JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

תאים הגדלים בסביבה תלת-ממדי (3-D) מייצגים שיפור ניכר לעומת טיפוח התא בסביבות 2-D (למשל, צלוחיות או מנות). כאן אנו מתארים את הפיתוח של מודל organotypic 3-D רב-תאיים של רירית המעי אדם מתורבת במיקרוגרבטיציה הניתנים על ידי החלפה-קיר-כלי (RWV) bioreactors.

Abstract

מכיוון תאים הגדלים בסביבה תלת-ממדי (3-D) יש פוטנציאל לגשר על פערים רבים בטיפוח התא בסביבות 2-D (למשל., צלוחיות או מנות). למעשה, זה זוכה להכרה רחבה כי תאים שגודלו צלוחיות או מאכלים נוטים דה להבדיל ולאבד תכונות מיוחדות של הרקמות שמהם הופקו. נכון לעכשיו, יש בעיקר שני סוגים של מערכות תרבות 3-D שבו התאים הם זורעים לתוך פיגומים מחקו את תאי מטריקס הילידים (ECM): (א) מודלים סטטיים (ב) מודלים באמצעות מתקני גידול. פריצת הדרך הראשונה הייתה 3-D מודלים סטטיים. מודלי 3-D באמצעות מתקני גידול כגון קיר-סיר המסתובב (RWV) bioreactors הם התפתחות מאוחרת יותר. הרעיון המקורי של bioreactors RWV פותחה במרכז החלל ג'ונסון של נאס"א בתחילת 1990 והוא האמין להתגבר על המגבלות של מודלים סטטיים כגון פיתוח של חוסר חמצן, ליבות נמקי. Bioreactors RWV עלול לעקוף הבעיה על ידי מתן דינמיקה של נוזלים המאפשרות דיפוזיה של חומרים מזינים וחמצן היעיל. הגידול האלה מורכב בסיס מסובב המשמש לתמיכה ולסובב בשני פורמטים שונים של כלי תרבות שונות לפי סוג מקור האוורור שלהם: (1) איטי כלי Lateral מפנה (STLVs) עם oxygenator קואקס במרכז, או (2 כלי יחס ממדים גבוהים) (HARVs) עם חמצון באמצעות קרום העברת גז שטוח, גומי סיליקון. כלים אלה מאפשרים מעבר של גז יעיל תוך הימנעות היווצרות בועה והטורבולנטיות סוגרת. תנאים אלה לגרום זרימה למינרית וכוח גזירה מינימלי שמודלים מופחת הכבידה (כבידה) בתוך כלי התרבות. כאן אנו מתארים את הפיתוח של מודל organotypic 3-D רב-תאיים של רירית המעי האנושית המורכבת קו תא אפיתל מעי לימפוציטים אדם מן המעלה ראשון, תאי האנדותל פיברובלסטים מתורבתים במיקרוגרבטיציה שמספק bioreactor RWV. </ P>

Introduction

פריצת הדרך הראשונה בבניית מודל 3-D מדווח מוקדם של 1980, כאשר מדענים החלו לחקור סוגים שונים של הפיגום (למשל., Laminin, אני סוג קולגן, קולגן IV, ו פיברונקטין) וקוקטיילים של גורמי גדילה כדי לשפר תא אל תא אינטראקציות ECM של "סטטי" 3-D מודלי 1-7. מאז, הבעיה העיקרית עם המודלים האלה כבר מגבלות בהעברת חומרי מזון וחמצן בתוך מבנים בינוני ורקמות 8. בניגוד תאים בסביבה vivo שמקבלת זרימה קבועה של חומרי מזון וחמצן מן סובבי רשתות של כלי דם, האופי סטטי של מודלים אלה מעכב את ההפצה היעילה של אותם התאים. לדוגמה, אגרגטים התא שנוצר במודלים במבחנה סטטי החורגות כמה מילימטרים בגודל תמיד יפתחו היפוקסי, ליבות נמקי 9. Bioreactors RWV עלול לעקוף בעיה זועל ידי מתן דינמיקה של נוזלים המאפשרים דיפוזיה יעילה של חומרים מזינים 10-12 חמצן. עם זאת, עד כה, עבודה באמצעות מתקני גידול RWV הייתה מוגבלת הכללת סוגי תאים אחד או שניים 13-17. יתר על כן, במקום אוריינטציה מרחבית דומה רקמות הילידים, תאים אלה יצרו אגרגטים התא. הסיבה העיקרית המגבלות האלה כבר החוסר של פיגום מסוגל לשלב תאים בצורה משולבת. הפיגומים ששמשו מתקני גידול RWV עד כה מורכבים, עם כמה יוצא מן הכלל 16-18, בעיקר של microbeads הסינטטי, בלוני צינורי או גיליונות קטנים 13-15,19-23. רכב וגמישות אלו הם חומרים נוקשים אשר לא ניתן להשפיע, וכדי שבו תאים מחוברים פני השטח שלהם. לפיכך, אין זה סביר כי מודלים אלה יספקו מערכת שבה להעריך, בצורה משולבת, מרכיבי התאים השונים כגון תאי סטרומה (למשל., פיברובלסטים, תאי מערכת חיסון ואת אנדותל) כי הסעיףhould להיות מפוזר בתוך הפיגום לחקות רקמה אנושית מקרוב.

