במבחנה חלחול של FITC טעון Ferritins מעבר מכשול עכברוש דם-מוח: מודל לחקר משלוח מולקולות Nanoformulated

Summary

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

Abstract

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

Introduction

ההתנגדות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) מחלות (כלומר. סרטן, אפילפסיה, דיכאון, סכיזופרניה והפרעה נוירולוגית הקשורים HIV) לטיפולים תרופתיים נובע מנגנונים שונים, כולל חלחול התרופה מפרך דרך מחסום הדם-מוח (BBB) . של BBB הוא הגבול מבודד רקמות מוח מפני החומרים במחזור הדם. בתוך המחסום הזה, שכבה של תאי אנדותל כלי דם במוח (BMECs), נתמכים על ידי pericytes האסטרוציטים endfeet, אחראית סלקטיביות הגבוהה של BBB לאלו תרופות hydrosoluble עם משקל מולקולרי גבוהה מ -400 Da ^1. עוד מנגנון עמידות הקשורות לסמים קשורים לנוכחות על BMECs של מובילים בזרימת התרופה (P-glycoprotein והתנגדות multidrug חלבונים), אשר שיתוף פעולה כדי לצמצם את חדירת התרופה לתוך מערכת העצבים המרכזית ואת להקל שהחול שלהם מהמוח ^2.

בעשור האחרון, מספר רב של גישות nanotechnological פותח כדי לעמוד באתגר הקליני וביולוגי של אספקת סמים ברחבי BBB ^3-6. בהקשר זה, nanospheres פריטין (FNN) מייצג פתרון חדשני ומבטיח לחלוטין. FNN הם 12 תחומים ננומטר של 24 פריטין הרכבה עצמית (Fn) מונומרים, אשר מסודרים במבנה כדורי חלול של 8 קוטר פנימי ננומטר. יחידות משנת פריטין יכולה להיות מפורקת ב- pH חומצי מחדש באופן צורה-זיכרון על ידי הביא את ה- pH ניטראלי, המאפשר מולקולות אורגניות שונות להיות במארז. לכן, FNN מייצג מודל מעניין לפיתוח ^7,8 למערכות אספקת תרופות רבות תכליתי. יתר על כן, FNN עלול ליצור אינטראקציה עם הודות BMECs אל הכרה ספציפית של transferrin קולטן (TFR) 1, אשר באה לידי ביטוי על הממברנה luminal של תאים אלה ^9.

עד כה, שונה במודלים חוץ גופייה של BBB פותח יורדr להבהיר חדירות טראנס-BBB לסמים שונים, רעיל לכיוון BBB, או האינטראקציה של מולקולות עם מובילים בזרימה. אכן, מודלים אלה נחשבים תקפים במבחנת גישות להקרנה מהירה של מולקולות פעילות לפני שתמשיך עם מחקרי in vivo. מודלים אלה כוללים שכבת האנדותל יחידה של BMECs או BMECs שיתוף תרבותי האסטרוציטים (לעתים רחוקות יותר pericytes), המתקבלת מן החי (חולדה, עכבר, חזיר שור) או שורות תאים אנושיות ^10,11,12. את ההתנגדות החשמלית Transendothelial (TEER) ואת החדירות לכאורה _{(אפליקצית} P) של קליעים נותבים עם משקל מולקולרי מוגדר מייצגי שני פרמטרים קריטיים המשמשים כדי לקבוע את איכות המודל חוץ גופייה. כאן אנו מתארים את העסקת מודל BBB במבחנה, מבוסס על שיתוף התרבות של עכברוש BMECs (RBMECs) וחולדה האסטרוציטים קליפת המוח (RCAs) ללמוד את חלחול טרנס-BBB של nanocages פריטין encapsulating isothi והעמסתocyanate (FITC).

Protocol

1. הקמת מודל BBB

הערה: הקמת מודל BBB אנו ממליצים להשתמש RBMECs העיקרי זמין מסחרי RCAs. כל הצעדים חייבים להתבצע עם ריאגנטים מתכלים סטרילי, טיפל במנדף זרימה למינרית.

1. תרבית תאים
   1. תא מעיל צלוחיות תרבות עם מ"ל פולי- L- ליזין 100 מיקרוגרם / (שעה 1 ב RT) או פיברונקטין 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​(שעה 1 ב 37 ° C) כדי לקדם את הקובץ המצורף של RCAs או RBMECs, בהתאמה. ואז, להפשיר 1 x 10 ⁶ RCAs ו -5 x 10 ⁵ RBMECs ב בינוני תא האנדותל, בתוספת 5% בסרום שור עוברי, 1% תוספת צמיחת תא האנדותל ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (sECM). RCAs זרע בבקבוק T175 ב sECM 20 מ"ל ו RBMECs בבקבוק T75 ב 10 מ"ל sECM.
      הערה: ההפשרה ומעברי זריעה של RCAs ו RBMECs חייבים להיות מותאמים, מבחינת צפיפות תאים וזמן בתרבות, בהתאם למספר של תנאי ניסוי להיבדק עם מודל BBB. הסטארטing עם 1 בקבוקון של 1 x 10 ⁶ RCAs ו 1 בקבוקון של 5 x 10 ⁵ RBMECs, אפשר לקבל עד 20 BBB נושאות מוסיף.
   2. לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באווירה humidified למשך כ- 6 ימים, עד בערך המפגש 80% עבור RCAs ולמעלה מ -90% מפגש עבור RBMECs. ניתוק התאים באמצעות פתרון טריפסין-EDTA (טריפסין 1: 250) במשך 5 דקות (1 מ"ל טריפסין עבור צלוחיות T75 ו -2 מ"ל עבור צלוחיות T175). תפסיק פעילות טריפסין עם sECM (2: 1), השעיות תא צנטריפוגות ב g 750 × 5 דקות ו resuspend את הכדורים ב 60 מיליליטר sECM.
   3. פיצול RBMECs לתוך 3 צלוחיות T175 ותרבות sECM במשך 3 ימים אחרים לפני הזריעה על מוסיף. לספור את המספר הכולל של החיים RCAs, על ידי התבוננות ההשעיה תא מדולל 1: 1 עם trypan כחול תחת מיקרוסקופ אופטי בתא "שודד גופות.
2. זריעת תאים על הוספה
   1. פנקו את צד אחד של terephthalate פוליאתילן (PET) קרום של 6 רב גם transparמוסיף אף אוזן גרון עם L- ליזין פולי 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ואת הצד השני עם מ"ל / מיקרוגרם 50 פיברונקטין, כדי לאפשר התקשרות של RCAs ו BMECs. טפל מחדיר עם פינצטה על מנת להימנע ממגע עם קרום PET.
      1. מניחים את מוסיף לתוך צלחת 6 היטב ולהוסיף פתרון פיברונקטין (מינימום 500 μl) לתוך החדר העליון. אחרי שעה 1 של דגירה על 37 ° C, להסיר את הפתרון פיברונקטין, לקחת מחדיר את צלחת רב היטב ולשים אותם במהופך על החלק התחתון של צלחת 150 ס"מ ² פטרי, אשר משמש כאן כתמיכה סטרילי עבור כבר מצופה מוסיף.
      2. בעדינות להוסיף 800 μl של L- ליזין פולי על הצד התחתון של הכנס (כפי שמוצג באיור 1 א; המכונה זריעת RCAs), ולשמור את פתרון מוסיף עבור שעה 1 ב RT.
      3. לשאוב את הפתרון ולתת המחדיר לייבש ב RT במשך 15-30 דקות. המחדיר מוכן כעת זריעת תאים, אבל יכול גם להיות מאוחסן בצלחת רבה גם עבור מספרימים על 4 מעלות צלזיוס, לפני שתמשיך עם בניית BBB.
         הערה: זכור לשמור לפחות 3 מצופה מוסיף חינם מתאי, כדי לשמש שולט לאמת הקמת BBB על ידי FD40 מדידות שטף.
   2. RCAs Seed (35,000 / ² ס"מ) על הצד התחתון של מוסיף פולי- L- מצופה ליזין, על ידי הטלת 800 μl של ההשעיה התא על במהופך להוסיף (איור 1 א). השאירו את ההשעיה RCA על הכנסות עבור 4 שעות ב RT, על מנת לאפשר התקשרות יעילה של תאים הממברנה.
   3. לשאוב את הפתרון שיורית, למקם מחדיר לתוך בארות המכילות 2 מיליליטר של sECM ולשמור על הצלחת רבה גם על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באווירה humidified, שינוי sECM כל 2 ימים.
   4. לאחר 3 ימים, כאשר RCAs יש מצופה בחלק התחתון של הפנים של הכנס, זרע RBMECs על הצד העליון של הכנס, ביצוע השלבים הבאים:
      1. ניתוק RBMECs צלוחיות T175 ולספור אתתאים חיים הכולל, כפי שדווח צעדים 1.1.2 ו 1.1.3.
      2. RBMECs Seed (60,000 / ² ס"מ) על פני השטח העליונים של הכנס ב sECM (1,000 μl) (איור 1 ב), עוזב 3 מוסיף עם האסטרוציטים בלבד, כדי לשמש כרקע TEER. מניח את הצלחת רבה היטב בתנאי תרבות סטנדרטיים. לשמור על המערכת לתרבות במשך 3 ימים לפחות, שינוי sECM בחדר הפנימי ותחתון כל 2 ימים.

2. אימות BBB

1. מדידת TEER
   1. ביום 3 ^rd של התרבות המשותפת, בדוק את TEER ידי החדרת מחדיר BBB נושא לתוך תא מתאים (שהינה בעלת כובע והיכן הוא קאמרי כובע להכיל זוג-חישת מתח ואלקטרודות נוכחי), מלא 4 מ"ל של sECM. חבר מד התנגדות / וולט רקמת האפיתל.
   2. יחד עם מדידות TEER של BBB-מערכות תא, להקליט הערכים TEER של 3 מוסיף הנושאת את RCAs הב ינוכה הערכים שהתקבלו עם BBBS. הכפל את הערכים TEER שהתקבל על ידי פני השטח של הכנס (4.2 ס"מ ²⁾ על מנת להביע את התוצאות כפי x Ω ² ס"מ.
   3. מהיום 3 ^rd של תרבות משותפת, למדוד את TEER מדי יום. הערה: לאחר תקופה ראשונית שבה TEER מגביר, ערכי רשמתה צריכים להישאר יציבים במשך ימים רצופים לפחות (בדרך כלל בין ^ה 5 ואת יום ^ה -7 של שיתוף תרבות). בשלב זה BBB הוא מוכן לשלב השני של אימות (סעיף 2.2) ו / או עבור הניסויים טרנס-BBB.
      הערה: ההליך המתואר בסעיף 2.1 יכול להתבצע על BBB-המערכות באותו מוקדש הניסויים החדירים הבא (סעיף 3). Operate בתנאים סטריליים.
2. חוצה BBB שטף של FITC-dextran 40 (FD40)
   1. מדוד את שטף FD40 מהמפלס העליון אל בתא התחתון של מודלי BBB בהשוואה לזו פני 3 מוסיפה ריק(ראה הערה בסעיף 1.2.1) על פי השלבים הבאים:
      1. הוסף 1 מ"ג / מ"ל FD40 (מדולל sECM) לתא העליון של BBBS, ואחרי 1, 2 ו -3 שעות למשוך עד 200 sECM μl מהאולם התחתון למדוד את עוצמת הקרינה על ידי spectrofluorimeter _(לשעבר λ 488 ננומטר, λ _em 515 ננומטר, ושיסף 5).
      2. השג את הערכים עבור רקע sECM fluorescenceby מדיד 500 μl של מדיום בתולה באמצעות אותם הפרמטרים אנליטיים. הפחת את קרינת רקע sECM מכל ערכי קרינת FD40.
      3. לקבוע את כמות חלחלה FD40 ידי השוואה של ערכי הקרינה נצפתה עם עקומת כיול מיוצר עם ריכוזים ידועים (כלומר. 0.312, 0.625, 1.25, 2.5 מיקרוגרם / מ"ל) של נותב ניאון מומס 500 μl של sECM.
      4. חשבתי את המקדם חדירות לכאורה _{(אפליקצית} P) מן ערכי שטף הממוצעים לפי:
         _{אפליקצית} P = J / AC
         כאשר J הוא השטף של המולקולה (שומות / sec), הוא שטח חלחול ⁽² ס"מ) ו- C הוא הריכוז של מולקולה בתא העליון (שומות / ס"מ ^3).
         הערה: שלוש או יותר BBB-מערכות שהגיעו ערכי TEER מתאימים, חייבות להיות מוקדשות אך ורק הליך אימות זה, ולא צריך להיות מועסק על הניסויים החדירים הבאים (סעיף 3). עקרות אינה חובה.

3. חוצה BBB חלחול של FITC טעון Ferritins (FNN)

הערה: גרסה רקומביננטי של פריטין האדם (Fn), המיוצר Escherichia coli והורכבו nanocages (FNN) אנקפסולציה של מולקולות ניאון שונים, זמין אצל NanoBioLab של פרופ פרוספרי (אוניברסיטת מילאנו-Bicocca, איטליה). FNN נטען עם FITC, על פי פרוטוקול שתואר לעיל ¹³ ועל הריכוזי הוא Fn ואת המולקולות הטעונות הם במדויק determined.

1. חוצה BBB שטף של FITC ו FITC-FNN
   1. מדוד את שטף FITC-FNN מהמפלס העליון אל בתא התחתון של מודלי BBB תוקף (בדרך כלל 5 ^th - יום ^ה -7 של שיתוף תרבות), בהשוואה לזו של צבע חינם לאחר 7 ו -24 שעות של דגירה, על פי את הפעולות הבאות:
      1. הוסף FITC-FNN (50 מיקרוגרם / מ"ל ​​FNN, 1.1 מיקרומטר FITC) או כמות שווה של FITC חופשי לתוך החדר העליון של מערכות BBB 6 לפחות לכל ניסוח, כדי למשוך 2 מ"ל של תמיסת sECM מהאולם התחתון של לפחות 3 מוסיף לאחר 7 שעות, וממנה בתא התחתון של 3 מוסיף אחרים לאחר 24 שעות.
      2. למדוד את עוצמת הקרינה של 500 μl של דגימות שנאספו על ידי spectrofluorimeter _(לשעבר λ 488 ננומטר, λ _em 515 ננומטר, ושיסף 5).
      3. השג את קרינת רקע sECM ידי מדידת 500 μl של מדיום באמצעות אותם הפרמטרים אנליטיים. הפחת את קרינת רקע sECMמכל ערכי הקרינה FITC או FITC-FNN.
      4. קבע את הריכוז של חלחלה FITC או FITC-FNN ידי השוואת ערכי הקרינה שהושג עם שתי עקומות כיול שונים המיוצרים עם ריכוזים ידועים (כלומר. 6.87, 13.75, 27.5, 55 ננומטר) של צבע בחינם או nanoformulated מומס 500 sECM μl.
2. FITC-FNN לוקליזציה RBMECs
   1. הסר sECM מהאולם העליון של מערכות BBB, לשטוף את מוסיף עם PBS ולתקן את RBMECs על שני מוסיף לפחות לכל קבוצת הניסוי על ידי הוספת 500 paraformaldehyde μl (4% חיץ פוספט מלוחים-PBS) בתא העליון עבור 10 דקות ב RT.
   2. שטפו את מוסיף שלוש פעמים עם PBS להסיר paraformaldehyde שיורית.
      הערה: מנקודה זו ואילך, עקרות אינן הכרחיות.
   3. חותך חתיכות מתאימות של קרום PET, ולהמשיך עם immunodecoration של התאים על פי השלבים הבאים:
      1. PermeabiLize RBMECs עם 0.1% Triton X-100 ב PBS במשך 10 דקות. בצע צעד חסימה עבור שעה 1 ב RT עם תמיסה המכילה אלבומין 2% השור (BSA), 2% נסיוב עז ב PBS. דגירה דגימות עם אנטי-פון Willebrand Factor (VWF) בשעה 1:20 דילול עבור שעה 2 ב RT.
      2. לאחר שטיפת שלוש פעמים עם PBS, לחשוף את התאים במשך שעה 2 ב RT על BSA 2%, פתרון סרום עיזים 2% המכיל נוגדנים משני מתאים ביחס של 1: דילול 300 כדי לחשוף את-VWR אנטי, ו DAPI בכל 1: 1,500 דילול לגילוי גרעינים.
   4. הר החתיכות להוסיף על גבי שקופיות מיקרוסקופ באמצעות פתרון הרכבת antifade (טיפה אחת לכל קטע כנס), ולאחר מכן סגור את המדגם עם תלוש כיסוי. לנתח ידי מיקרוסקופ confocal שימוש בעדשת טבילת שמן בהגדלה 40X, 1.5 זום 1,024 x 1,024 פיקסלים.

תוצאות

במהלך הקמת מודל BBB, מצורף התא והצמיחה על המחדיר ניתן לנטר באמצעות מיקרוסקופ אור הודות לאופי השקוף של ממברנות PET. RCAs, זורעים בצפיפות של 35,000 תאים / ² ס"מ, לצרף ביעילות את הצד התחתון של הכנס לאחר 4 שעות של דגירה על RT (איור 2 א) ולגדול כדי לכסו...

Discussion

שיטת מחקר in vitro המתוארת כאן מייצגת גישה תוקף שימושית כדי לחקור מתן טרנס-BBB של מולקולות ניאון על nanoformulation עם חלקיקים. כאן אנו משתמשים FNN, מייצגת מועמד טוב כדי ללמוד את טרנסלוקציה של מולקולות מטען ברחבי BBB. FNN נחשבת nanovector הזהב למסירה טרנס-BBB של סמים / סוכנים שכן הוא מוכר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Brain Microvascular Endothelial Cells	Innoprot	P10308	isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen
Cortical Astrocytes	Innoprot	P10202	isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen.
Endothelial Cell Medium kit	Innoprot	P60104	ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light
Trypsin-EDTA without Phenol Red	EuroClone	ECM0920D	Warm in 37 °C water bath before use
Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000	Sigma	FD40S	protect from light
paraformaldehyde	Sigma	158127	diluition in chemical hood
Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg	EuroClone	ECB4004L
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
goat serum	EuroClone	ECS0200D
mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor	Dako	M0616
AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs	ThermoFischer Scientific	A-11003	protect from light
DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole)	ThermoFischer Scientific	D1306	protect from light
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFischer Scientific	P36934
Poly-L-lysine Hydrobromide	Sigma	P1274	the same solution can be used several times
fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141	the same solution can be used several times
Polyethylene terephthalate (PET) inserts	Falcon	F3090	Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area
T75 Primo TC flask	EuroClone	ET7076
T175 Primo TC flask	EuroClone	ET7181
EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter	World Precision Instruments Germany	EVOM2
Endohm- 24SNAP cup	World Precision Instruments Germany	ENDOHM-24SNAP
Light/fluorescence microscope with camera	Leica Microsystems	DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module	inverted microscope for live cells with camera
Confocal Microscope	Leica Microsystems	TCS SPE
Spectrofluorimeter	Jasco	FP-8000