ויזואליזציה של מולקולות DNA גדולות קשור Surface עם DNA חלבון פלואורסצנטי כריכת פפטיד

Summary

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Abstract

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

Introduction

ויזואליזציה של מולקולות דנ"א גדולות קשורות ברצועה על משטחי זכוכית או חרוז נוצלה על חקירת אינטראקציות חלבון דנ"א, דינמיקת חלבון על מצע DNA, ^1,2 ופיזיקת פולימר. ^3,4 פלטפורמת מולקולות דנ"א גדולות יחידות קשורות יש כמה ברור יתרונות בהשוואה לשיטות וקיבוע DNA אחרים. ⁵ ראשית, מולקולת דנ"א גדולה הקשורה על פני השטח יש קונפורמציה טבעי אקראי סליל ללא אספקת גזירה, מהם החשיבות מכרעת עבור חלבון-DNA מחייבת להכיר אתר הקישור שלו. שנית, זה מאוד קל לשנות את הסביבה הכימית סביב מולקולות DNA לסדרת תגובות אנזימטיות בתא זרימה. שלישית, זרימת גזירת microfluidic גורמת DNA המולקולרית המתיח עד 100% של אורך המסלול המלא, וזה מאוד קשה להשיג באמצעות התארכות DNA גישות חלופית כגון משטח וקיבוע ⁶ וכליאת nanochannel. ⁷ מלא stretcheמולקולת הדנ"א ד גם מספקת מידע מיקומית כי יכול להיות שימושי עבור ניטור תנועות האנזימטית על המפה הגנומי.

אף על פי כן, גישת קשירת DNA יש חסרון קריטי כי לצבוע intercalating כגון YOYO-1 בדרך כלל גורם למולקולות DNA קשורות להישבר בקלות על ידי אור עירור קרינה. באופן כללי, מולקולות דנ"א גדולות צריכות להיות מוכתמות עם פלורסנט לצבוע להדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לשם כך, YOYO-1 או צבעי סדרת הטוטו אחרים משמשים בעיקר בגלל צבעים אלה לזרוח רק כשהם intercalate פעמיים גדילי דנ"א. ⁸ עם זאת, ידוע כי bis-intercalating לצבוע גורם צילום מחשוף DNA האור הנגרמת בגלל של עיבור fluorophores. ⁹ יתר על כן, מולקולות DNA מוכתמות fluorescently הקשור על פני השטח הן יותר שבירות מאז תזרים גזירה יכול להפעיל שבירת כוחות על העברת מולקולות DNA באופן חופשי. לכן, פיתחנו FP-DBP כרומן DNA-מכתים חלבון לצבוע הדמית מולקולות דנ"א גדולות קשורות ברצועה על פני השטח. היתרון של שימוש FP-DBP הוא שזה לא לגרום צילום מחשוף של מולקולות DNA שאליו הוא נקשר. ¹⁰ בנוסף, FP-DBP אינה מגדילה את אורך קווי המתאר של ה- DNA, ואילו צבעים-intercalating bis להגדיל את אורך המסלול בכ -33%.

שיטת וידאו זה מציגה את הגישה ניסיון אולי לקשירת מולקולות דנ"א גדולות משטח PEG-ביוטין. איור 1 מדגים גישות שונות של קשירת DNA עם קצוות בוטים קצוות דביקים. לכן, שיטה מכתימה זה יכול להיות מיושמת על כל סוג של מולקולת הדנ"א. איור 2 מתאר ייצוג סכמטי של הרכבת תא הזרימה שיכולה להיות נשלטה על ידי משאבת מזרק כדי ליצור תזרים גזירה למתוח מולקולות דנ"א וכן לטעון כימיים אנזים פתרונות. איור 3 מדגים micrographs של מולקולות DNA נמתח מלא קשורה על PEGylatמשטח ed ¹¹ ומוכתם FP-DBP.

Protocol

1. DNA biotinylation

1. Biotinylation של DNA חוד מעוגל באמצעות מסוף transferase (TDT)
   הערה: השתמש T4 DNA (166 KBP), שהינה DNA חוד מעוגל.
   1. הוסף 5 μl של 2.5 מ"מ ₂ CoCl, 5 μl של 10 × חיץ התגובה, 0.5 μl של 10 מ"מ ביוטין-11-dUTP, 0.5 μl של transferase הטרמינל (10 יחידות), ו -0.5 μl של ה- DNA T4 (0.5 מיקרוגרם / μl) לתערובת התגובה. הפוך לנפח סופי של 50 μl ידי הוספת 38.5 μl של מים.
   2. דגירת תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
      הערה: זמן תגובה מורחבת עשוי להניב הדנ"א הדו-קשור, כלומר, יתכן כי biotins מתויג בשני קצותיו.
   3. עצור את התגובה על ידי הוספת 5 μl של 0.5 מ 'EDTA, pH 8.
   4. שמור את הצינור על 4 מעלות צלזיוס.
2. Biotinylation של DNA הסתיימה דביק שימוש DNA האנזים
   הערה: DNA λ השתמש (48.5 KBP), שהינה DNA דביק-סוף.
   1. הוסף 1 μl של ה- DNA האנזים T4, 5 μl של חיץ קשירת 10 ×, 1 μl של 25 ng / μl DNA הפאג λ, ולהוסיף 43 μl של מים כדי ליצור נפח סופי של 50 μl.
   2. שמור את הצינור על 4 מעלות צלזיוס.

2. derivatization Surface הפונקציונלי

הערה:. על מנת לקשור קץ של מולקולת דנ"א על משטח זכוכית, קבוצה אמינית העיקרי הוא silanized על coverslip ואחריו ציפוי ביוטין-PEG כפי שמוצג באיור 1 תהליך PEGylation זה חשוב הדמיה DNA מולקולה בודדת כי זה יכול להקטין אקראי רעש נוצר על ידי התקשרות של רצויי מולקולות משמעותיים על פני השטח.

1. פיראנה ניקוי
   הערה: פתרונות פיראנה להגיב נמרצות עם חומרים אורגניים, ולכן זה צריך להיות מטופל בזהירות, עמידה בהנחיות בטיחות נאותה.
   1. מקום coverslips על מדף polytetrafluoroethylene (PTFE), ולהחזיק אותם בy PTFE חותם חוט קלטת לאורכו, חצי על קצה משטחים וחצי על המדף. לאחר גלישה, להשאיר חתיכה ארוכה (~ 5 סנטימטרים) של סרט לטיפול המתל במהלך הליך הניקוי.
   2. ממלאים כוס זכוכית 1 ליטר עם 350 מ"ל של H ₂ SO ₄ ו -150 מ"ל של H ₂ O ₂ כדי להפוך פתרון פיראניה במנדף. מניחים את מתלה בתמיסה פיראניה במשך שעה 2..
   3. פתרון פיראניה ריק מן הקנקן, ולשטוף coverslips ביסודיות עם מים ללא יונים עד pH של המים בכוס מגיע נייטרלי. השתמש רצועות נייר pH.
   4. Sonicate המדפים של תלושים לכסות במים המכילים המבחנה, למשך 30 דקות. מים ריקים מהקנקן רק לפני silanization אמינו. השתמש 75 ואט sonication לנקות derivatize מצעי הזכוכית.
2. Aminosilanization על משטח זכוכית
   1. הוסף 2 מ"ל של N - [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylenediamine ו -10 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית 200 מ"לשל מתיל אלכוהול במיכל פוליפרופילן נקי להכנת הפתרון aminosilanization.
   2. מניחים coverslips לנקות בתוך המיכל פוליפרופילן. לנער אותם ב 100 הטמפרטורה סל"ד ו החדר למשך 30 דקות.
   3. Sonicate כוס עם מכסה מחליק derivatized במשך 15 דקות ב 75 W. לנער אותם ב 100 הטמפרטורה סל"ד ו מקום לפחות 30 דקות.
   4. רוקן את הפתרון מן הקנקן, ולשטוף coverslips בזהירות, פעם עם אלכוהול מתיל, ופעמיים עם כוהל אתילי. coverslips אחסן כוהל אתילי ולהשתמש בהם תוך שבועיים.
3. PEGylation של coverslip
   1. הפוך 10 מ"ל של 0.1 מ 'סודיום ביקרבונט (NaHCO _3). סנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
   2. ממיסים 2 מ"ג של קרבונט ביוטין-PEG-succinimidyl (ביוטין-PEG-SC) ו -80 מ"ג של valerate PEG-succinimidyl (MPEG-SVG) ב 350 μl של NaHCO _3. השתמש צינור הגנת אור.
   3. וורטקס צינור נמרצות במשך 10 שניות, צנטריפוגות אותו ב 10,000 g × דקות 1 כדי להסיר בועות.
   4. יש לשטוף שקופית זכוכית עם אצטון, ואחריו שטיפה עם כוהל אתילי. אפשר את השקופית אוויר יבש לחלוטין.
   5. מניח ירידה (50 μl) של פתרון PEG בשקופית הזכוכית הנקיה. מכסים את אגל בעדינות עם תלוש כיסוי silanized אמינו, מבלי ליצור בועות.
   6. מקום שקופית עבור 3 שעות עד לילה חשוך, גם מפולס בתא לח בטמפרטורת חדר. השתמש בעל קצה פיפטה וריק כמו התא, עם מים בתחתית. חותם פתרון PEG שיורית בצינור ולשמור אותו על 4 מעלות צלזיוס.
   7. שוטפים את coverslip PEGylated ביסודיות עם מים ללא יונים. אחסן אותו במקום חשוך ויבש עד השימוש.

3. הרכבת תא זרימה

1. לפברק בעל אקריליק אגרוף, כמו באיור 2. ודא בקוטר של להכניס צינורות הוא 0.762 מ"מ, וציין חור אחד הוא מפרץ קטן והשני הואלשקע (איור 2).
2. מניח רצועות סרט דביקות דו-צדדיות (רוחב 5-6 מ"מ) על בעל אקריליק (איור 2), יישור בניצב חור כניסה ויציאה, לא מביך כל חורי ערוץ. השתמש רצועות קלטת אלה קירות רב ערוצית לעשות תאים. שפשפו את הקלטת באמצעות קצה pipet.
3. מניחים coverslip PEGylated על העליונה כדי ליצור תאי זרימה, כשהצד PEGylated עם הפנים כלפי מטה.
4. כדי למנוע כל פתרון דליפה, לחץ על החלק העליון של coverslip על האזור שבו קלטות דו צדדית ממוקמות. להוסיף דבק אפוקסי מהיר יבש כדי לסגור את הקצוות של החדר בראש בתחתית (צבע צהוב באיור 2).
5. חבר קטע קצר (2.5 ס"מ) של צינורות (קוטר חיצוני, OD, 0.042 ") כדי מזרק חזק גז ולאטום המפרק עם דבק אפוקסי.
6. חבר צינורות (OD: 0.03 ") ארוכים וגמישים אל הצינורות צמודים המזרק ולאטום מפרק עם דבק אפוקסי.
7. מלא את הטוביםng צמוד מזרק עם מים די. ודא שאין בועות אוויר.
8. הכנס את הצינור לתוך החור של תא הזרימה חתום עם דבק אפוקסי.
9. מניחים טיפ צהוב (200 קצה μl) על החור אחרים כמאגר.

4. טוענים דוגמא אל לשכת התזרים

הערה: Neutravidin ניתן להחליף חלבונים avidin אחרים כגון streptavidin. כל התגובות יכול להתבצע בטמפרטורת החדר, אלא אם כן היא מוזכרת. קח פתרון מדגם טיפ צהוב, ולהתקין את הקצה עם הפתרון לתוך החור של בעל אקריליק (איור 2b).

1. הגדר את קצב הזרימה של המשאבה מזרק ב 50 μl / min. טען 20 μl של חלבון avidin (25 מיקרוגרם / מ"ל ​​בתמיסה T50, טריס 10 מ"מ, 50 מ"מ NaCl, pH 8), ולשמור אותו במשך 10 דקות.
2. טען 20 μl של oligodeoxynucleotides biotinylated (100 מיקרומטר 1 × TE), ולשמור אותו במשך 10 דקות. אם transferase הטרמינל משמש, לדלג על הטעינהשל oligodeoxynucleotides.
3. טען 20 μl של פתרון ה- DNA משלב 1 לתוך תא זרימה בקצב זרימה של 10 μl / min, ולשמור אותו במשך 30 דקות.
4. שטפו את תא הזרימה עם 1 × TE, ולטעון 40 μl של ¹⁰ FP-DBP (~ 80 ננומטר).
5. שים DNA תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם זרימה רציפה של מולקולות מכתימות ב 1 × TE על עדשה אובייקטיבית 60X. השתמש 488 לייזר מצב מוצק ננומטר עירור של FP (eGFP) -DBP. עבור מתיחה מלאה של מולקולות DNA, להחיל ספיקות שונות לפי אורכי DNA בשימוש. לדוגמה, להחיל 50 μl / min 48.5 KBP של DNA λ, ו 100 μl / min 166 KBP של דנ"א T4.
   1. עבור מחזור של בעל אקריליק, להשרות תאי זרימה התאספו בתמיסת דטרגנט בית ^12. הסר קלטות אפוקסי עם סכין גילוח ולשפשף עם ידות כדי לקחת אותם לגמרי. סתימה חורה עם מחטי מזרק. שמור על הבעלים במי deionized עד לשימוש נוסף.

תוצאות

איור 1 מציג שתי שיטות קשירת DNA שונות בהתאם מבני מסוף של מולקולת הדנ"א. האיור 1 א ממחיש כיצד מולקולות DNA הסתיימו הדביקות הם הכלאה עם oligonucleotides biotinylated משלים, אשר משותק על פני שטח PEG מצופה avidin. 1B איור מראה תוספת של biotinylated ddNTP או d...

Discussion

כאן אנו מציגים פלטפורמה המאפשר הדמיה מולקולות דנ"א ארוכות biotinylated לעיגון על משטחים. דיווחנו גישה עבור מולקולות DNA קשור על משטח מצופה חלבון avidin עם אלבומין בסרום שור biotinylated. ⁶ לפי הגישה קודם לכן, מצאנו נושא מכריע של מחשוף צילום DNA הנגרם על ידי צבעי bis-העיבור כי להכ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase	New England Biolabs	M0315S	Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride
Biotin-11-dUTP	Invitrogen	R0081	Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA	Nippon Gene	318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E6758	EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S	Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA	Bioneer	D-2510	Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip	Marienfeld-Superior	0101050	22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack			Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape	Han Yang Chemical Co. Ltd.	3032292	Teflon™ tape
Sulfuric acid	Jin Chemical Co. Ltd.	S280823	H2SO4, 95% Purity
Hydrogen peroxide	Jin Chemical Co. Ltd.	H290423	H2O2, 35% in water
Sonicator	Daihan Scientific Co. Ltd.	WUC-A02H	Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine	Sigma-Aldrich	104884
Glacial Acetic Acid	Duksan Chemicals	414	99% Purity
Methyl Alcohol	Jin Chemical Co. Ltd.	M300318	99.9% Purity
Polypropylene Container	Qorpak	PLC-04907
Ethyl Alcohol	Jin Chemical Co. Ltd.	A300202	99.9% Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Syringe Filter	Sartorius	16534----------K
Biotin-PEG-SC	Laysan Bio	Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
Acetone	Jin Chemical Co. Ltd.	A300129	99% Purity
Microscope Slides	Marienfeld-Superior	1000612	~76 mm x 26 mm x 1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support			Custom Fabrication
Double-sided Tape	3M		Transparent type
Quick-dry Epoxy	3M
Polyethylene Tubing	Cole-Parmer	06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe	Hamilton	81165
Syringe Pump	New Era Pump Systems Inc.	NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin	Thermo Scientific	31000
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503-5KG	Trizma base
Microscope	Olympus	IX70
EMCCD Camera	Q Imaging	Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm)	Oxxius	LBX488
Alconox	Alconox Inc.