הדור של גזע תאים מושרה-פלוריפוטנטיים שימוש פיברובלסטים דמויי Synoviocytes מבודדת מן מפרידים של בחולי דלקת מפרקים שגרונית

Summary

כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע פלוריפוטנטיים נגרם אדם מן synoviocytes חולה נגזרת כמו-פיברובלסטים, באמצעות מערכת lentiviral ללא תאים מזינים.

Abstract

תאי סומטיים בוגרים יכולים להיות הפוכים לתוך גזע פלוריפוטנטיים דמוי תא מדינה באמצעות סט של גורמי תכנות מחדש מוגדר. מחקרים רבים יצרו תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) סוגי תאים שונים סומטיים ידי transducing ארבעה גורמי שעתוק יאמאנאקה: Oct4, Sox2, Klf4 ו- c-Myc. המחקר של iPSCs נשאר בחוד החנית של מחקר ביולוגי וקליני. בפרט, iPSCs המטופל ספציפי יכול לשמש ככלי חלוצים למחקרי של pathobiology מחלה, מאז iPSCs יכול להיגרם מן הרקמה של כל אדם. דלקת מפרקים שגרונית (RA) היא מחלה דלקתית כרונית, אשר סווגו על ידי הרס הסחוס ומבנה העצם במפרק. היפרפלזיה הסינוביאלי הוא אחד הסיבות העיקריות או סימפטומים שיובילו לתוצאות אלה ב- RA. Synoviocytes פיברובלסטים דמויי (FLSs) הם התאים המרכיבים העיקריים הסינוביום hyperplastic. FLSs במפרק להתרבות ללא הגבלה, בסופו של דבר פולש cartil סמוךגיל ועצמות. נכון לעכשיו, synovium hyperplastic ניתן להסיר רק על ידי הליך כירורגי. הסינוביום שהוסר משמש למחקר RA כחומר המשקף את המצב הדלקתי של המפרק. כשחקן מרכזי בפתוגנזה של RA, FLSs יכול לשמש כחומר ליצור ולחקור את iPSCs של חולי RA. במחקר זה, השתמשנו FLSs של חולה RA כדי ליצור iPSCs. באמצעות מערכת lentiviral, גילינו כי FLSs יכול ליצור iPSC המטופל הספציפי RA. IPSCs המופק FLSs ניתן להשתמש כדי להמשיך ככלי ללמוד בפתופיזיולוגיה של RA בעתיד.

Introduction

תאי גזע פלוריפוטנטיים הם הפלטפורמה של הדור הבא בתחומים קליניים וביולוגיים שונים. הם כולים מבטיחים כי ניתן להשתמש ב דוגמנות מחלה, הקרנת סמים, וטיפול רפואי רגנרטיבית. אדם תאי גזע עוברי (hESCs) שמשו בעיקר כדי ללמוד ולהבין תאים פלוריפוטנטיים. עם זאת, מבודד על ידי הרס של הבלסטוציסט האנושי, hESCs המשויכים מספר שיקולים אתיים. בשנת 2007, ד"ר שיניה יאמאנאקה וצוות הפכו את תהליך תכנות תא ופתחו תאי גזע תאי סומטיים אדם בוגרי ^1,2. לכן, בניגוד hESCs, נגרמת pluripotent בתאי גזע (iPSCs) ניתן להפיק מן התאים הסומטיים בוגרים, הימנעות המכשולים המוסריים.

בדרך כלל, iPSCs מופקים על ידי משלוח של ארבעה גנים אקסוגניים: Oct4, Sox2, Klf4, ו- c-Myc. גורמי יאמאנאקה אלה מועברים במקור באמצעות מערכות lentiviral ו retroviral. IPSCs הראשון נגזרו ג סומטיים העכבראמות ^3. לאחר מכן, הטכניקה יושמה כדי fibroblasts עורי האנושי ^1,2. מחקרים מאוחרים יותר שנוצרו iPSCs בהצלחה ממקורות שונים, כגון שנתן ^4, דם ^5,6, קרטינוציטים ^7, סוגי תאים כמה אחרים. עם זאת, ישנם כמה תאים סומטיים שלא היה בשימוש תכנות מחדש, והקרנת יכולות תכנות מחדש של תאים מסוגים שונים ברקמות ספציפיות במצב מחלה, עדיין נדרש.

דלקת מפרקים שגרונית (RA) היא מחלה שיכולה לפגוע בכל המפרקים להוביל מחלות אוטואימוניות באיברים אחרים. RA המשפיעה על כ -1% מהמבוגרים בעולם המפותח. זוהי מחלה די נפוצה שכיחותה גדלה מידי שנת ^8. עם זאת, דלקת מפרקים שגרונית היא קשה לזהות בשלבים מוקדמים oncebone הרס מתרחשת אין טיפול שיכול לשחזר את הנזק. יתר על כן, יעילות תרופה שונה מחולה לחולה, וזה קשה לחזות את החובשine כי נדרש. לכן, הפיתוח של שיטת סמי הקרנה יש צורך, ואת חומר תא זה יכול לשקף את התנאים של RA נדרש.

Synoviocytes פיברובלסטים דמויים (FLSs) מהווה השתתף הסלולר פעיל בפתוגנזה של ^9,10 RA. FLSs להתקיים רירית intimal הסינוביאלי בין קופסית מפרק ואת החלל, אשר גם הוא המכונה הסינוביום. על ידי תמיכה במבנה המשותף ומתן מזיני הסחוס שמסביב, FLSs בדרך כלל לשחק תפקיד מכריע בתפקוד ותחזוקה משותפים. עם זאת, FLSs ב- RA יש פנוטיפ פולשני. יש RA FLSs פנוטיפ סרטן דמוי, בסופו של דבר להרוס את העצם שמסביב ב ^-10 התפשטות אינסופית. עם מאפיין ייחודי זה, יכול לשמש FLSs כחומר מבטיח שיכול לשקף את pathobiology של RA. עם זאת, תאים אלו הם לעתים נדירות מיוצרים, ואת פנוטיפים התא לשנות כמו התאים לעבור כמה קטעים במבחנה תנאים. לכן, זה יכול להיות מסובך להשתמש RA FLSs ככלי שיכול לייצג את מצבו של החולה.

באופן תיאורטי, iPSCs החולה נגזר RA (RA-iPSCs) יכול להיות כלי אידיאלי עבור הקרנת סמים ומחקר נוסף. יצר iPSCs יכולת התחדשות עצמית והוא יכול להישמר והרחיב במבחנה. עם pluripotency, תאים אלה יכולים להיות מובחנים לתוך שושלות הכונדרוציטים ו osteocyte בוגרות, אשר יכול לתרום חומר תא של מחקרים ספציפיים ב- RA ומחלות הקשורות עצם אחרים ^11.

במחקר זה, אנו מדגימים כיצד לבודד להרחיב FLSs מתוך synovium הוסר בניתוח, וכיצד ליצור RA-iPSCs מ FLSs באמצעות lentiviruses המכיל גורמים יאמאנאקה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

משפט ואתיקה: זה פרוטוקול מחקר אושר על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי של האוניברסיטה הקתולית של קוריאה (KC12TISI0861).

1. בידוד Synoviocyte ורחב

1. בידוד Synoviocyte
   1. לעקר שני זוגות מספריים כירורגיות וזוג אחד של מלקחיים.
   2. העברת רקמה סינוביאלי לצלחת 100 מ"מ ולשטוף עם 5 מ"ל של בופר פוספט (PBS) המכיל 1% פניצילין / סטרפטומיצין.
   3. חותך את שאריות שומן רקמות ועצמות הצהבהבות. העברת הרקמה הגזוזה באר של צלחת 6-היטב ומוסיף 5 מיליליטר של המדיום של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) עם 20% בסרום שור עוברי (FBS).
   4. קוצץ את הרקמות עם המספריים עד החתיכות קטנות מספיק כדי לחדור פיפטה חד פעמי.
   5. מעבירים את התקשורת המכיל רקמות צינור חרוטי 50 מ"ל. קציר את החומר הנותר על ידי הוספת 5 מ"ל של DMEM עם 20% FBS לצלחת 6-היטב ולאחר מכן להעביר את הצינור.
   6. collagenase להפשיר על הקרח. להוסיף collagenase לריכוז סופי של 0.01% ו לאטום את הצינור עם parafilm. דגירה באמבט מים ב 37 ° C עם רעד במשך 4 שעות.
   7. לאחר דגירה, למלא את הצינור עם DMEM עם 20% FBS, עד הנפח הכולל הוא 50 מ"ל ו צנטריפוגות ב XG 300, RT במשך 10 דקות.
   8. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה ולהוסיף 40 מ"ל של התקשורת כדי resuspend גלולה.
   9. חזור על שלבי 1.1.10-1.1.11.
   10. Resuspend גלולה ב 25 מ"ל של DMEM עם 20% FBS ולחכות גושים גדולים של רקמה לשקוע לקרקעית.
   11. מעבירים את supernatant לצלחת 100 מ"מ ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ עבור 14 ימי.
2. תחזוקת Synoviocyte ורחבה
   1. מחק את התקשורת בשימוש מהצלחת לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של PBS.
   2. הוסף 1 מ"ל PBS / 1 mM EDTA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ למשך 2 דקות.
   3. הקש על צלחת בעדינות transfer התאים צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה התאים ב 250 XG, RT במשך 2 דקות.
   4. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה ו resuspend גלולה ב 30 מ"ל של DMEM עם 20% FBS.
   5. להעביר את התאים 3 x 100 מנות מ"מ, מבלי לעזוב כל חומר שאריות גלוי.
   6. החלף את המדיה עם תקשורת טריה כל 3 ד. פיצול התאים ב confluency 80% באמצעות 1 מ"ל PBS / 1 mM EDTA. שמור עד חלוף 3 לפני השימוש. מחלקים כל צלחת של תאים לתוך 3 מנות בכל פיצול.
      הערה: לאחר שהגיע מעבר 3, תאים שאינם הולכים לשמש מיד אפשר להקפיא.

