שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital (IVFM) עם דגמים גנטיים בחקר דינמיקה Engraftment Hematopoietic תאים במח העצם נישות

Summary

מיקרוסקופ זריחה intravital (IVFM) של החילונית מוחל בשילוב עם דגמים גנטיים בעלי חיים כדי ללמוד את יונת ואת engraftment של תאים hematopoietic גומחות מח עצם (מוניטור).

Abstract

הוכחה גוברת מציין שאת hematopoiesis נורמלי מוסדר על ידי רמזים microenvironmental נפרדות ב ויטביע, הכוללים נישות הסלולר מיוחדים להתכוונן קריטי לתאי גזע hematopoietic (HSC) פונקציות^1,2. אכן, תמונה מפורטת יותר של microenvironment hematopoietic זה עכשיו מתעוררים, בו את endosteal, גומחות אנדותל ליצור יחידות פונקציונליות לוויסות האנרגיות HSC רגיל ו שלהם רומא^3,4,5 . מחקרים חדשים גילו את החשיבות של תאים perivascular, adipocytes, תאים עצביים תוך שמירה על וויסות HSC פונקציה^6,7,8. יתר על כן, יש עדויות לכך תאים שושלות שונות, כלומר התאים מיאלואידית, הלימפה, הבית, שוכנים בתוך נישות ספציפיות בתוך microenvironment מוניטור. עם זאת, מיפוי מלאה של microenvironment את מוניטור ואת דייריו נמצאת בעיצומה.

העכבר הטרנסגניים זנים שושלת היוחסין סמני פלורסנט ספציפי או עכברים מהונדסים חוסר שנבחר מולקולות תאים מסוימים של הגומחה מוניטור זמינים כעת. הנוק-אאוט, שושלת היוחסין מעקב מודלים, בשילוב עם גישות השתלת, מספקים הזדמנות לחדד את הידע על תפקיד ספציפי "נישה" תאים עבור אוכלוסיות hematopoietic מוגדרים, כגון מועדון הכדורגל מונפלייה, תאי-B, T-תאים, התאים מיאלואידית ו תאים erythroid. אסטרטגיה זו יכול להיות potentiated עוד יותר על-ידי מיזוג השימוש של מיקרוסקופ שני הפוטונים של החילונית. על ידי מתן ויוו הדמיה ברזולוציה גבוהה עיבוד תלת-ממדי של החילונית מוניטור, אנו יכולים עכשיו לקבוע במדויק את המיקום שבו הנדונים hematopoietic בבית ויטביע ולהעריך את קינטיקה של התרחבותן לאורך זמן. כאן, ליס-GFP העכברים הטרנסגניים (סימון התאים מיאלואידית)⁹ ו RBPJ עכברים הנוק-אאוט (שחסר איתות חריץ קנונית)¹⁰ משמשים בשילוב עם IVFM כדי לקבוע את engraftment של התאים מיאלואידית microenvironment מוניטור פגומה חריץ.

Introduction

מיקרוסקופ זריחה multiphoton intravital (IVFM) היא טכניקת הדמיה עוצמה המאפשרת ברזולוציה גבוהה, בזמן אמת הדמיה של רקמות עם עומק עד 1 מ מ, בהתאם הרקמה. כאשר חל החילונית העכבר, הוא מאפשר לצפות בהתנהגות של התאים hematopoietic בתוך ויטביע בצורה לא פולשנית עד ל- 60-100 μm¹¹. גישה זו משמשת כאן כדי לקבוע את קינטיקה של engraftment של אבות מיאלואידית נורמלי בעכברים מעלף מוניטור של RBPJ חסר איתות חריץ הקנוני.