כאן אנו מתארים את הפיתוח של מודל organotypic 3-D רב-תאיים של רירית המעי האנושי מורכב קו תא אפיתל המעי לימפוציטים אדם מן המעלה הראשונה, תאי אנדותל, פיברובלסטים ו 24. תאים אלה היו בתרבית במיקרוגרבטיציה לספק ידי bioreactor RWV 13,25-30. במודל 3-D שלנו, ECM הוא בעל מאפיינים ברורים רבים, כגון osmolality דומה עד בינוני התרבות (למשל., מעצורי diffusional זניחים במהלך התרבות) ואת היכולת לשלב תאים וחלבונים מטריקס רלוונטיים אחרים, כמו גם קשיחות המתאים לשמש bioreactors 24. מערכות ביולוגיות מורכבות מאוד, ובמהלך השנים האחרונות, חלה תזוזה במוקד המחקר רירי לקראת בחינת אינטראקציות תא עם סביבתם ולא לומד אותם isolation. בפרט, את החשיבות של אינטראקציות תאי תאים בהשפעת הישרדות תא מעיים והבחנה מתועדת היטב 31-34. באופן ספציפי, את התקשורת בין תאי אפיתל הנישה שלהם יש השפעה עמוקה על הרחבת תא אפיתל בידול 35. אכן, מקובל כי לא רק תא אל תא, אלא גם תא אל ECM אינטראקציות הן קריטיות התחזוקה וההתמיינות של תאי אפיתל במודלי תרבות 3-D. מחקרים קודמים הראו כי חלבונים במעיים ECM כגון קולגן אני 24,36,37, 38 laminin ו -39 פיברונקטין הם סייעו המשפיעים תאי האפיתל במעי לרכוש התמצאות מרחבית דומה רירית הילידים. לפיכך, הפיתוח של טכנולוגיות חדשות, כמו המודל 3-D שלנו 24, שיכול לחקות את המגוון פנוטיפי של המעי נדרש אם חוקרים מתכוונים לשחזר את האדריכלות הסלולר מבנית המורכבתותפקוד של microenvironment הבטן. מודלים אלה מייצגים כלי חשוב בפיתוח וההערכה של תרופות פומיות חדשות ומועמדי חיסון.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל דגימות הדם נאספו מתנדבים שהשתתפו מספר פרוטוקול HP-00,040,025-1. האוניברסיטה של ​​דירקטוריון סקירה המוסדית מרילנד פרוטוקול שאושר זה והסמיך את אוסף דגימות דם ממתנדבים בריאים עבור המחקרים כללו בכתב היד הזה. מטרת מחקר זה הוסבר מתנדבים, וכל המתנדבים נתן הודיע, חתמו הסכמה לפני לקיחת הדם.

הערה: ראה טבלה 1 להכנת תוספת בינונית. ראה טבלה 2 לעריכת התקשורת והתרבות 3-D.

1. הכנת כלי תרבות

  1. פתחו את הברגת הפקק של הנמל מילוי של 50-כלי מ"ל ולמלא עם 50 מ"ל של מדיום תרבות סטרילי (למשל., RPMI). לבצע את כל ההליכים בתנאים סטריליים במנדף למינרית.
  2. החזר את המכסה ולנגב בכל מדיום נשפך על כל משטח עם אתנול 70%.
  3. אפשר הספינה כדי incubאכלתי לארוחת דקות 15 לפחות כדי O / N ב RT.
  4. השתמש ביציאת המילוי כדי להשליך את המדיום תרבות ולהוסיף 30 מ"ל של מדיום תרבות 3-D.
  5. נגב בכל מדיום נשפך על כל משטח עם 70% אתנול.

2. הכנת התאים

  1. קו תאים אנושיים אפיתל (HCT-8) 24,40.
    1. התרבות תאים ב RPMI בתוספת 100 פניצילין U / ml, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין, 2 מ"מ L- גלוטמין, 1 פירובט נתרן מ"מ, 10 מ"מ HEPES חיץ 10% בסרום שור העובר מומת חום (FBS ) (תוספת 1). בשעה 70% confluency, תאים פיצול ביחס של 1: 5.
  2. פיברובלסטים גס אדם (תאים-18Co CCD) 24,41.
    1. תרבות תאים במדיום של Basal הנשר מועשר תוספת 1 ​​בשעת confluency, תאי פיצול ביחס של 1:. 3.
  3. האנדותל וריד טבור אדם (HUVEC) תאים 24,42.
    1. התרבות תאים ב האנדותל בסל בינוני (EBM) מועשר בינוני עם 100 מיקרוגרם / מ"ל הפרין, 3 מיקרוגרם / מ"ל מוסף צמיחה תא האנדותל (ECGs), ומשלימים 1 בשעה 70% confluency, תאים פיצול ביחס של 1: 2..
  4. לימפוציטים / מונוציטים
    1. לבודד תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMC) מן הדם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות באמצעות טכניקות סטנדרטיות 43.
      1. בקצרה, בעזרת פיפטה מ"ל-10, בזהירות להוסיף 30 מ"ל של דם מדולל (1: 1 דם: בופר פוספט (PBS)) לתוך צינור מ"ל-חרוטי 50 המכיל 10 מ"ל של התקשורת צנטריפוגה צפיפות. לאחר שלב צנטריפוגה, לימפוציטים ומונוציטים יתגוררו בשכבה "הלבנה" בין תקשורת צנטריפוגה הצפיפות ושכבות פלזמה.
      2. אסוף את השכבה הלבנה בעזרת פיפטה העברה. הימנע זיהום גרנולוציט ידי הגבלת אוסף המדיה צנטריפוגה צפיפות. לאחר שטיפת 43, use PBMC כמו שהוא או cryopreserved בנוזל N 2.
        הערה: חשוב להדגיש כי PBMC מורכב בעיקרו של לימפוציטים ומונוציטים, עם חלק קטן של תאים דנדריטים סוגי תאים אחרים.
  5. לגדול כל התאים בתנאי תרבות סטנדרטיים ב 37 ° C באווירה של 5% CO 2.

3. הכנת תאים קולגן מוטבע

  1. לקבוע את מספר הוסיף צורך בהתבסס על מספר תנאי ניסוי כדי להיות הגדרה. מניחים את המספר המתאים של מוסיף לתוך הבארות של צלחת 6 באר.
  2. כן השעיה של HUVEC ו פיברובלסטים:
    1. פעמיים שטפו את צלוחיות ב PBS ולנתק את התאים באמצעות טריפסין, 0.25% (1x) עם ethylenediaminetetraacetate 0.05% טריפסין-tetrasodium (טריפסין-EDTA). הוסף פתרון טריפסין מספיק כדי לכסות את מכלול שטח הפנים תרבית תאים. ניתוק מתרחש בדרך כלל תוך 5 עד 15 דקות
    2. לאסוףתאים מנותקים בתוך שפופרת מיליליטר-50 המכילה 30 מיליליטר של המדיום של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) -30% בינוניים FBS.
    3. צנטריפוגה הצינור ב XG 500 במשך 10 דקות.
    4. Resuspend התאים 30 מ"ל של מדיום FBS% DMEM-30.
    5. לספור את המספר הכולל של תאי קיימא על ידי דילול 20 μl של תאי resuspended עם 20 μl של צבע כחול Trypan. טען את hemocytometer עם תערובת תאים. PBMCs בת קיימא תהיה לבן ברור; PBMC nonviable ירכוש לצבוע ולהיות כחול.
      1. Resuspend כל סוג תא במדיום DMEM-30% FBS בריכוז של 5 - 8 x 10 מ"ל 7 תאים - 1.
  3. כן ג'ל קולגן המכיל תאים
    הערה: כל כלי ידרוש ההכנה ~ 5 מיליליטר של ג'ל קולגן תא המכיל.
    1. בתוך צינור מ"ל-חרוטי 50 להכין את התערובת קולגן על ידי הוספת 1 x DMEM התקשורת, בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין, 2 מ"מ L- גלוטמין ו -10% חום-inactivated FBS בתוספת 3 מ"ג / שור מ"ל קולגן-I, 10 מיקרוגרם / laminin מ"ל, 40 מיקרוגרם / קולגן IV מ"ל, 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​פיברונקטין, 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​proteoglycan סולפט הפרין ו -15 מ"מ NaOH (כדי להגיע pH פיזיולוגי).
    2. סגור את הצינור ומערבבים על ידי היפוך מספר פעמים עד לקבלת תערובת הוא הומוגני לחלוטין. למנוע היווצרות בועה.
      חשוב: שמור את התערובת על הקרח כדי למנוע gelification.
      1. צעד קריטי: אם התערובת מפתחת הופעה חומצי (צבע צהבהב), להוסיף כמה טיפות של 1 סטרילי N NaOH לנטרל את התערובת.
    3. להוסיף HUVEC ו פיברובלסטים מרוכז בצפיפות של 1.0 - 1.2 ו -1.5 - 2.0 x 10 6 תאים / מ"ל, בהתאמה לתערובת מועשר קולגן (כמתואר לעיל). סגור את צינורות ומערבבים על ידי היפוך מספר פעמים עד לקבלת תערובת הוא הומוגני לחלוטין. למנוע היווצרות בועה. חשוב: שמור את התערובת על הקרח כדי למנוע gelification.
    4. להוסיף 4 - 5 מ"ל של קולגן תא המכילג'ל לכל כנס, שנטען בעבר לתוך צלחת גם 6, ואפשר gelify בשכונה עם תנועה קטנה או לא עבור שעה 1.
    5. אחרי השעה 1, להעביר את צלחת 6-היטב על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 1 - 2 שעות נוספות.
    6. החזר את הצלחת 6-היטב את מכסה המנוע, ועם העזרה של מלקחיים סטרילית אזמל חתוך בסביבה נקיה מחיידקי הקרום מן הכנס ניתוק ג'ל המכיל תאים מן הקרום. חותך את ג'ל המנותקת לריבועים קטנים (~ 5 x 5 מ"מ).
    7. מוסיפים את הריבועים תא המכיל קטן לתוך Harv 50 מ"ל באמצעות יציאת המילוי.
  4. כן השעיה של תאי אפיתל-8 HCT:
    1. פעמיים שטפו את צלוחיות ב PBS ולנתק את התאים באמצעות טריפסין, 0.25% (1x) עם טיפול טריפסין- EDTA. הוסף פתרון טריפסין מספיק כדי לכסות את מכלול שטח הפנים תרבית תאים. ניתוק מתרחש בדרך כלל תוך 10 עד 15 דקות.
    2. איסוף תאים מנותקים 30 מיליליטר של מדיום DMEM-30% FBS.
    3. CentrifUge DMEM-30% בינוניים FBS המכיל צינור ב XG 500 במשך 10 דקות.
    4. Resuspend התאים 30 מ"ל של מדיום FBS% DMEM-30.
    5. לספור את המספר הכולל של תאי קיימא כמתואר 3.2.5.
    6. Resuspend לתאי האפיתל HCT-8 במדיום DMEM-30% FBS בריכוז של 10 מ"ל 7 תאים - 1.
    7. הוסף 1 מ"ל של תאי אפיתל HCT-8 מרוכז לתוך Harv 50 מ"ל באמצעות יציאת המילוי.
  5. באמצעות יציאת המילוי, להוסיף בינוני תרבות 3-D נוספת עד הספינה היא כמעט מלאה (~ 20 מיליליטר).
  6. החזר את מכסה ולנגב את שפתו של הנמל מילוי עם אתנול 70%.
  7. מניחים מזרק בכל נמל מזרק של RWV: מקום 5 מ"ל-מזרק המכיל 3 - בינוני תרבות 4 מ"ל של 3-D בנמל אחד מזרק 5 מ"ל ריק בנמל אחרים.
  8. הסר את כל בועות גלויות על ידי משייך לתוך המזרק הריק בעוד הנפח בינוני בערך באותה המוזרק דרך יציאת מזרק האחרת.
  9. מניחים את vesSels ב bioreactor, להפעיל את הכוח ואת לקבוע את המהירות לכ 13 עד 14 סיבובים לדקה.
    הערה: שלב קריטי: סיבוב שיעור ייתכן שיהיה צורך מותאם כמה פעמים במהלך ניסוי כדי לשמור על התאים המקיפים בתוך הכלי, ובכך הימנעות ממגע עם קירות הכלי.
  10. התרבות תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 במיקרוגרבטיציה, שמספקת bioreactor RWV.
  11. שינוי התרבות בינוני כל 3 - 4 ימים על ידי החלפה כ 30 מיליליטר עם מדיום תרבות 3-D טרי.
  12. לאחר 4 ימים (± 1 יום), להסיר את הכלי מן bioreactor ולהוסיף לימפוציטים / מונוציטים הכלי (2 x 10 7 / כלי).
  13. מניח את הכלי בחזרה bioreactor ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5 ימים נוספים (± 1 יום).
  14. לאחר 5 ימים נוספים (יום 9 של התרבות), להוסיף לימפוציטים / מונוציטים כלי (2 x 10 7 / כלי) ולהמשיך התרבויות עד 12 ימים נוספים.
  15. שינוי התרבות בינוני כל 3 - 4 ימים על ידי החלפה כ 30 מיליליטר עם מדיום תרבות 3-D טרי.

4. קציר 3-D תרבויות עבור היסטולוגיה

  1. בעזרת יבול פיפטה העברת כל שבר ג'ל קטן, הנקרא כיום "לבנות", לתוך צלחת שש היטב המכיל 10 מ"ל של חיץ פורמלין 10%. השאירו למשך 3 שעות ב RT או במשך 12 - 16 שעות ב 4 ° C..
  2. הכן את עיבוד הרקמות וקלטות הטבעה על ידי תיוג והוספת שתי חתיכות של כריות קצף ביופסיה לתוך כל קלטת.
  3. לטבול את הקלטות במאגר פורמלין 10%.
  4. בעזרת מלקחיים למקם את-בונה הקבועה בין שתי כריות הקצף.
  5. לטבול את הקלטות במאגר פורמלין 10%.
  6. המשך עם נהלים קבועים להטבעה, חתך, ומכתימי 44.

תוצאות

יש לנו בעבר מהונדס מודל רב-תאי 3-D organotypic של רירית המעי האנושית המורכבת של שורת תאי אפיתל מעי לימפוציטים אדם מן המעלה ראשון, תאי האנדותל פיברובלסטים בתרבית בתנאים כבידה 24 (איור 1). פיברובלסטים ותאי אנדותל היו מוטבעים קולגן אני מטריקס ...

Discussion

בכתב היד הזה, אנו מתארים את הפיתוח של מודל bioengineered של רירית המעי האנושי מורכב של סוגי תאים בכפולות כולל לימפוציטים אדם מן המעלה הראשונה, פיברובלסטים, ותאי אנדותל, וכן 24 שורות תאים אפיתל במעי. ב 3-D מודל זה, הם תאים בתרבית בתוך תאי מטריקס עשיר קולגן בתנאים כבידה 24....

Disclosures

The authors declare that a US Non-Provisional Patent Application has been filed in the U.S.Patent and Trademark Office (Number: 13/360,539).

Acknowledgements

This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor SyntheconRCCs-4DQFor up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.
Disposable 50 ml-vesselSyntheconD-405Box with 4 vessels
HCT-8 epithelial cells ATCCCCL-244
CCD-18Co Fibroblasts ATCCCRL-1459
Human Umbilical Vein Endothelial CellsATCCCRL-1730HUVEC
Fibroblast Growth Factor-Basic SigmaF0291bFGF
Stem Cell Factor SigmaS7901SCF
Hepatocyte Growth Factor SigmaH1404HGF
Endothelin 3SigmaE9137
LamininSigmaL2020Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Vascular Endothelial Growth Factor SigmaV7259VEGF
Leukemia Inhibitory Factor Santa Cruzsc-4377(LIF
AdenineSigmaA2786
InsulinSigmaI-6634
3,3',5-triiodo-L-thyronine SigmaT-6397T3
Cholera ToxinSigmaC-8052
FibronectinBD354008Isolated from human plasma
apo-TransferrinSigmaT-1147
HeparinSigmaH3149
Heparan sulfate  proteoglycanSigmaH4777Isolated from basement membrane of mouse  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Collagen IVSigmaC5533Isolated from human placenta
Heat-inactivated fetal bovine serum Invitrogen10437-028
D-MEM, powderInvitrogen12800-017
10% formalin–PBS Fisher ScientificSF100-4
Bovine type I collagen InvitrogenA1064401
Trypsin-EDTA Fisher ScientificMT25-052-CI
Sodium pyruvateInvitrogen11360-070
Gentamicin Invitrogen15750-060
Penicillin/streptomincin Invitrogen15140-122
L-GlutamineInvitrogen25030-081
HepesInvitrogen15630-080
Ham's F-12Invitrogen11765-054
Basal Medium EagleInvitrogen21010-046BME
RPMI-1640Invitrogen11875-093
Endothelial Basal MediumLonzaCC-3156EBM-2
Endothelial cell growth supplementMillipore02-102ECGS

References

  1. Aumailley, M., Timpl, R. Attachment of cells to basement membrane collagen type IV. J Cell Biol. 103, 1569-1575 (1986).
  2. Buset, M., Winawer, S., Friedman, E. Defining conditions to promote the attachment of adult human colonic epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 23, 403-412 (1987).
  3. Fitzgerald, T. J., Repesh, L. A., Blanco, D. R., Miller, J. N. Attachment of Treponema pallidum to fibronectin, laminin, collagen IV, and collagen I, and blockage of attachment by immune rabbit IgG. Br J Vener Dis. 60, 357-363 (1984).
  4. Goetschy, J. F., Ulrich, G., Aunis, D., Ciesielski-Treska, J. Fibronectin and collagens modulate the proliferation and morphology of astroglial cells in culture. Int J Dev Neurosci. 5, 63-70 (1987).
  5. Paye, M., Lapiere, C. M. The lack of attachment of transformed embryonic lung epithelial cells to collagen I is corrected by fibronectin and FXIII. J Cell Sci. 86, 95-107 (1986).
  6. Pourreau-Schneider, N., et al. Estrogen response of MCF-7 cells grown on diverse substrates and in suspension culture: promotion of morphological heterogeneity, modulation of progestin receptor induction; cell-substrate interactions on collagen gels. J Steroid Biochem. 21, 763-771 (1984).
  7. Pratt, B. M., Harris, A. S., Morrow, J. S., Madri, J. A. Mechanisms of cytoskeletal regulation. Modulation of aortic endothelial cell spectrin by the extracellular matrix. Am J Pathol. 117, 349-354 (1984).
  8. Jessup, J. M., et al. Microgravity culture reduces apoptosis and increases the differentiation of a human colorectal carcinoma cell line. In vitro cellular & developmental biology - Animal. 36, 367-373 (2000).
  9. Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Res. 46, 5320-5329 (1986).
  10. Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat Med. 4, 901-907 (1998).
  11. Zwezdaryk, K. J., Warner, J. A., Machado, H. L., Morris, C. A., Honerzu Bentrup, K. Rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  12. Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  13. Barrila, J., et al. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 8, 791-801 (2010).
  14. Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes and infection / Institut Pasteur. 8, 1813-1825 (2006).
  15. Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect Immun. 69, 7106-7120 (2001).
  16. Alcantara Warren, C., et al. Detection of epithelial-cell injury, and quantification of infection, in the HCT-8 organoid model of cryptosporidiosis. J Infect Dis. 198, 143-149 (2008).
  17. Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
  18. Lin, H. J., O'Shaughnessy, T. J., Kelly, J., Ma, W. Neural stem cell differentiation in a cell-collagen-bioreactor culture system. Brain Res. Dev Brain Res. 153, 163-173 (2004).
  19. He, L., et al. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Intl Endo J. , (2015).
  20. Straub, T. M., et al. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis. 13, 396-403 (2007).
  21. Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Lack of norovirus replication and histo-blood group antigen expression in 3-dimensional intestinal epithelial cells. Emerg Infect Dis. 19, 431-438 (2013).
  22. Goodwin, T. J., Schroeder, W. F., Wolf, D. A., Moyer, M. P. Rotating-wall vessel coculture of small intestine as a prelude to tissue modeling: aspects of simulated microgravity. Proc Soc Exp Biol Med. 202, 181-192 (1993).
  23. Goodwin, T. J., Jessup, J. M., Wolf, D. A. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 28, 47-60 (1992).
  24. Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Engineering of a multicellular organotypic model of the human intestinal mucosa. Gastroenterology. 141, 18-20 (2011).
  25. Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am J Physiol Renal Physiol. 281, 12-25 (2001).
  26. Cherry, R. S., Papoutsakis, E. T. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors. Biotech and Bioeng. 32, 1001-1014 (1988).
  27. Bergmann, S., Steinert, M. From Single Cells to Engineered and Explanted Tissues: New Perspectives in Bacterial Infection Biology. Int Rev Cell Mol Biol. 319, 1-44 (2015).
  28. Xu, B., et al. Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E. coli ATCC25922. Int J Clin Exp Pathol. 8, 7945-7952 (2015).
  29. Han, C., Jiang, C., Yu, C., Shen, H. Differentiation of transforming growth factor beta1-induced mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under simulated microgravity conditions. Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand, France). 61, 50-55 (2015).
  30. Wang, C., et al. Microgravity activates p38 MAPK-C/EBPbeta pathway to regulate the expression of arginase and inflammatory cytokines in macrophages. Inflamm Res. 64, 303-311 (2015).
  31. Iliev, I. D., et al. Human intestinal epithelial cells promote the differentiation of tolerogenic dendritic cells. Gut. 58, 1481-1489 (2009).
  32. Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria. Science. 277, 949-952 (1997).
  33. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. , (2010).
  34. Lei, N. Y., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support the growth of intestinal epithelial stem cells. PLoS One. 9, e84651 (2014).
  35. Voog, J., Jones, D. L. Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell. 6, 103-115 (2010).
  36. Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue Eng Part C Methods. 19, 961-969 (2013).
  37. Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9, e107814 (2014).
  38. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, 2354-2368 (2014).
  39. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med. 239, 1124-1134 (2014).
  40. Tompkins, W. A., Watrach, A. M., Schmale, J. D., Schultz, R. M., Harris, J. A. Cultural and antigenic properties of newly established cell strains derived from adenocarcinomas of the human colon and rectum. J Natl Cancer Inst. 52, 1101-1110 (1974).
  41. Hinterleitner, T. A., Saada, J. I., Berschneider, H. M., Powell, D. W., Valentich, J. D. IL-1 stimulates intestinal myofibroblast COX gene expression and augments activation of Cl- secretion in T84 cells. Am J Physiol. 271, 1262-1268 (1996).
  42. Hoshi, H., McKeehan, W. L. Brain- and liver cell-derived factors are required for growth of human endothelial cells in serum-free culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 6413-6417 (1984).
  43. Salerno-Goncalves, R., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Characterization of CD8(+) Effector T Cell Responses in Volunteers Immunized with Salmonella enterica. Serovar Typhi Strain Ty21a Typhoid Vaccine. J Immunol. 169, 2196-2203 (2002).
  44. Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. , e51064 (2014).
  45. Eastburn, D. J., Mostov, K. E. Laying the foundation for epithelia: insights into polarized basement membrane deposition. EMBO Rep. 11, 329-330 (2010).
  46. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 33, 261-287 (2005).
  47. Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111, 1021-1046 (2014).
  48. Hartung, T., et al. Good Cell Culture Practice. ECVAM Good Cell Culture Practice Task Force Report 1. Altern Lab Anim. 30, 407-414 (2002).
  49. Blanchet, O., et al. Altered binding of regulatory factors to HLA class I enhancer sequence in human tumor cell lines lacking class I antigen expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 3488-3492 (1992).
  50. Palmisano, G. L., et al. HLA-E surface expression is independent of the availability of HLA class I signal sequence-derived peptides in human tumor cell lines. Hum Immunol. 66, 1-12 (2005).
  51. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
  52. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
  53. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  54. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. , (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Bioengineering1133 DRWV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved