זיהוי של חלבונים קושרי RNA על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; RNA הנפתח ב adipocyte תרבות

Summary

פרוטוקול RNA הנפתח הוא מותאם כאן לגילוי של אינטראקציות בין חלבונים קושרי RNA (RBPs) ו noncoding וכן RNAs קידוד. מקטע RNA מן לקולטן האנדרוגן (AR) שימש כדוגמה כדי להדגים כיצד לאחזר RBP שלה lystate של adipocytes חום ראשוני.

Abstract

חלבוני קושרי RNA (RBPs) הם מתעוררים כשכבה רגולטורית ההתפתחות והתפקוד של שומן. RBPs לשחק תפקיד מפתח בוויסות ביטוי גנים ברמות posttranscriptional ידי המשפיע על יעילות יציבות translational של mRNAs היעד. טכניקה הנפתח RNA כבר בשימוש נרחב כדי לחקור את האינטראקציה RNA חלבון, אשר יש צורך להבהיר את המנגנון שבבסיס RBPs 'וכן RNAs ללא קידוד ארוך "(lncRNAs) פונקציה. עם זאת, שפע השומנים הגבוה ב adipocytes מציב אתגר טכני בביצוע הניסוי הזה. הנה פרוטוקול נפתח RNA מפורט מותאם לתרבות adipocyte העיקרית. מקטע RNA מן של קולטן האנדרוגן (AR) 3 'באזור מתורגמים (3'UTR) המכיל elementwas adenylate-uridylate עשירי כדוגמא כדי להדגים כיצד לאחזר שותף RBP שלה, חלבון חור, מן lystate adipocyte. השיטה המתוארת כאן יכולה להיות מיושמת כדי לזהות את יחסי הגומלין ביןRBPs ו RNAs noncoding, כמו גם בין RBPs ו RNAs קידוד.

Introduction

RBPs הם חלבונים אשר נקלטות על ידי RNA גדילי כפול או יחיד בתאים ולהשתתף ביצירת קומפלקסים-חלבון RNA. RBPs עלול להיקשר מגוון מיני RNA, כולל ה- mRNA ו RNAs noncoding הארוך (lncRNAs) ובין השאר השפיעו ברמות שלאחר התעתיק. RBPs ו lncRNAs שניהם מתעוררים רגולטורי רומן כפי בפיתוח שומן ולתפקד ^1,2,3. כדי להבין את המנגנון של RBP- ורגולציה בתיווך lncRNA של מסלולים הסלולר, זה לעתים קרובות יש צורך לזהות את האינטראקציה בין מולקולת RNA ספציפי אחד או כמה RBPs, ו, לפעמים, לזהות את מלוא הספקטרום של שותפים חלבון של RNA תמליל. עם זאת, הניסוי יכול להיות מאתגר בשל התכולה הגבוהה של שומני adipocytes. פרוטוקול RNA הנפתח המתואר כאן יכול להיות מועסק על מנת לאחזר שותפי החלבון של RNA מסוים מן lysates adipocyte של תרבויות העיקריות ^4,5.

הרציונל פרוטו זהcol מסוכמת כדלקמן. פיתיון RNA הוא במבחנה עבדה מתבנית DNA, ביוטין שכותרתו מצומדות כדי חרוזים מגנטיים צופה streptavidin ^4. הפיתיון RNA הוא מודגרות עם lysates הסלולר כדי לאפשר היווצרות של מתחמי RNA חלבון, אשר לאחר מכן הם משכו מטה על מעמד מגנטי. באופן ספציפי יותר, פרוטוקול הנפתח RNA המתואר להלן להשתמש שבר RNA מן AR 3'UTR כפיתיון כדי לאחזר חלבון חור, RBP כבול הביע אוניברסלי 3'UTR של תעתיקי ^6,7, מ theadipocytelysate של התרבות העיקרי. כדי לבדוק את הספציפיות מחייב של assay זה, שאינו רלוונטי RNAas גם חרוזים streptavidin ריק כלול כמו שליטה. פרוטוקול זה תואם מערבי סופג או ספקטרומטריית מסה (MS) כדי לאשר את לכידתו של RBP ספציפי או לזהות את הרפרטואר המלא של RBPs שנתפס, בהתאמה ^8.

טכניקות קיימות מספר לחקור את האינטראקציה RNA חלבוןים. כדי לחשוף RNAs כבול נתון RBP, RIP (immunoprecipitation RNA) CLIP (crosslinking UV ו immunoprecipitation) יכול להיות מיושם. לעומת זאת, לזהות שותפי חלבון של RNA נתון, נפתח RNA, צרצור (בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA), תרשים (ניתוח כלת לכידתו של מטרות RNA) RAP (טיהור antisense RNA) יכול להיות מיושם. לשם השוואה עם אלה מאוחר יותר, טכניקה נפתחת RNA לוקחת פחות מאמצת להקים. זה יכול להיות מועסק על מנת ללכוד חלבונים במבחנה ובחי. הגישה vivo של RNA הנפתח, אשר מבחינה טכנית יותר מאתגר מאשר עמיתו במבחנה שלה, שומרת אינטראקציות חלבון RNA על ידי crosslinking בתאים, לוכדת RNAs מתויג aptamer עניין מתאי, ולאחר מכן מזהה RBPs כבול. RNA הנפתח ניתן להשתמש כדי להעשיר RBPs בשפע נמוך, וכדי לבודד ולזהות את המתחמים-חלבון RNA שיש תפקידים פונקציונליים מגוונים בשליטת רגולציה הסלולר ^9,10 .

Protocol

הערה: RNA של עניין בהקשר של מחקר זה הוא שבר של AR 3'UTR.

1. הכנת RNA ביוטין שכותרתו

1. כדי להשיג את RNA, להגביר T7-AR-אוליגו על ידי PCR, ואחריו ב שעתוק במבחנה באמצעות ערכה מסחרית ובעקבות הוראות יצרן ^11.
   הערה: צבעי יסוד PCR מפורטים בטבלה 4: T7-AR-F ו- T7-AR-R.
2. לקבלת שליטה מחייב הלא ספציפית, להגביר רצף חלקי של בלוציפראז גחלילית (פל) DNA על ידי PCR מן הפלסמיד psiCHECK-2, ואחריו שעתוק במבחנה.
   הערה: צבעי יסוד PCR מפורטים בטבלה 4: hluc (+) - T7-בדיקה-F ו hluc (+) - בדיקה-R לוח 4 רצפים של תבנית פריימרים עבור הגברת PCR...
3. לקבלת תגובת PCR 50 μl, לערבב 50 ng DNA (אוליגו או פלסמיד), 4 dNTPs μl (2.5 מ"מ של כל dNTP בודדים), 5 μl 10x חיץ התגובה, 1 μl 2.5 U / & #181; l DNA פולימרז, 2 μl 10 מיקרומטר פריימר קדימה, 2 μl 10 מיקרומטר פריימר הפוכה, ו nuclease ללא מים.
   1. הפעל הגברת PCR ב Cycler תרמית באמצעות התכנית הבאה. Step1: מחזור אחד של 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; Step2: 35 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 ° C למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (AR) או 60 שניות (פל); שלב 3: מחזור אחד של 72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
4. לסנתז RNAs biotinylated באמצעות ערכת שעתוק במבחנה הבאה הוראות יצרן ^11. בניסוי זה, להשתמש במוצרי PCR כתבניות סינתזת RNA. עבור התגובה שעתוק 20 μl במבחנה, לערבב 200 DNA ng PCR מוגבר, 2 μl של כל NTP הפרט, 1 μl 10mm ביוטין-CTP, 2 μl חיץ התגובה 10x, ו- RNA פולימראז 2 μl T7. דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
5. בעקבות שעתוק במבחנה, תערובת התגובה פינוק עם 1 μl 2 U / μl DNase ב 37 & #176; צלזיוס למשך 15 דקות כדי לבזות DNA תבנית. לבסוף, לדלל את RNA biotinylated כדי בהיקף כולל של 60 μl עבור הטיהור הבאה.
6. לטהר RNAs biotinylated להסיר מלחים נוקלאוטידים מאוגדים באמצעות עמודות טיהור הבאים הוראות היצרן ^12. מדוד ריכוז חנות RNA ב -80 ° C עבור מבחני הנפתח שלאחר מכן.
7. כדי להבטיח מבנה תיכון נאות עבור RNA של עניין האינטראקציה RNA חלבון, חום 50 μl RNA biotinylated (50 PM) על 90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ומקררים על קרח במשך 2 דקות, ולאחר מכן לספק עם 50 μl חיץ מבנה RNA 2x (לוח 3), ולאפשר עבור RNA מתקפל ב RT למשך 30 דקות ^13,14.

2. הכנת חרוזים RNA מצומדות

הערה: השתמש עמדה מגנטית להפרדה של חרוזים המגנטיים supernatant.

1. Resuspend החרוזים המגנטיים צופה streptavidin בבקבוקון המקורי על ידי vorte הקצרXing הבא הוראות היצרן. העבר 150 μl resuspended חרוזים לצינור 1.5 מ"ל. מניחים את הצינור על המגנט דקות 1. supernatant מחק. שמור גלולת חרוז.
   הערה: מבחני הנפתח RNA, כאשר aliquoting חרוזים resuspended מן הבקבוקון המקורי, השתמש 50 חרוזים μl עבור assay ואחריו המערבי סופג, ו -200 חרוזים μl עבור assay ואחריו MS.
2. לשטוף חרוזים פעם על ידי גלולה חרוז השעיית מחדש עם 1 מ"ל של W & B 1x המומלץ על ידי היצרן (כריכה, כביסה) חיץ (לוח 3), ואחריו סיבוב הצינור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ב הכתף. supernatant מחק. שמור גלולת חרוז.
3. כדי להשבית RNase על חרוזים, לשטוף חרוזים פעמים, בכל פעם מחדש על ידי השעיית גלולה חרוז עם 400 μl חיץ א הצפה הוא פתרון אלקליין המכיל 0.1 M NaOH ו 0.05 M NaCl (לוח 3). סובב את הצינור במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ב הכתף. supernatant מחק. שמור גלולת חרוז.
4. כדי להסיר NaOH אמנות עשויים חרוזים, לשטוף חרוזים פעמיים, בכל פעם על ידי גלולה חרוז השעיית מחדש עם 400 B חיץ μl (לוח 3), ואחריו סיבוב הצינור במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ב הכתף. supernatant מחק. שמור גלולת חרוז.
5. גלולה חרוז גלולה עם 300 μl 2x W & B חיץ, חרוזים להתחלק שווה בשווה ולהעביר לשלושה צינורות 1.5 מ"ל (100 חרוזים μl לכל צינור). לספק את צינורות המכילים חרוז עם 100 μl מים חינם RNase, 100 μl biotinylated RNA FL ו 100 μl biotinylated AR 3'UTR RNA, בהתאמה.
6. דגירה כל תערובת חרוזה עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר עם סיבוב. מניחים צינורות על מגנט דקות 1. מחק את כל supernatant. שמור כדורי חרוז.
7. פעמיים לשטוף חרוזים, בכל פעם מחדש על ידי השעיית כל גלולה חרוז עם 400 μl 1x W & B חיץ, ואחריו סיבוב צינורות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר הכתף.
8. מניחים צינורות על מגנט דקות 1. מחק את כל supernatant. Resuspend כל Pelle חרוזt עם 50 חיץ בידוד גרעיני μl (לוח 3).

3. בידוד Preadipocyte ו Adipogenesis אינדוקציה

1. כפי שתואר בפרסומים קודמים ^5, לנתח preadipocytes מפנקס שומן חום interscapular (עכברי סוג בר C57BL6, 3 שבועות).
2. לגדול במבחנה להבדיל בין preadipocytes ^5. התאים מוכנים יישום במורד הזרם 4-5 ימים לאחר תחילת בידול.

4. הכנה הסלולרית Lysate מ adipocytes הראשי

הערה: ודא כי כל הנהלים של הכנת lysate התא נעשית על קרח, וכל המאגרים קפואים על קרח. homogenizers זכוכית dounce טרום צמרמורת על הקרח.

1. לגדול ולבדל preadipocytes ב 15 מנות ס"מ ⁵ (ראה סעיף 3.2). כל מנה מספקת תאי נאות עבור assay הנפתח RNA אחד. ביום 4 או 5 ימים של בידול, תרבית תאים בינוניים שנזרקו, ולשטוף ceLLS פעם עם 1x PBS.
2. כדי לקצור תאים, להוסיף 10-15 מ"ל 1x PBS לתאים, לגרד לאסוף תאים צינור 50 מ"ל, ותאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ב RT. בטל supernatant באמצעות פיפטה 1 מ"ל.
3. גלולה תא גלול ב 2 מיליליטר חיץ hypotonic (לוח 3), ו דגירת תאים על קרח במשך 15 דקות. העברת התאים homogenizer זכוכית 15 מ"ל dounce, ותאי גזירה מכנית על קרח עם 20 משיכות.
4. גלולה גרעיני תאים על ידי צנטריפוגה ב 3,300 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C. שמור גלולה גרעינים על קרח לשימוש נוסף (ראה סעיף 4.6). העברת supernatant צינורות 1.5 מ"ל, להוסיף 3M KCl כדי supernatant כדי לקבל ריכוז סופי של 150 מ"מ, ו ספין על 20,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C..
5. בעקבות צנטריפוגה, להסיר בזהירות lipidlayeron לפסגה באמצעות 1 מ"ל פיפטה, ולאסוף supernatant כמו lysate הסלולר cytoplasmic.
6. Resuspend גלולה גרעינים (ראה סעיף 4.4) ב 1 מ"ל חיץ בידוד גרעיני. Tגרעיני ransfer על homogenizer זכוכית 15 מיליליטר dounce באמצעות פיפטה 1 מיליליטר, גרעיני גזירה על קרח מכאני עם 100 חבטות. גלולת פסולת גרעינית על ידי צנטריפוגה ב 20,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C, ולאסוף supernatant כמו lysate הסלולר הגרעיני.
7. כך או לשלב את lysates הסלולרי הגרעיני cytoplasmic, או להשתמש בכל חלק בנפרד, עבור יישום הנפתח במורד זרם. בניסוי בהדגמה זו, שברים אלה שני של lysate התא אוחדו ביחס נפח של 1: 1.
8. הוסף מעכב RNase כדי lysate התא unfractionated זה כדי לקבל ריכוז סופי של 0.5 U / μl. מניחים בצד 100 μl של lysate התא כשליטה קלט במשך ¹⁵ המערבי סופג.

5. עקידת Elution של RBP

1. lysate תא פיצול לשלוש aliquots שווה (lysate תא 1ml בצינור 1.5 מ"ל), ו דגירה עם ריק, FL RNA מצומדות ו AR 3'UTR RNA מצומדות חרוזים (ראה סעיף 2.8), בהתאמה, עבור 3 שעות ב 4 ° Cעם רוטציה.
2. מניחים צינורות על מגנט דקות 1. איסוף supernatant בעזרת פיפטה 1 מ"ל, ואחריו בידוד RNA מן supernatant כדי לאשר integrality RNA. לבודד RNA באמצעות פתרון thiocyanate-פנול guanidinium החומצה הבא הוראות היצרן (טבלה 2). להעריך את תקינות RNA באמצעות ניתוח יחידות משנת 28S ו 18S של רנ"א ריבוזומלי. שמור כדורי חרוז על הקרח.
3. שטפו את החרוזים מגנטי שש פעמים, בכל פעם על ידי resuspending כל גלולה חרוז עם חיץ בידוד גרעיני 1 מ"ל המכיל 40 U RNase מעכב ו -0.25% IGEPAL, ואחריו סיבוב צינורות למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר הכתף. השתמש לעמוד מגנטי להפרדה של חרוזים מגנטיים supernatant. מחק את כל supernatant. שמור כדורי חרוז על הקרח.
4. השתמש בשלבים הבאים כדי elute מתחמי RNA חלבון מן חרוזים עבור המערבי סופג. ראשית, resuspend כל גלולה חרוז 75 חיץ בידוד גרעיני μl; אז, להוסיף 25 buf טעינת כתם המערבי 4x μlfer (המכיל SDS) כדי להשיג בנפח כולל של 100 μl. לבסוף, להרתיח חרוזים בתמיסה 100 μl זה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   הערה: השתמשו ביצוע שלבים כדי elute מתחמי RNA חלבון מן החרוזים עבור MS. Step1: resuspend כל גלולה חרוז 100 חיץ elution μl (טבלה 3); Step2: דגירת דגימות חרוזות במשך 2-3 שעות בטמפרטורת חדר עם סיבוב; שלב 3: צנטריפוגה ולאסוף supernatant חלבון המכיל; Step4: להתרכז פתרונות חלבון 20-30 μl לפני ההגשה עבור MS.
5. צנטריפוגה כל 100 μl של מדגם חרוז ב XG 12,000 למשך 30 שניות ב 4 ° C, ולאסוף supernatant. Aliquot 15 supernatant μl לניתוח כתם המערבי (ראה סעיף 6.1 ו -6.2). לחקור את הקרום המתקבל עם נוגדן חד שבטי בדילול חור העכבר (1: 1,000 דילול), לילה.

6. המערבי סופג עבור אימות של RBP

1. RBPs נפרדת על ידי SDS-PAGE באמצעות טכניקות סטנדרטיות.
2. לנהל לנוסופג שטרן באמצעות טכניקות סטנדרטיות על ידי חיטוט עבור RBPs הקשורים RNA של עניין.
   הערה: בניסוי בהדגמה זו, חד שבטי עכבר חור נוגדן שמש את immunodetection של חלבון חור.
3. דגירת הממברנה המתקבלים עם נוגדן החור המדולל (1: 1,000 דילול) ב 5% w / חלב יבש נ שומן, 1x TBS, 0.1% Tween - 20 ב 4 ° C עם רעד עדין, לילה. לשטוף שלוש פעמים הממברנה עם 1x TBST. דגירה הממברנה עם נוגדן המשני (עז נגד העכבר IgG-HRP) בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. הממברנה לשטוף. לפתח אות שיא.

תוצאות

בניסוי בהדגמה זו, מקטע AR RNA שימש כפיתיון כדי ללכוד חלבון מחייב שלה חור. שניהם הפיתיון RNA FL כי הוא בלתי רלוונטי חלבון חור ואת aliquot של חרוזים streptavidin ריק unconjugated שימש בקרות שליליות. אינטראקציות RNA חלבון יכולות להתרחש גם בגרעין או בציטופלסמה, ופרוטוקול נפתח...

Discussion

יש lncRNAs ו RBPs תפקידים חיוניים בבריאות ובחולי, אולם המנגנונים המולקולריים של מולקולות אלה הם הבינו היטב. זיהוי של חלבוני אינטראקציה עם מולקולות lncRNA הוא צעד מפתח לקראת הבהרת מנגנוני הוויסות. העשרת RBPs ידי מערכת assay הנפתח RNA מבוססת על ב-פתרון לכיד של אינטראקציה מורכבת כך חל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Major materials used in this study.
MEGAscript kit	Ambion
Biotin-14-CTP	Invitrogen
NucAway spin columns	Ambion
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen
HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)	Santa Cruz Biotechnology
Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)	Santa Cruz Biotechnology
Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)	HyClone
Phosphate Buffer Saline (1×PBS)	HyClone
RNase inhibitor	Bioline
Protease inhibitor	Sigma
Pfu Turbo DNA polymerase	Agilent Technologies
TRIsure	Bioline
Name	Company	Catalog Number	Comments
Major equipment used in this study.
Sorvall Legend Micro 21R centrifuge	Thermo Scientific
Sorvall Legend X1R centrifuge	Thermo Scientific
Bio-Rad T100 thermal cycler	Bio-Rad
Nanodrop 2000	Thermo Scientific
BOECO rotator Multi Bio RS-24	BOECO,Germany
Protein gel electrophoresis and blotting apparatus	Bio-Rad
DynaMag-2 magnet	Life Technologies