העבודה האחרונה של הקבוצה שלנו הפגינו הזה פגום הקנוני חריץ איתות ב ללידים microenvironment מוניטור המחלה כמו myeloproliferative¹². אובדן של חריץ איתות הושג על-ידי מחיקת מותנה המחשבים איגוד ה-DNA של RBPJ, גורם שעתוק קריטי במורד הזרם של חריץ הקנוני איתות, באמצעות Mx1-Cre המושרה רקומבינציה¹⁰. במחקר זה, שימש המודל עכברים^{לקס/סלומון} Mx1-Cre/RBPJ. מותנה מחיקה של מוטיב מחייב DNA RBPJ גורמת לאובדן של איתות של כל חריץ קולטנים. במודל Mx1-Cre, Cre הביטוי הוא מונע על ידי האמרגן Mx1 מופעל על מינהל polyI:C וכתוצאה מכך תנאי הגיוס של מחיקה ג'ין יישוב בתאי הדם, כמו גם כמו רכיבים סטרומה באיברים רבים, כולל מוניטור, הטחול והכבד.

Mx1-Cre⁺/RBPJ^{סלומון/סלומון} ועכברים^{לקס/סלומון} Mx1-Cre^–/RBPJ המושרה עם polyI:C (לכאן בזמן שנסעתי מסומן כמו RBPJKO ו- RBPJWT, בהתאמה) היו אולם מוקרן, מושתלים עם נורמלי, פראי סוג תאים hematopoietic. החל מן השבוע 4 לאחר ההשתלה, הנמענים RBPJKO פיתח הסטה משמעותית ואחריו טחול מוגדל. למרות RBPJKO עכברים המוצגים אחוז מוגברת של אבות מיאלואידית ויטביע בשבוע 8 לאחר ההשתלה, בנקודות זמן מאוחר יותר, ניתוח של מוניטור שבועות 4 ו- 6 לא חשפו הבדלים מרשים בתוכן התאים מיאלואידית שלהם לעומת שליטה RBPJWT הנמענים. התבוננות זו, יחד עם העובדה כי Mx1-Cre מתבטא באיברים שונים hematopoietic, העלה את השאלה אם microenvironment מוניטור הייתה השפעה ישירה על אתחול של פנוטיפ myeloproliferative.

כדי לקבוע אם ויטביע היה אתר הראשוני הקריטי להתפתחות המחלה, שימשה IVFM של החילונית העכבר בשילוב עם השתלת (BMT), המודל הנוק-אאוט RBPJ ו שושלת מערכת מעקב מוניטור. העכברים הטרנסגניים לבטא EGFP תחת השליטה של יזם (Lys-GFP) ליזוזים ספציפי⁹ שימשו כדי להשיג תאי התורם יכול, ניתן לאבחן בזמן מוניטור הדמיה לאחר BMT. ליזוזים הביטוי הוא ספציפי התאים מיאלואידית וסימון Lys-GFP לתאים מ המייצר מיאלואידית נפוצות (CMP) בוגרת גרנולוציט¹³.

IVFM של ויטביע בנקודות זמן שונות הראו כי תאים Lys-GFP שני חיבורים באופן דומה לנמענים מוניטור של RBPJWT ו- RBPJKO, אבל מורחבת, engrafted מהר יותר ב הנמענים מוניטור של RBPJKO. הבדל זה היה דרמטי בנקודת זמן קודמת (לשבוע שבין 2) וירידה לאורך זמן (שבועות 4 ו- 6). עם זאת, בנקודות זמן מאוחר יותר אלה, של תא hematopoietic לאותו הנמען הראה על עלייה מתמדת במספר התאים מיאלואידית במחזור PB והערכת מותאם הטחול של עכברים RBPJKO, המציין את פלט מוגברת של תאים מ ויטביע למחזור. ניתוח של ליס-GFP תאים לוקליזציה ב ויטביע של המושתלים עכברים בגיל 6 שבועות גילה כי התאים מיאלואידית היו המתגוררים רחוק יותר להערכת microenvironment RBPJKO מאשר בפקד.

באופן קולקטיבי, השילוב של IVFM עם מודלים בבעלי חיים ספציפיים אלה מספק תובנות על הדינמיקה engraftment של התאים מיאלואידית microenvironment RBPJKO מוניטור. עיצוב ניסיוני ואת בשיטה כמותית המתוארים כאן מוצע כמו פרדיגמה שניתן להחיל כדי לטפל שאלות דומות. לדוגמה, השימוש של השושלת ספציפיים אחרים תא מעקב מודלים, כגון RAG1-GFP¹⁴ או¹⁵ Gata1-GFP עכברים, עשוי לאפשר בעקבות התנהלות הלימפה או אבות erythroid, בהתאמה, בתוך ויטביע.

Protocol

כל הפרוצדורות הכרוכות של חיות בוצעו עם ההרשאות של טיפול בעלי חיים, להשתמש הוועדה של אינדיאנה הספר לרפואה של אוניברסיטת. ודא לדבוק החקיקה על ניסויים בבעלי חיים של המדינה שבו מתבצעת העבודה.

1. הכנת עכברים הנמען^{- / -} Mx1CreRBPJ

1. לחצות Mx1-Cre⁺ עכברים עם RBPJ^{לקס/סלומון} עכברים¹⁰ להשיג Mx1-Cre ^RBPJ-^{סלומון/סלומון} -עכברים-¹² וחיובי Mx1-Cre שלילי RBPJ^{סלומון/סלומון} הארנבונים מאותה להשתמש כפקדים. ודא את גנוטיפ ב- PCR¹⁰.
2. להשתמש בשבוע 6-8-Mx1Cre בת⁺/RBPJ^{סלומון/סלומון} עם Mx1Cre^–/RBPJ^{סלומון/סלומון} עכברים כדי לבצע את תנאי הגיוס polyI:C.
3. מזריקים polyI:C µg 200 i.p. Cre⁺ , יצורים^– עכברים. לתת זריקה polyI:C אחת בכל יום אחר במשך 3 ימים בשבוע הראשון. לתת זריקה polyI:C אחת בשבוע השני, 7 ימים אחרי הזריקה הקודמת (ארבע זריקות סה כ).
   1. השתמש RBPJKO (המושרה Mx1Cre⁺/RBPJ^{סלומון/סלומון}) ו RBPJWT (המושרה Mx1Cre^–/RBPJ^{סלומון/סלומון}) עכברים כ נמענים 3 שבועות אחרי הזריקה האחרונה polyI:C.
      הערה: מומלץ להשתמש עכברים שנגזרות pI: pC 3 שבועות לאחר ההזרקה. התגובה IFNα מופעלת על ידי polyI:C גורם שינויים משמעותיים ויטביע, והתוצאה היא הרחבת immunophenotypic HSC וירידה הפלט של אבות בוגרת לתוך ה^16,דם היקפיים¹⁷. ייצוג של ערכות המשנה hematopoietic הוא מנורמל 3 שבועות לאחר ההזרקה, העכברים יכול להיות מנוצל ללא תופעות מבלבלים של דלקת. פרוטוקול זה אינדוקציה מוטבה עבור RBPJ. אם מוחק גנים שונים, פרוטוקול אינדוקציה עשויים להשתנות בהתאם הבונה, מחיקה יש לאמת. אנחנו לאמת ~ 100% מחיקה של האזור RBPJ בין אתרי loxP מאת RT-PCR לאחר סך של ארבע זריקות polyI:C.

2. הכנה של תאים במח העצם של התורם Lys-EGFP השתלת

1. המתת חסד עכבר Lys-EGFP אחד (פחמן דו חמצני ואחריו נקע בצוואר הרחם) 1 או 2 h לפני ההשתלה.
2. תרסיס על פני הגוף החי עם 70% אתנול.
3. השתמש מספריים כירורגיים עושים חתך בעור על שתי הרגליים מסביב לקרסול, עם מלקחיים כירורגיים למשוך החוצה העור והפרווה יחד כדי לחשוף רקמת שריר נקי.
4. השתמש מספריים כירורגיים כדי להסיר כמה שיותר שרירים ברגליים ככל האפשר. בעזרת מספריים, לחתוך את העצמות (ב הברך והקרסול משותפת) ולנקות את כל רקמת השריר הנותר מן עצמות הירך tibias בעזרת גזה ספוגים. מניחים את העצמות (שתי עצמות הירך ו- tibias שני) לתוך צלחת 6-ובכן המכיל DMEM 10% FBS.
5. לרסק עצמות מרגמה עם PBS EDTA קר 2 מ מ 10 מ"ל, pipet תאי מח העצם כדי להביא את התאים לתוך תא בודד ההשעיה. לחלופין, לרוקן את העצמות עם 2 מ מ EDTA PBS 3 פעמים מכל צד עם מזרק 1 מ"ל.
6. לסנן את התאים במח העצם באמצעות מסנן 70-מיקרומטר לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. מסנן שטיפה עם 2-3 מ"ל של PBS. ספין של התאים למטה 10 דקות ב 460 x g, resuspend התאים 10 מ"ל של טרי DMEM 10% FBS.
7. לספור תאים במח העצם על hemocytometer ולהתאים את הריכוז של 1.5 x 10⁷ תאים למ"ל בשנת IMDM ללא סרום. השתמש 3 x 10⁶ תאים לכל חיה עם נפח של 200 µL. כ 1/3 תאים של מוניטור סה כ הם תאים מיאלואידים GFP + תאים. להשאיר את התאים על הקרח עד מוכן להזרקה. השתמש 0.5 x 10⁵ תאים כדי לקבוע GFP הביטוי על-ידי FACS⁹.

3. השתלת מח עצם ליס-GFP תאים לתוך RBPJKO עכברים

1. לרסן את הנמען עכברים בכלוב פאי. להאיר עכברים עם מנה קטלנית של קרינת גמא (1,200 ראד) על בעוצמה Cs 137. להשתמש בפרוטוקול מנה מפוצלת: 900 rads בשעות הערב ואחריו 300 rads למחרת בבוקר (16 שעות אחד מהשני).
2. השתלת העכברים הנמען RBPJWT ו- RBPJKO אולם לקרינה h 5-6 לאחר המנה השנייה של קרינה. להזריק מוניטור תאים שנקטפו Lys-EGFP עכברים-ריכוז של 3 x 10⁶ תאים לכל בעלי חיים דרך הזנב וריד זריקה (ראה פירוט עבור קציר תאים בסעיף 2).
3. תמונה גדודים עצמאיים של עכברים המושתלים מאת IVFM בנקודות זמן שונות: 24 h, ולאחר שבועות 2, 4 ו-6, כמפורט להלן (ראה סעיף 4 & 5 עבור ויוו הדמיה ההליך).

4. ניתוח לקראת הדמיה Intravital

1. לחטא כלי ניתוח. שניים בסדר מלקחיים (אחד ישר, אחד בזווית), זוג מספריים בסדר גמור וזוג אחד של מחט. להכין אזור פעיל עם כל ציוד הדרוש עבור ההליך.
2. לתת זריקת הרדמה קטמין קוקטייל IP בעכבר (חריגות השירותים הווטרינריים 2.5-5 מ"ג/ק"ג + איזופרומאזין 1.0-2.5 מ"ג/ק"ג + קטמין 90-100 מ"ג/ק"ג) בעזרת מזרק המחט 26-28 גרם.  חיה יהיה פיקוח כל 15 דקות במהלך ההליך, הרדמה ניתן להשלים לפי הצורך-¼ של המנה המקורית.
3. הנח את העכבר על מקור חום תקין (כרית החימום של 37 ° C, חיה מוגן מפני מגע ישיר עם חימום pad) ולפקח באופן חזותי את קצב הנשימה.
4. בדוק רפלקסים באמצעות הבוהן לצבוט התגובה. ודא כי החיה לגמרי תחת הרדמה לפני תחילת כל הניתוחים.
5. שימוש 26-28. קוטר מחט מזרק לתת עכברים זריקה וריד הזנב של סמן וסקולרית פלורסנט (לתוספי, 100 μL של פתרון 20 מ"ג/מ"ל)
6. הוטרינר העין משחה חלות על שתי העיניים. קליפ המשטח הגבי של ראשה עם קוצץ חשמלי קטן. להחיל על הסרת שיער קרם 5 דק להשתמש גזה ספוגים להסיר את השמנת ולאחר מכן לשטוף עם מי מלח. תכינו את הקרקפת נקי עם אלכוהול 70% באמצעות מקלון צמר גפן.
7. להשתמש מלקחיים בסדר, מספריים לעשות חתך בעור קו האמצע קטנים (10-20 מ מ) על הקרקפת לחשוף את המשטח הגבי הגולגולת המשמש כבסיס. השתמש משי כירורגי 5-0 כדי למקם את התפרים שני בעור בכל צד של החתך, יצירת דש לחשוף את קליפת הגולגולת עבור הדמיה.
8. הצב והעכברים על גבם ויציפו את הקרקפת חשוף בקערת זכוכית תחתון מלא בשמן מיקרוסקופ. תחבורה החיה mutiphoton הדמיה חדר.
9. מניחים את החיה על הבמה מיקרוסקופ החילונית על המנה זכוכית מעל המטרה, ואז יכסה עם 37° C כרית החימום (חיה חייבת להיות מוגנת ממגע ישיר עם חום).

5-in Vivo הדמיה ברזולוציה גבוהה של החילונית העכבר

1. השתמש מערכת קונאפוקלית הפוכה שונה עבור הדמיה multiphoton (ראה חומרים טבלה). הוראות היצרן הבא לכוון לייזר הפוטונים 2 כדי 830 nm, מקום 20 X W, נה 0.95 המטרה עדשה מיקרוסקופ האף חתיכה. ואבדוק יישור קרן לייזר.
   הערה: מערכות מיקרוסקופ זקוף הנפוץ ביותר על מחקרים אלו, אך גם יכול להיות מנוצל מערכת multiphoton הפוך. במחקר זה, שימש מכשיר stereotaxic atraumatic מעוצב מותאם אישית. למרות שיש מספר התקנים זמינים מסחרית stereotaxic למערכות מיקרוסקופ זקוף, יש אין התקן stereotaxic זמינים מסחרית עבור מערכת הפוך המיקרוסקופ מכוון אבטחת הגולגולת העכבר. כחלופה למכשיר stereotaxic מותאם אישית, ניתן לאבטח את הגולגולת בעמדה מעל המטרה ניצול שיטות שונות קלטת או דבק ליציבות.
2. לפתוח תוכנה רכישת התמונה. בהגדרות של"רכישת" לוח בדוק אם אחת מצב סריקה כיוונית נבחרה. להגדיר את מהירות סריקה כדי 4 μs לפיקסל, קצב הפריימים כדי 512 x 512 פיקסלים, זום 1.5. בחר 20 X W נה 0.95 המטרה מהרשימה של עדשות המטרה זמין כדי להתאים את העדשה בכיוון של nosepiece.
3. גישה "רשימת לצבוע" מלוח "התמונה רכישה הבקרה" ובחר "שני הפוטונים". פתח את החלון "אור נתיב & צובעת" ובחר DM690-980 עירור DM. פתח הצמצם לייזר P 2 על-ידי סימון תיבת הסימון ביחידת הלייזר 2. בחלון "מיקרוסקופ בקר", בחר RDM690 מראה.
4. בחר "EPI המנורה", בחר B/G epi-מסנן קוביה ולהתמקד המטרה על גבי הדגימה כדי להמחיש את זרימת הדם ואת הגומחה מח עצם קליפת הגולגולת, באמצעות התייחסות ההסתעפות של הווריד המרכזי של (א), את התפר כלילית (b) (איור 2 א).
5. איסוף תמונות באמצעות מצב שאינו descanned. בחר 3 גלאים חיצוניים: detector1 PMT כדי לאסוף את האות SHG של קולגן (מסנן פליטה - 430/100 ננומטר), חאספ detector2 לאות GFP לאסוף (מסנן פליטה - 525/50) ו חאספ detector3 כדי לאסוף את האות של TRITC-לתוספי (מסנן פליטה - 605/90 ננומטר).
   1. לבצע הדמיה בקצב הסריקה של 4μs/פיקסל עם אין בממוצע כדי למזער את phototoxicity. איסוף תמונות בלייזר קבוע כוח, גלאי רווח התרגלו לנצל את מלוא הטווח הדינמי של הגלאי עם רוויה מינימלי.
   2. לאסוף שורה של סעיפים דרך העומק של רקמות (60 x 1 μm Z-במחסן) 6 מחוזות מח עצם קליפת הגולגולת. השתמש בהגדרות גודל צעד של 1 μm, זום 1.5 ואת גודל המסגרת 512 x 512 פיקסלים (מיקרומטר מיקרומטר x 423 423).
      הערה: באופן כללי הזמן הכולל הנדרש כדי התמונה עכבר אחד היא h 1-1.5.

6. ניתוח כמותי

1. לבצע את התמונה כימות ותלת מימד שחזורים באמצעות תמונות תלת-ממד/4 יח ייעודי כימות והדמיה תוכנה לפי הוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). דמיינו באופן אינטראקטיבי Z-במחסן תלת-ממד ניצול הקרנה בעוצמה מקסימלית (MIP), מיזוג אלפא או צל הקרנה אחסון עיבוד אלגוריתמים.
2. קטע GFP תאים באמצעות "מודול פילוח אובייקט ספוט". החל האוסף אריתמטית עיבוד (ערוץ חיסור) לחסל את ספירת חיובי כוזב GFP תאים (זו מבטלת את האות של תאי עצם הצגת פלורסצנטיות חזקה בערוצים ירוק ואדום).
3. לבצע פילוח משטח להערכת ועצם באמצעות המודול פילוח של פני השטח. אם נדרש, לחשב מרחקים של תאים לכל אחת המשטחים לעיל על-ידי החלת אלגוריתמים X-מתח שנקרא "מרחק של ספוט אל פני השטח".

תוצאות

גדודים של 2 RBPJKO, 2 RBPJWT נמענים היו עם תמונה בהפעלה הדמיה בודדים בנקודות זמן שונות: 24 שעות ביממה ו- 2, 4 ו- 6 שבועות לאחר ההשתלה של תאים מוניטור Lys-GFP (זרימת עבודה מודגם ב איור 1A).

כל עכבר, נרכשו תמונות מאזורים תקן 6 החילונית מוניטור, המזוהה ?...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר בעל עיצוב ניסיוני אופטימיזציה ללמוד את קינטיקה של תאים hematopoietic engraftment על ידי מיקרוסקופ נמכרות Intravital. במחקר זה, הרחבת ובתאים מיאלואידית ונדירה של מוניטור WT או בכל חריץ איתות מוניטור פגום היה מסומנים בהחילונית עצם על ידי הבאים Lys-GFP התאים מיאלואידית חיובי לאחר BMT אל נמענים RBPJW...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine cocktail	IU School of Medicine		Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg
TRITC dextran	Tdb Consultancy	TD150-100mg	Other color dextran may be used.
Andis hair trimmer	Braintree Scientific	CLP-323 75
Gauze sponge	Med Vet International	PK224	4-ply, 2 x 2
Nair depilatory cream	Commercial store
Saline	Med Vet International	RXSAL-POD1LT	0.9% Sodium Chloride poly bottle
Insulin syringe	Fisher Scientific	14-826-79	28 g, 1/2 cc
Fine Forceps	Fine Science Tools	00108-11, 00109-11	straight forcep, angled forcep
Scissor	Fine Science Tools	15018-10
Needle holder	Fine Science Tools	12002-14
5-0 silk suture	Fisher Scientific	MV-682	Other non-absorbable suture may be used
WillCo- glass bottom dish	WillCo	GWSt-5040
Optical microscope oil	Leica
Stereotaxic stage insert	IU School of Medicine	Custom design
Olympus FV1000 confocal microscope system	Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective	Olympus
Small heating pad	Commercial store		Zoo Med reptile heating pad
Imaris 8.1 imaging software	Bitplane		3/4 D Image Visualization and Analysis software