר צעד הוראות כיצד למדוד את הקוטר של השלפוחית נוצרה. המשתמש חייב לדעת את יחידות כיול בפיקסלים / מיקרומטר של המיקרוסקופ משמש.ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Polymersomes נוצרו באמצעות ההליך המתואר לעיל (איור 1) וציוד המעבדה המשותף שמוצג באיור 2. Polymersomes היה rehydrated עם מים ללא יונים (איור 3) ו צלם על מיקרוסקופ הפוכה ב epifluorescence באמצעות מטרת שמן 100X. שים לב שאם polymersomes אינו גלוי, הם עלולים נוצרו בערך במידות גדולות מכדי ללכוד עם מטרת נפט 100X; מטרה חשמל נמוכה ייתכן שיהיה צורך להשתמש במקום. אחד היתרונות של שימוש התייבשות הג'ל בסיוע הוא הצדדי של להרכיב polymersomes במגוון פתרונות להחזרת נוזלים. Polymersomes נוצר בהצלחת מים ללא יונים, מדיום תרבית תאי יונקים מלא, פתרונות סוכרוז שתי תמיסות בופר רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית (בופר פוספט (PBS) או מלוחה טריס שנאגר (TBS)), כפי שמוצגים באיור 4. בתנאים תקניים (התייבשותעם מים ב 40 מעלות צלזיוס במשך שעה 1), יותר מ ~ 70 polymersomes נמצאות בדרך כלל לכל 40 x 40 מיקרומטר 2 שדה הראייה. בעוד הייצור של polymersomes השטח אינו הומוגני, יש עשרות שדות של נוף עם התשואה המייצגת הזה. יתר על כן, polymersomes היו יציבים בתמיסה במשך שעה 24 לפחות.
גודל Polymersomes היה מכוון בקלות על ידי rehydrating סרטי פולימרים בטמפרטורות משתנות. Polymersomes נוצר מים ללא יונים ב RT היה בקוטר ממוצע של 2.9 ± 0.7 מיקרומטר. ככל שהטמפרטורה עולה במהלך התייבשות, הגודל הממוצע של polymersomes גם מעלה (טבלה 1). בטמפרטורות גבוהות (> 60 ° C), polymersomes נוצר עם גדלים עוד יותר מ -100 מיקרומטר (איור 5).
כל עיבוד התמונה הושלם באמצעות תוכנת הדמית קוד פתוח (איור 6).תמונות שנאספו נפתחו בתוכנה. גודל פיקסל המכויל הוזן תיבת מידה להגדיר. באמצעות כלי הקו, קווים היו משוכים על הקטרים. אחרי כל שורת פרט נמשכת, האורך המכויל נמדד והוסיף אל תיבת התוצאות. נתונים ניתן להתוות אז בתוכנה המתמטית של בחירה (למשל, Excel, פריזמה, מוצא וכו ')
. תמונת איור 2. חומרי המעבדה הנפוצים וזולים הנדרשים להיווצרות polymersomes הפריטים הדרושים היא: Parafilm, מחט 18.5 G, פולימר כלורופורם או ממס מתאים אחר, קצה פיפטה 1,000 μl, נאד Erlenmeyer, פינצטה, agarose, 25 מ"מ coverslips מרובע, בארות הדמיה PDMS ו בכלי זכוכית פטרי. נא ללחוץ כאןלצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. תמונות של שיטת ההתייבשות בסיוע ג'ל. מומסות agarose משתרעות על coverslip 25 מ"מ מרובע, עד מעיילי סרט אפילו coverslip כולו. Coverslips אז הם הכניסו לתוך חממת 37 מעלות צלזיוס, סרט הוא מיובש. פתרון פולימר מופקד על הסרט agarose מיובש ולהפיץ באמצעות מחט בתנועה מעגלית. את coverslip לאחר מכן למקם בתוך O ייבוש / N להתאדות שאריות ממסות לחלוטין. לבסוף, קאמרי הדמיה מודבקת על המצע ופולימרים הם rehydrated עם פתרון מועדף והניחו לתוך צלחת פטרי ב 40 מעלות צלזיוס במשך לפחות 25 דקות, כדי לאפשר ההיווצרות של polymersomes. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זה דמות. >
Polymersomes איור 4. יכול להיווצר במגוון מאגרים שונים. סרטים פולימרי PEO-ה.ה.ר. היו rehydrated עם למאגר המצוין ב 40 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. הגדלת הטמפרטורה במהלך ההתייבשות מגדיל את גודל polymersomes. תמונות epifluorescence נציג של polymersomes נוצר במים בטמפרטורת ההתייבשות המצוינת. הגדלת תוצאות טמפרטורת polymersomes הגדול. בר סולם = 10 מיקרומטר._blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טמפרטורה (° C) | גודל ממוצע (מיקרומטר) |
24 | 2.93 ± 0.7 |
40 | 5.76 ± 2.5 |
50 | 6.65 ± 2.4 |
60 | 11.46 ± 5.8 |
70 | 14.04 ± 7.0 |
טבלת 1. הגדלת הטמפרטורה במהלך תוצאות להחזרת נוזלים בגודל polymersome מוגברת. בקטרים ממוצעים של יותר מ -100 polymersomes במים לכל מצב טמפרטורה שונה חושבו ו מתוארת כאן. שגיאה היא סטיית התקן.
Polymersomes הופך בחן נרחב כמו מחק קרום ביולוגי. המאפיינים החזקים צדדיים של פולימרים להפוך אותן לאטרקטיביות נרחבת ללימודי מחייב functionalization קרום, אריכות ימים והיענות מכוונת. שיטות מסורתיות להרכיב polymersomes הענק בגודל 9,10 (> 4 מיקרומטר) הן עתיר עבודה ודורשות ציוד יקר והתמחה. כאן, אנו מציגים בפעם הראשונה, שיטה מהירה, תכליתית וחזקה להרכבת polymersomes הענק בגודל באמצעות למעבדה זולה תקן וציוד.
שימוש התייבשות הג'ל בסיוע, polymersomes unilamellar יכול להיווצר במהירות (<30 דק '), במגוון של פתרונות להחזרת נוזלים (כולל התקשורת תרבית תאים) ועם מגוון של פולימרים שונים (מידע לא מוצג). ההיווצרות של שלפוחית multilamellar או אסימטריים לא נצפתה באמצעות טכניקה זו. במהלך עבודה זו, השתמשנו פולי (אתילן אוקסיד) - פולי B- (סטירן) (PEO-ה.ה.ר., EO 22 -BD 37) קופולימר diblock נייטרלי. קומפוזיציות פולימר שונים רבים (כולל קופולימרים diblock טעונה) גם לעבוד בשיטה זו (לא מוצג). עם זאת, חלק קופולימרים triblock המסחריים הקיימים קופולימרים diblock משקל מולקולרי גבוה (~> 5,000 Daltons) לא יוצרים polymersomes ברורים. עבור כל הניסויים בכתב היד הזה, ריכוז נמוך של שומנים שכותרתו היה מסומם לתוך פתרונות הפולימר למטרות להדמיה בלבד. שיטות אחרות להדמיה, כוללים פולימרים פונקציונליים ישירות עם פלורסנט לצבוע ניתן להשתמש גם. Polymersomes ניתן הדמיה גם עם מיקרוסקופ שדה בהיר, אם כי מיקרוסקופ פלואורסצנטי מספק רזולוציה גבוהה יותר.
רוב השינויים קלים בצורת הפרוטוקול בדרך כלל לא לשנות את התוצאות. למשל, הבדלים קטנים בריכוז של פתרון הפולימר להתפשט על coverslips אינם משנים את ההיווצרות של f הפולימרILM יצר. בעוד טווח הריכוז המלא לא נקבע, היווצרות polymersome תתרחש בהצלחה עם מגוון גדול של ריכוזי פולימר הסרט (למשל, 1-10 מ"ג / מ"ל). עם זאת, יש כמה שינויים בפרוטוקול כי אין השפעה שלילית על היווצרות polymersome. הבולט ביותר הוא כי coverslips זכוכית העגול (במקום מרובע) לגרום להיווצרות עניה מאוד של polymersomes. אנו מייחסים זאת המעיל מאוד אפילו של agarose על זכוכית אשר למעשה מעכבת היווצרות polymersomes.
אחד האתגרים הבולטים של שיטה זו היא היכולת לשחזר את polymersomes מפני השטח עם תשואה גבוהה. ישנם מקרים מסוימים בהם הסרת polymersomes מפני השטח המקורי יכול להיות יתרון. בשל קרינת רקע הגבוהה מסרט הפולימר המיובש, הסרת polymersomes פרט והקפדה אותם לנקות coverslips יגדל איכות הדמיה ואפיון (Particularly במהלך ניתוח FRAP). לשם, זה pipetting העדין עם קצה פיפטה שבו חל הסיום נותק יהיה desorb polymersomes מפני השטח (אם כי המספר של שלפוחית התאוששה נמוך משמעותי מאלה נוצרו במקור). Polymersomes ניתן להציב אז על משטחי coverslip שונים, מה שמאפשר polymersome לקיים אינטראקציה עם coverslip החדש. בדרך כלל, עבור polymersomes PEO-ה.ה.ר. נייטרלי, coverslips שטופלו האוזון במשך 15 דקות לאפשר polymersomes ליפול אל פני השטח הדמיה. שינוי פני שטח שונה נדרש עבור יצירות polymersome שונות (למשל, שלילי או חיובי טיעוני פולימרים).
רוב החומרים המשמשים פרוטוקול זה מאוחסנים בהצלחה ומשמשים במשך ימים עד שבועות. את agarose הקרושה ניתן reboiled ולעשות בהם שימוש חוזר עד agarose מתחילה לקבל אגרגטים אפילו לאחר הרתיחה, או agarose הקרושה מתחיל להתייבש. Coverslips עם סרטים agarose יבשים ניתן לאחסן ולהשתמשד ללא הגבלת זמן (למשל, חודשים). הפולימר מומס כלורופורם יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים. לאחר סרט הפולימר הוא מיובש על סרטי agarose, עם זאת, הסרטים צריכים להיות מאוחסנים תחת ואקום הבית בשימוש בתוך שבועות (אחסון לטווח ארוך לא נקבע באופן ישיר, אבל יש הבדלים בולטים polymersomes נוצרו סרטי פולימרי מבוגרת שני שבועות).
באמצעות הפרוטוקול להחזרת נוזלים בסיוע ג'ל המוצג כאן, מאה polymersomes בצורה אחידה נוצרים במהירות עם רק כמה שעות של עבודה תוך שימוש בציוד סטנדרטי למעבדה זולה. יתר על כן, יכול להיווצר polymersomes במגוון פתרונות חיץ פיזיולוגיים מ קומפוזיציות פולימר שונים (לא מוצג). שינויים קלים השיטה לא שלילי לשנות את היווצרות polymersomes, טיוח התייבשות הג'ל בסיוע טכניקה צדדי ונגיש למדענים משתנה דואר טכניxpertise.
היכולת ליצור polymersomes ענק בקלות על גודל בקנה מידה של תאים חיוני לבניית מערכות דמוי תא מלאכותי. קלות שימוש צדדי של התייבשות הג'ל בסיוע לעשות polymersomes אלה מציעות קידום ענק בתחום biomimetic ליצירה מחק תא-קרום חזק. לדוגמא, באמצעות טכניקה זו, אסטרטגיות אנקפסולציה של רכיבים תאיים שונים, functionalization של הפולימר עם חלבונים-קרום תא שילוב של חלבוני תחבורת קרום, רק כדי שם כמה, יכול להיות מתוכנן לבנות תאים מלאכותיים מבוסס polymersome.
Sandia National Laboratories is a multi-program laboratory managed and operated by Sandia Corporation, a wholly owned subsidiary of Lockheed Martin Corporation, for the U.S. Department of Energy's National Nuclear Security Administration under contract DE-AC04-94AL85000.
We would like to gratefully acknowledge Dr. Ian M. Henderson, Andrew Gomez and Dr. Walter F. Paxton for their technical expertise, advice and help in this work. This work was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). ACG, DYS and GDB were supported by BES-MSE. This work was performed, in part, at the Center for Integrated Nanotechnologies, an Office of Science User Facility operated for the U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science (user project number RA2015A0004, PI: ACG).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
125 ml Erlenmeyer flask | VWR | 89000-360 | |
18 guage needle | VWR | BD-305196 | |
25 mm square coverslips | VWR | 48366-089 | |
Agarose | Sigma | A9539 | A standard agarose for DNA gel electrophoresis |
Chloroform | Sigma | 288306-2L | |
Commerical coverwell | Electron Microscopy Sciences | 70336 | Press-to-Seal Silicone Isolators |
Fiji Image Analysis Software | ImageJ | Free Download: http://fiji.sc/Fiji | |
Glass vial with Teflon Lid | VWR | 66009-556 | 1.9 ml capacity, case of 144 |
Liss-rhodamine B PE Lipid | Avanti Polar Lipids | 810150C | 1 mg of lipid at 1 mg/ml concentration in chloroform |
Parafilm | VWR | 52858-000 | 10.2 cm x 38.1 m |
poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene) or PEO-PBD (with a molecular weight of 2,940) | Polymer Source | P2904-BdEO | http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf |
Pastic Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
Teflon tape | VWR | 300001-057 | 1/2" width |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved