רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקור מתילציה DNA בגנום רחב במחקרים לסקירת חולים קליניים בקנה מידה גדול באמצעות רצף לכידת DNA מתיל-Binding (MBDCap-seq או MBD-seq) טכנולוגיה בצנרת ניתוח ביואינפורמטיקה שלאחר מכן.

Abstract

מתילציה היא אחד השינויים אפיגנטיים החיוניים ל- DNA, האחראית על ויסות המדויק של הגנים דרושים התפתחות והתמיינות יציבות של סוגי רקמות שונים. חוסר ויסות של תהליך זה הוא לעתים קרובות סימן ההיכר של מחלות שונות כמו סרטן. כאן, אנו מתארים אחת טכניקות הרצף האחרונות, מתיל-כריכת רצף לכיד DNA (MBDCap-seq), המשמש לכמת מתילציה שונה רקמות בריאות ומחלות עבור קבוצות גדולות של מטופלים. אנו מתארים פרוטוקול מפורט של גישת העשרת זיקה זו יחד עם צינור ביואינפורמטיקה להשיג כימות אופטימלי. טכניקה זו נעשה שימוש כדי רצף מאות חולים ברחבי סוגי סרטן שונים כמו חלק מפרויקט methylome 1,000 (מערכת Methylome סרטן).

Introduction

תקנה אפיגנטיים של גנים באמצעות מתילציה DNA היא אחד המנגנונים החיוניים הדרושים כדי לקבוע את גורל התא על ידי בידול יציב של סוגי רקמות שונים בגוף ^1. חוסר ויסות של תהליך זה כבר ידוע לגרום למחלות שונות, כולל סרטן ^2.

תהליך זה בעיקר יהיה כרוך בתוספת של קבוצות מתיל על שאריות ציטוזין ב CPG dinucleotides של DNA ^3. ישנן כמה טכניקות שונות המשמשים כיום כדי לחקור את המנגנון הזה, שלכל אחד מהם יתרונות משלהם כפי שמתואר מחקרים רבים ^2-8. כאן נדונו באחת הטכניקות הללו בשם מתיל-כריכת רצף לכיד DNA (MBDCap-seq), שבו אנו משתמשים בטכניקת העשרת זיקה לזהות אזורים מפוגלים של ה- DNA. טכניקה זו בונה על היכולת מחייב מתיל של החלבון MBD2 להעשיר עבור קטעי דנ"א גנומי המכיל אתרים CPG מפוגל. אנו מנצלים ערכת העשרה DNA מסחרית מפוגלתעבור הבידוד של אזורים המפוגלים אלה. המעבדה שלנו הוקרנה מאות דגימות חולות באמצעות טכניקה זו וכאן אנו מספקים פרוטוקול אופטימיזציה מקיף, אשר ניתן להשתמש בם כדי לחקור קבוצות גדולות של מטופלים.

כפי שעולה עם כל טכנולוגית רצף של הדור הבא, MBDCap-seq גם דורש גישה ביואינפורמטיקה ספציפית על מנת לכמת את הרמות של מתילציה במדויק על פני הדגימות. נעשו מחקרים רבים שנערכו לאחרונה במאמץ כדי לייעל את תהליך הנורמליזציה וניתוח של נתוני רצף ^{9, 10.} בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים באחת השיטות הבאות יישום גישת התאוששות קריאה ייחודית - LONUT - ואחריו נורמליזציה ליניארי של כל דגימה על מנת לאפשר השוואות משוחדות על פני מספר רב של דגימות חולות.

Protocol

כל הרקמות מתקבלות לאחר אישור ועדת דירקטוריון הסקירה המוסדית וכאשר כל המשתתפים הסכימו הם בניתוחים מולקולריים ומחקרים ומעקב. הפרוטוקולים מאושרים על ידי ועדת לימודי האדם באוניברסיטת למדעי הבריאות מרכז טקסס בסן אנטוניו.

1. לכידת DNA מתיל-מחייב (MBDCap)

1. איסוף דגימת DNA ובידוד
   1. אסוף גידול בתפזורת או דגימות רקמה נורמליות מן דגימות רקמה מוטבעת פרפין חולה.
   2. השתמש ערכת מיני DNA מסחרית לבודד הדנ"א הגנומי מן דגימות הרקמה מוטבעת פרפין על פי הפרוטוקול של היצרן.
   3. השתמש ערכת העשרה DNA מפוגלת עם ההליך המתואר כאן על פי הפרוטוקול של היצרן.
2. לשטוף חרוז ראשוני
   הערה: חרוזים משמשים זוג עם חלבון MBD-ביוטין, אשר מזהה מתילציה DNA על הגנום. חרוזים בדרך כלל מושעיםבתמיסת מניות. השתמש בשלבים הבאים כדי לשטוף את הנוזל.
   1. Resuspend את המניה של חרוזים streptavidin (ראה לוח חומרים) על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה כדי לקבל השעיה הומוגנית. אין לערבב את החרוזים על ידי vortexing.
   2. ראשית מיקרוגרם של ה- DNA קלט, add10 μL של חרוזים לצינור עם 90 μL של 1x לאגד / הצפת לשטוף. סובב דקות 1. אל תערבב ידי vortexing.
   3. מניחים את הצינור (ים) על מדף מגנטי עבור 1 דקות.
   4. הסר את הנוזל עם טפטפת וזורקים את הנוזל.
   5. הוסף 250 μL של 1x לאגד / הצפה לשטוף את החרוזים ולסובב דקות 1.
   6. חזור על שלבי 1.2.3 - 1.2.5 פעמים.
3. צימוד חלבון MBD-ביוטין חרוזים
   1. עבור 1.2 מיקרוגרם של ה- DNA קלט, להוסיף 7 μL (3.5 מיקרוגרם) של חלבון MBD-ביוטין על צינור אחד.
   2. להוסיף 93 μL של 1x לאגד / הצפה לשטוף לחלבון לעשות נפח סופי של 100 μL.
   3. מערבבים את חלבון חרוזיםתערובת על מערבל סיבוב ב RT במשך שעה 1.
4. הקטועה DNA (קלט)
   1. DNA Sonicate על ידי הוספת 1.2 מיקרוגרם של ה- DNA הגנומי הכולל 96 μL של חיץ TE ו -24 μL של 5x לאגד / לשטוף חיץ לבצע פתרון 120 μL. לשימוש כוח של 30 ו OFF כוח 30 s במהלך sonication, 20 - 25 פעמים.
   2. הפעל 1 μL של פתרון ה- DNA sonicated באמצעות מערכת bioanalyzer עם ערכת DNA מסחרי רגישות גבוהה כדי לבדוק את גודל שברי להיות בטווח של 150 - 350 נ"ב על פי פרוטוקול של היצרן.
5. שטוף את-חרוזי MBD
   1. מניחים את הצינור המכיל MBD-חרוזים על מתלה מגנטי 1 דקות.
   2. הסר וזורקים את הנוזל עם טפטפת בלי לגעת חרוזים.
   3. Resuspend את החרוזים עם 250 μL של 1x לאגד / הצפה לשטוף.
   4. מערבבים את החרוזים על מערבל סיבוב ב RT במשך 5 דקות.
   5. חזור על שלבי 1.5.1 - 1.5.4 פעמים.
6. תגובה ללכוד DNA מקוטע (DNA קלט 1 מיקרוגרם)
   1. מעבירים את התערובת דנ"א / הצפת הצינור המכיל את החרוזים MBD.
   2. מערבבים את-חרוזים MBD עם ה- DNA על מערבל סיבוב של 1 ש 'ב RT. לחלופין, לערבב O / N ב 4 ^מעלות צלסיוס
7. הסרת DNA הלא שנתפסו מן החרוזים
   1. לאחר ערבוב דנ"א MBD-חרוזים, במקום צינור על המדף המגנטי דקות 1. לרכז את כל החרוזים על הקיר הפנימי של הצינור.
   2. הסר את הנוזל supernatant עם טפטפת ולשמור אותו צינור microcentrifuge DNase ללא נקי כמו DNA nonmethylated. אחסן מדגם זה על הקרח.
   3. הוספת 200 μL של 1x לאגד / הצפה לשטוף את החרוזים כדי לשטוף את החרוזים.
   4. מערבבים את החרוזים על מערבל סיבוב 3 דקות.
   5. מניחים את הצינור על מתלה מגנטי 1 דקות.
   6. הסר את הנוזל עם טפטפת ולשמור אותו צינור microcentrifuge.
   7. שווהture התגובות של ≤1 מיקרוגרם של ה- DNA קלט, חזור על שלבים 1.7.3 - 1.7.6 עבור 2 שברים לשטוף יותר בסך הכל.
8. Elution חלק יחיד
   1. מערבבים חיץ דלת מלח עם חיץ גבוה מלח (1: 1) כדי לקבל חיץ elution (1,000 מ"מ NaCl).
   2. Resuspend את החרוזים 200 μL של חיץ elution (1,000 מ"מ NaCl).
   3. דגירה חרוזים על מערבל סיבוב 3 דקות.
   4. מניחים את הצינור על מתלה מגנטי 1 דקות.
   5. עם הצינור במקום על המדף המגנטי, להסיר את הנוזל עם טפטפת בלי לגעת חרוזים עם קצה פיפטה, ולשמור אותו צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge DNase ללא נקי. אחסן מדגם זה על הקרח.
   6. חזור על שלבים 1.8.1 - 1.8.4 פעם, איסוף הדגימה השנייה באותו צינור (הנפח הכולל יהיה 400 μL). חנות המדגם ונקווה על הקרח.
9. ממטרי אתנול (ניקוי DNA)
   1. לכל noncaptured, לשטוף, ו elution חלק from על השלבים הקודמים, להוסיף 1 גליקוגן μL (20 מיקרוגרם / μL, כלולים בערכה), 1/10 מדגם נפח של נתרן אצטט 3M, pH 5.2 (למשל, 40 μL לכל 400 μL של המדגם) ו -2 כרכים מדגם של 100% אתנול (למשל, 800 μL לכל 400 μL של המדגם). ההיקף הכולל הוא 1,241 μL.
   2. מערבבים היטב דגירה ב -80 ^מעלות צלסיוס לפחות h 2.
   3. צנטריפוגה הצינור במשך 15 דקות ב 11,363 XG ב 4 ^מעלות צלסיוס
   4. בזהירות להתעלמות supernatant מבלי להפריע גלולה.
   5. הוספת 500 μL של אתנול 70% קר.
   6. צנטריפוגה הצינור במשך 5 דקות ב 11,363 XG ב 4 ^מעלות צלסיוס
   7. בזהירות להתעלמות supernatant מבלי להפריע גלולה.
   8. חזור על שלבי 1.9.6 - 1.9.7 פעם וסרה supernatant שיורית הנותרים.
   9. אוויר יבש גלולה עבור ~ 5 דקות. אין לייבש את הגלולה לחלוטין.
   10. Resuspend גלולה DNA ב 37.5 μL של מים ללא DNase או אחריםהיקף המאגר מתאים.
   11. מניחים את ה- DNA על הקרח או לאחסן את ה- DNA ב -20 ^מעלות צלסיוס או מתחת עד לשימוש נוסף.
   12. בדוק כי הסכום הכולל של ה- DNA הוא מעל 20 ng, (למשל, להשתמש במערכת quantitation fluorometric, ראה לוח חומרים).

רצף 2.

1. השתמש שברי הדנ"א שנמצא הליך MBDCap על רצף. עבור כל דגימה כדי להיות רצף, בסכום כולל של 20 - 40 DNA ng נדרש הכנת ספרייה.
2. להכנת ספרייה-seq DNA להשתמש במערכת בניית ספרייה אוטומטית לחלוטין (ראה לוח חומרים) ופעל לפי הפרוטוקול הסטנדרטי המסופק על ידי היצרן. קטעי דנ"א בחר בגודל 200 - נ"ב 400 להכנת הספרייה. המערכת כן ספריית האוטומציה מאפשרת סטנדרטיזציה של הליך הכנת הספרייה ומזעור הווריאציה על פני הדגימות בשל הכנה ידנית.
3. ממשלת מתאם השתמשrs ו לדלל את ריכוז 100x. מתוך זה, השתמש 10 μL עבור כל דגימה.
4. בעקבות צעד 2.2, להוציא את התגובה, ולכמת את הספרייה seq-דנ"א באמצעות מערכת quantitation fluorometric (ראה לוח חומרים).
   1. הגדרת הליך הגברת PCR. הבחירה של שילוב הורים PCR היא לשפר את יעילות ה- PCR של אזור מועשר GC של הגנום. בתוך צינור PCR, להוסיף 15 μL הספרייה DNA-seq, 25 תמהיל מאסטר μL PCR (ראה לוח חומרים), 2 תערובת פריימר μL PCR (ראה לוח חומרים), ו -8 μL H ₂ O.
5. בהתאם להמלצת PCR מיצרן של מיקס מאסטר PCR, שינוי פעמי אופניים וטמפרטורות עבור חומרי מוצא אינם אחידים: 98 ^o C למשך 45 שניות, מחזורי X של 98 ^o צלזיוס למשך 15 שניות, 65 ^o C למשך 30 שניות, 72 ^o צלזיוס למשך 30 s ולאחר מכן 72 ^מעלות צלסיוס 1 דקות. חזק ב 4 ^מעלות צלסיוס
   1. PerfORM מספיק מחזורים כדי בסופו של דבר עם 2 - 10 ננומטר של ה- DNA ספריה (8 - 10 מחזורים).
6. לנקות תגובת PCR עם 1: 1 יחס של חרוזי טיהור PCR על פי הפרוטוקול של היצרן (ראה לוח חומרים).
7. Elute עם 20 - חיץ elution 30 μL.
8. ברקוד מדגם וברכת 4 דגימות יחד לנתיב אחד של תא זרימה. השתמש בפרוטוקול הקריא ליחיד 50 נ"ב עבור סידור (ראה לוח חומרים).

3. ביואינפורמטיקה ניתוח

הערה: תהליך נוסף קבצי fastq הגלם המתקבלים רצף לבצע בקרת איכות ומיפוי רצפי דנ"א הקצר (כניסות) לגנום.

1. השתמש Bowtie קצר לקריאה aligner, כלי מיפוי הגנום על כל קובץ מדגם fastq למפות את מקריא הגנום התייחסות. כלי מיפוי קריאה רבים זמינים לבצע שלב זה וניתן להשתמש בו על בסיס העדפה אישית.
   1. אפשר עד 2 חוסר התאמה של וולדואר קורא תוך מיפוי הגנום ההתייחסות. דווח עד 20 המערכים טובים ביותר עבור כל אחד מהם קראו. לדוגמה, השתמש עניבת פרפר -v 2 --best -k 20 --chunkmbs 200 .
2. השתמש LONUT ⁹ לשחזר את להכפיל ממופה קורא לשיפור זיהוי של האזורים המועשרים. עבור כל קריאה, לכל היותר יישור אחד יהיה התאושש כאשר היא קרובה מספיק לכל הפסגות בשם לעיל. לדוגמה, השתמש: perl lonut.pl -G hg19 -w 250 -p 99 . LONUT יבצע את הפעולות הבאות.
   1. מערכי פיצול ממופים באופן ייחודי קוראים להכפיל ממופה קורא. שיא על Call ממופה באופן ייחודי קורא באמצעות מתקשר שיא חגורת ^11. האפשרות -w 250 -p 99 בפקודה למשל הם עבור חגורה.
   2. לשלב באופן ייחודי ממופה קורא עם התאושש קורא המתקבל LONUT, ואת בשילוב קורא, בפורמט BED, ישמש לניתוח נוסף. לחשב את מספר COMBINאד קורא לנורמליזציה בעתיד.
3. סל קורא. חלץ קורא האזור של עניין באמצעות סקריפט perl: perl methyPipeline.pl -up <הזרם הארכת אורך> -dn <במורד אורך הארכת>. עבור כל קובץ מיטה המפורט sampleInfoFile, תסריט פרל מבצע את המשימות שלהלן.
   הערה: ראה קובץ קידוד משלים סקריפט Perl.
   1. סל קורא לתוך גודל סל קבוע, למשל, 100 נ"ב, עבור 24 כרומוזומים.
   2. עבור כל גן המפורט refGeneFile, לחלץ את הפחים סביב אתר תחילת שעתוק (TSS), עד אורך ההרחבה המתאים אפשרות -up ו -dn. לדוגמה, לחלץ את הנתונים באזור זה מלמעלה ועד למטה 4 kb של TSS. ב- BP סל גודל 100, זה חילוץ יש נתונים 81 פחים, ואת סל המרכז תואם את TSS.
   3. עבור הגן על גדיל antisense, להעיף באזור חילוץ משמאל לימין כך פחי הזרם הם תמיד PLACED בצד שמאל עם סקריפט Perl.
   4. בהמשך לפצל באזור TSS ± ​​4 kb לשלושה אזורים תת: שמאל, נגד הזרם 4 kb כדי במעלה הזרם 2 kb; התיכון, מעלה kb 2 במורד הזרם; נכון, זרם 2 kb עד 4 קילו.
   5. עבור כל דגימה, לחלק את הספירה של קורא כל סל במספר הכולל של משולב ממופה קורא מחושב ב 3.3.3. הנורמליזציה תבטל את ספציפיים המדגם לקרוא הבדלים ומאפשרת להשוות את הקורא ברחבי מדגמים שונים.
4. להריץ את הסקריפט bash (כמצוין קובץ סקריפט) לבצע בדיקה סטטיסטית על מנורמל קורא המתקבל באזור שמאלה, כדי לזהות מתילציה הפרש בין קבוצה הנורמלית במקרה באזורים המתוארים באזור האגף.
   הערה: עיין קובץ הקידוד משלים את תסריט bash. בהתבסס על אזורים כי הם מפוגל דיפרנציאלי, ישנם שבעה שילובים:
   האזור כולו: מתילציה ההפרש ברחבי האזור kb ± 4 TSS
   MiddleLeft: מתילציה ההפרש בשני באזור האמצעי ויצא
   MiddleRight: מתילציה ההפרש בשני באזור באמצע וימינה
   מתילציה הפרש בשני באזור על ימין ועל שמאל: צלע
   מתילציה הפרש באזור נותר רק: שמאל
   מתילציה הפרש באזור נכון יחיד: תקין
   מתילציה הפרש באזור אמצעי יחיד: תיכון
5. השתמש באותו סקריפט bash כדי להמחיש את מתילציה דיפרנציאליים עלילת טורנדו. עלילת הגנים המפוגלים Hyper היפו בפנל נפרד, ולמיין לפי סדר שילוב באזור כמתואר 3.4, בהתאמה.

תוצאות

השתמשנו MBDCap-seq ללמוד שינויים מתילציה DNA במספר רב של חולים בסוגי סרטן שונים, כולל השד ^12, רירית הרחם ^13, הערמונית ^14, וסרטן הכבד בין היתר. כאן אנו מדגימים כמה פרטים ממחקר סרטן השד פרסם ¹² לאחרונה. במקרה זה, השתמשנו גישת רצף הגנום כולו לזהות איי CPG כי הם מפוגלים דיפר...

Discussion

טכניקת MBDCap-seq היא גישת העשרת זיקת ^3, נחשבת כאלטרנטיבה חסכונית כאשר חוקרים מחזורים עם מספר רב של חולים ^15. הצינור המובא כאן מתאר גישה מקיפה מן רכש מדגם ניתוח נתונים ופרשנות. אחד הצעדים החשובים ביותר הוא הגדרת הליך הגברת PCR כדי לשפר את יעילות PCR של האזורים המועשרים GC בגנום ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylminer DNA enrichment Kit	Invitrogen	ME10025
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	112-05D
Bioruptor Plus Sonication Device	diagenode	B01020001
3 M sodium acetate, pH 5.2	Sigma	S7899	100 mL
SPRIworks Fragment Library System I	Beckman Coulter	A50100	Fully automated library construction system
Adapter Primers	Bioo Scientific	514104	PCR primer mix
Qubit	Invitrogen	Q32854	Fluorometric Quantitation System
PCR master mix	KAPA scientific	KK2621	PCR master mix
AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	PCR Purification beads
EB Buffer	Qiagen	19086
HiSeq 2000 Sequencing System	Illumina