2. FLSs Reprogramming שימוש Lentiviruses קידוד גורמים יאמאנאקה

1. תמרה (D0)
   1. זרע 3 × 10 ⁴ תאים לכל גם צלחת 6-גם בתקשורת צמיחה (500 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין). דגירה התאים O / N ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.
   2. למחרת, להסיר בקבוקון אחד של lentivirus המכיל 4 יאמאנאקה גורמים: Oct4, Klf4, Sox2 ו- c-Myc מהמקפיא להפשיר ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: Lentivirus הופק על ידי ההליך המתואר במחקר הקודם שלנו ^11.
   3. בעוד להפשרת וירוס, לשנות את התקשורת למדיה צמיחה FLS (20% FBS בתוספת אנטיביוטיקה DMEM) המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​ברומיד hexadimethrine ו -50 מיקרוגרם / מ"ל ​​חומצה אסקורבית.
   4. לאחר שינוי התקשורת, להוסיף 30 μl של lentivirus לתאים ומערבבים בעדינות. כדי לשפר את הזיהום, בצנטריפוגה הצלחת ב -680 XG, 35 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
   5. לאחר צנטריפוגה, דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2.
2. תחזוקה עד Reprogramming גלויה
   1. במשך 3 ימים, להחליף את התקשורת יומית עם תקשורת צמיחת FLS המכילה בוטיראט 0.1 מ"מ נתרן ו -50 מיקרוגרם / מיליליטר חומצה אסקורבית.
   2. למחרת, להחליף את התקשורת עם תערובת של תקשורת צמיחת FLS והתקשורת iPSC (1: 1 יחס) המכיל 0.1 מ"מ בוטיראט נתרן ו -50 מיקרוגרם / מ"ל ​​חומצה אסקורבית.
      הערה: מרכיבי תקשורת iPSC ניתנים ברשימת חומרים / ציוד.
3. תאי פיצול עבור גיבוש קולוני
   1. כן 6-גם צלחת vitronectin המצופה.
      1. הוסף 60 μl vitronectin עד 6 מ"ל PBS ללא Ca ^{2 +} ו Mg ^2+. שים 2 מ"ל של התערובת לתוך כל בארות דגירה RT לפחות שעה 1. הערה: ריכוז העבודה של vitronectin הוא 5 מיקרוגרם / מ"ל.
   2. ביום D5, לשטוף את התאים עם PBS.
   3. הוסף 1 מ"ל PBS / 1 mM EDTA כדי לנתק את התאים ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 2 דקות.
   4. קציר התאים צנטריפוגות ב 250 XG, RT במשך 2 דקות.
   5. פיצול התאים ב 3 יחסים שונים (1: 3, 1: 6 ו -1: 9) על מנת להשיג confluencies השונה. להוסיף 900 ​​μl של התקשורת גלולה התא גלולה. הוספת 300, 150, ו -100 μl של תערובת תאים לכל גם 6-צלחת גם להשיג יחס של 1: 3, 1: 6 ו -1: 9, בהתאמה.
   6. החלף את המדיה יומית עם תקשורת iPSC עד מושבות להופיע. מושבות תופענה לאחר כ D18. הערה: בשלב זה, מושבות iPSC להתקיים עם FLSs שאינם לתכנות מחדש.
4. קטיף קולוני
   1. הכינו צלחת 48-היטב מצופה vitronectin על ידי הוספת 500 μl vitronectin על בארות, דגירה ב RT לפחות שעה 1.
   2. מניחים את המיקרוסקופ על ספסל נקי, ולהסיר את צלחת 6-היטב מן החממה.
   3. הסר את הפתרון vitronectin מהצלחת 48-היטב ולהוסיף 500 מדיה iPSC μl בתוספת 10mm Rho הקשורים, המכיל פרוטאין קינאז-סליל מפותל (ROCK) מעכב.
   4. בעזרת קצה פיפטה 10p, לחתוך סביב המושבה. מעבירים את המושבה הרים כדי היטב אחד של הצלחת 48-היטב.
   5. לאחר בחירת מושבות כמה, דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
   6. לשמור על התאים עד ההתנחלויות הן Eno גדולאיכס להעברה. הערה: בדרך כלל אנחנו נשפכים התאים כאשר המושבה יוצאת של השדה הגלוי של המיקרוסקופ, כאשר צפו בהגדלת 100X.

3. Immunofluorescence מכתים

1. תא הכנה
   1. מניחים כוס כיסוי סטרילי 18 מ"מ לתוך צלחת 12-היטב.
   2. הוסף 1 מ"ל של PBS לצנן ולשטוף את מכסה זכוכית.
   3. החלף עם 1 מ"ל של פתרון 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​vitronectin.
   4. דגירה את הצלחת על RT במשך שעה 1 לפחות.
   5. מחק את הפתרון vitronectin ו iPSCs צלחת צלחת 12-היטב מצופה vitronectin והתרבות למשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, לשנות את התקשורת מדי יום.
2. מכתים תא
   1. מחק את התקשורת והתרבות לשטוף את התאים עם PBS פעם.
   2. תקן את התאים paraformaldehyde 0.4% (PFA) במשך 30 דקות ב RT.
   3. Permeabilize את התאים עם 0.1% Triton X-100 במשך 5 דקות ב RT.
   4. הסר את permeabilizationפתרון ולחסום עם PBS המכיל 2% אלבומין בסרום שור (BSA) למשך 30 דקות ב RT.
   5. לדלל את הנוגדנים PBS המכיל BSA 2% לפי טבלה 1. דגירה התאים עם נוגדנים ראשוניים עבור שעה 2 ב RT.
   6. מוסיפים את נוגדנים משני (בדילול 1: 200) ו דגירה התאים במשך שעה 1 ב RT, הימנעות אור.
   7. פנקו את התאים עם 1 μl / מ"ל ​​DAPI במשך 10 דקות.
   8. מניחים את מכסה זכוכית על גבי זכוכית שקופית עם antifade מגיב לדגור על RT למשך 24 שעות, הימנעות אור.
   9. ודא ביטוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

4. תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR)

1. חלץ mRNA מן התא גלולה בשיטת החילוץ thiocyanate-פנול, כלורופורם guanidinium ^11.
2. להגביר cDNA מ 2 מיקרוגרם של ה- mRNA הכולל שימוש שעתוק לאחור ^11.
3. מערבבים את הרכיבים הנדרשים עבור ה- PCR באמצעות 2 μl של TEM cDNAצלחת ^11.
4. בצע RT-PCR ולאמת את התוצאות על ידי ג'ל אלקטרופורזה ^11.

5. אלקליין phosphatase (AP) מכתים

1. IPSCs תרבות 5-7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ לפני מכתים.
2. לשאוב התקשורת לתקן את התאים עם 4% PFA דקות 1.
3. מחק את מקבע ולשטוף את התאים עם חיץ שטיפת 1X.
4. הכן את ריאגנטים עבור מכתים AP. מערבבים את ריאגנטים היחס הבאים: Fast האדום ויולט: Naphthol פתרון פוספט AS-BI: מים = 2: 1: 1.
5. דגירת התאים עם הפתרון המכתים ב RT במשך 15 דקות, הימנעות אור.
6. מחק את הפתרון מכתים ולשטוף את התאים עם חיץ לשטוף.
7. לכסות את התאים עם PBS כדי למנוע התייבשות ולוודא ביטוי באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול ליצור iPSCs מ FLSs באמצעות מערכת lentiviral. איור 1 א מציג תוכנית פשוטה של פרוטוקול בידוד FLS. בעקבות הסרה כירורגית של synovium, הרקמה היה קצוץ לחתיכות קטנות באמצעות מספריים כירורגיות. Collagenase התווסף לבודד את התאים מן הגושים של ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

לפני גילוי iPSCs, מדענים משמשים בעיקר ESCs ללמוד ביולוגית גזע תא שושלות תאים אחרות באמצעות בידול. עם זאת, ESCs מקורן המסה הפנימית של הבלסטוציסט, המהווה העובר בשלב מוקדם. כדי לבודד ESCs, הרס של הבלסטוציסט הוא בלתי נמנע, העלאת סוגיות אתיות כי ניתן להתגבר. יתר על כן, למרות שיש ESCs מא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 ml Cornical Tube	SPL	50050
15 mlL Cornical Tube	SPL	50015
10 ml Disposable Pipette	Falcon	7551
5 ml Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
FLS Isolation Materials
Surgical Scissors
Surgical Forcep
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM	Life Technologies	11995-073
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
Collagenase	Sigma Aldrich	C6885-100MG
Parafilm	Sigma Aldrich	54956
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM	Life Technologies	11885
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Polybrene	Chemicon	TR-1003-G
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	iPSC media ingredient (500 ml)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	iPSC media ingredient  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC media ingredient  (Conc.: 100 ng/ml)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	iPSC media ingredient  (Conc.: 64 μg/ml)
Polybrene	Chemicon	TR-1003
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Guality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde (PFA)	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin (BSA)	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004