משולב האינפרה-אדום הקרוב הדמיה פלורסנט וטומוגרפיה-מחושב מיקרו ישירות חזותי מוחין Thromboemboli

Summary

פרוטוקול זה מתאר את היישום של ניאון בשילוב האינפרה-אדום הקרוב (NIRF) הדמיה וטומוגרפיה-מחושב מיקרו (microCT) המאפשר הדמיה thromboemboli מוחין. טכניקה זו מאפשרת כימות של נטל פקיק ואבולוציה. טכניקת דימות NIRF מדמיינת שכותרתו fluorescently פקיק במוח הניכר, ואילו טכניקת microCT מדמיינת פקיק בתוך חיות בעלות באמצעות-חלקיקי זהב.

Abstract

הדמית פקיק ישירה מדמיינת את שורש אוטם תרומבואמבוליים. יכולת פקיק תמונה ישירות מאפשרת הרבה יותר טוב חקירת השבץ מאשר להסתמך על מדידות עקיפות, ותהיה כלי מחקר כלי דם חזק ויציב. אנו משתמשים בגישה הדמיה אופטית כי תוויות thrombi בטוש פקיק הדמיה מולקולרית - פלורסנט Cy5.5 האינפרה-אדום קרוב (NIRF) בדיקה מקושרת קוולנטית גדילי הפיברין של פקיק ידי פעולת אנזימטית crosslinking-הפיברין של XIIIa גורמת קרישה המופעלת במהלך התהליך של התבגרות קריש. טומוגרפיה מיקרו ממוחשבת (microCT), גישה מבוססת משתמשת חלקיקי זהב שוחרת פקיק (AuNPs) פונקציונליות כדי למקד המרכיב העיקרי של קריש: הפיברין. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט עבור בשילוב in vivo microCT לשעבר vivo NIRF הדמיה של thromboemboli במודל של עכברים לשבץ תסחיפי. אנו מראים כי in vivo </ em> microCT ו AuNPs גליקול-chitosan במיקוד הפיברין (FIB-GC-AuNPs) יכול לשמש המאפשר הדמיה הן thrombi באתרו thrombi תסחיפי מוחין. כמו כן, אנו מתארים את השימוש של in vivo הדמית פקיק הישיר מבוסס microCT לפקח על ההשפעות הטיפוליות הסדרה של thrombolysis בתיווך activator plasminogen רקמות. לאחר פגישת ההדמיה האחרונה, אנחנו מדגימים ידי vivo לשעבר NIRF הדמיה במידה וחלוקת thromboemboli שיורית במוח. לבסוף, אנו מתארים תמונה ניתוחים כמותיים של נתוני הדמיה microCT ו NIRF. הטכניקה בשילוב של הדמית פקיק ישירה מאפשרת שתי שיטות עצמאיות של ויזואליזציה פקיק שתשווינה: באזור של אות ניאון הקשורות פקיק על vivo לשעבר NIRF הדמיה לעומת היקף thrombi microCT hyperdense in vivo.

Introduction

אחד מכל 6 אנשים לוקה בשבץ בשלב כלשהו בחייהם. שבץ איסכמי הוא ללא ספק סוג השבץ הנפוץ ביותר, והוא מהווה כ -80 אחוזים מכלל מקרי השבץ. בגלל thromboemboli לגרום רוב שבץ איסכמי אלה, יש עניין גובר בתחום ההדמיה פקיק ישיר.

ההערכה היא כי כ -2 מיליון תאי מוח מתים במהלך כל דקה של חסימה בעורק באמצע מוחין ^1, מה שמוביל את הסיסמה "הזמן הוא המוח". ניתן לעשות טומוגרפיה ממוחשבת (CT) מחקרים במהירות, והם זמינים באופן נרחב; מסיבה זו, CT נשאר ההדמיה שבה נקט באבחון וטיפול הראשוני של שבץ איסכמי hyperacute. CT הוא בעל ערך במיוחד עבור ליידע את ההחלטות המוקדמות הקריטיות: מתן activator plasminogen רקמות (tPA) עבור thrombolysis ו / או triaging אל יחזור קריש ² endovascular. הדמית פקיק הנוכחית מבוסס CT, לעומת זאת, לא ניתן לעקוב אחר סדרה cerebral thromboemboli in vivo, כי היא משתמשת בשיטות עקיפות להפגין thrombi: לאחר עכירות של ברכת הדם לעומת זאת עם יוד, את thrombi מתואר כבעלי מילוי פגמי הכלי. קיימות מגבלות מינון וסיכונים הקשורים במתן החוזר של ניגוד עם יוד, אשר ימנעו חזרו הדמיה של thrombi בצורה זו.

לפיכך, יש צורך קריטי עבור מתודולוגיה הדמיה ישירה thrombi מוחות בחולי שבץ מוחי, כדי לאפשר מהר והחלטות טיפול טובות יותר להתבצע. אנו מציעים לעשות זאת על ידי הגדלת ערכן של CT, באופנות הדמיה החזית המשמש כיום לשבץ, עם השימוש סוכן הדמיה מולקולרית nanoparticular שוחרת פקיק.

אנחנו הוכחנו את השימוש של סוכן באמצעות טומוגרפיה מייקרו ממוחשב (microCT) חברה לשעבר vivo ברזולוציה גבוהה או in vivo (חיה קטנה) גרסת הדמיה של CT המאפשרת רכישת נתונים מהירים ^{3,4. אפילו עם ניגוד הרקמות הרך העני יחסית זמין עבור microCT חיים הקטן (הרבה יותר גרוע ממה שזמין מסורקי אדם בגודל), סוכן ההדמיה הצליח לחפש ולסמן thrombi ידי הפיכתם hyperdense על CT, א 'סימן כלי צפוף "משופר על ידי מולקולרי הַדמָיָה.}

משלימים את הטכניקה CT, הקבוצה שלנו בעבר פיתח טכניקת דימות פקיק ישירה אופטי באמצעות Cy5.5 פלורסנט האינפרה-אדום הקרוב (NIRF) בדיקה לדמיין נטל פקיק מוחין ^5. זוהי טכניקה vivo לשעבר על המוח פוסט מורטם, אבל הוא רגיש מאוד, ויש בהם כדי לאשר בנתונים vivo בסביבה המחקר.

בשניהם CT ו- NIRF מבוסס טכניקות הדמיה שוחרת פקיק מאפשר לנו להשוות לעומת טכניקות אלה כדי להשיג נתונים אינפורמטיבי מאוד על עצמו את התפקיד של פקיק והדמיה פקיק בתהליך של פיתוח שבץ איסכמי.

Here, אנו מתארים פרוטוקול מפורט של טכניקה בשילוב של microCT in vivo לשעבר vivo NIRF הדמיה לדמיין thromboemboli ישירות במודל של עכברים לשבץ תסחיפים. שיטות פשוטות ויציבות אלה שימושיים כדי לקדם את הבנתנו מחל טרומבוטיים ידי ההפעלה המדויקת בהערכת vivo של פקיק ניטל / הפצה ואפיון של אבולוציה פקיק דינמית באופן מהיר וכמותיים in vivo במהלך טיפול, ואחריו נתוני vivo לשעבר המשמשים כסטנדרט מלא התייחסות לאישור של ממצאי הדמית in vivo.

Protocol

נהלי כל החיה הפגינו פרוטוקול זה כבר נבדקו ואושרו על ידי הטיפול בבעלי חי Dongguk אונ' אילסאן חולי ועדת שימוש ו הנערכים בהתאם לעקרונות והנהלים המפורטות במדריך NIH לטיפול והשימוש בחיות.

1. הכנת קריש נוצר כתרופת תווית עם קרינת מרקר (איור 1)

1. להרדים עכבר בתא אינדוקציה באמצעות 3% isoflurane מעורבב עם 30% חמצן (1.5 ליטר / 100% חמצן דקות). ודא עומק נאות של הרדמה על ידי התבוננות טונוס שרירים ו המאשר את עדר רפלקס קמצוץ בוהן.
2. מניחים את חיה על וילון סטרילי ב אפרקדן, ולשמור אותו תחת הרדמה באמצעות מסיכת שאיפה isoflurane 2% מעורבב עם 30% חמצן. בצע את ההליכים הבאים תוך שימוש בטכניקות aseptic ושמלות סטרילי / מסכות / כפפות / מכשירים. לשמור על תנאים סטריליים על ידי ניקוי וחיטוי באזור הניסוי עם אלכוהול 70% לפניnd לאחר ההליכים.
3. אסוף על 300 ~ 1,000 μl הדם העורקי לאחר לנקב לב ^6. מערבבים 70 μl דם מלא עם 30 μl C15 בדיקה ⁵ (20 μmol / ריכוז L), בדיקה ניאון Cy5.5 רגיש לפעילות crosslinking-הפיברין של גורם מופעל XIII (FXIIIa) אנזים קרישה, כדי fluorescently לסמן את הקריש (איור 1A ). להזריק את תערובת באמצעות מזרק 3 מ"ל (23 מחט מד) לתוך צינור פוליאתילן 20 ס"מ (PE-50, מזהה 0.58 מ"מ). צינורות PE יש לעקר (או מוסמך סטרילי על ידי יצרן) ואת הקרישים חייבים להיות מוכנים בסביבה נקיה מחיידקים במנדף בתרבית רקמה.
4. בדוק את מותו של בעלי חיים על ידי התבוננות חוסר הנשימה והדופק לב.
5. השאירו את הצינור טעון דם בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות, ולאחר מכן ב 4 מעלות צלזיוס במשך 22 שעות, ולבצע את ההליכים הבאים, כפי שדווח בעבר ^7.
6. חותכים את הצינור המכיל-פקיק לתוך 1.5 ס"מ באורך חתיכות. באמצעות מזרק 3 מ"ל מלא מלוחים פוספט שנאגרו (PBS), לגרש פקיק לצלחת 6 באר PBS המכילים ידי הזרקת PBS בעדינות לתוך כל פיסת צינור. לשטוף שלוש פעמים thrombi עם PBS (איור 1B).
7. טען את סוף החלק הדיסטלי של צינור 10-PE 15 ס"מ באורך (מזהה 0.28 מ"מ) עם פקיק 1.5 ס"מ באורך ידי ציור פקיק שטף בזהירות, תוך הימנעות בועות אוויר, באמצעות מזרק מלוחים מלא 1 מ"ל עם 30 מחט מד מוכנס לתוך סוף הפרוקסימלי של הצינור.
8. חברו את צינור PE-10 טעון-פקיק עם צינור PE-50 3 ס"מ (מזהה 0.58 מ"מ) שונה כדי להיות לקצה החד (ID 200 מיקרומטר), אשר יוצב על עורק המוח האמצעי (MCA) - הקדמי מוחין הסתעפות העורק (ACA) באזור של עורק התרדמה הפנימי (רשפ"ת) במודל של עכברים לשבץ תסחיפי (תרשים 1C).

2. דוגמנות עכבר דגם של שבץ תרומבואמבוליים (איור 2)

1. AnesthetizEA שונה עכבר שילטף כפי שדווח בעבר ⁷ בתא אינדוקציה באמצעות 3% isoflurane מעורבב עם 30% חמצן (1.5 ליטר / דקה). להזריק meloxicam (5 מ"ג / ק"ג) תת עורי כדי להקל על הכאב לאחר ניתוח. ודא עומק נאות של הרדמה על ידי התבוננות טונוס שרירים ו המאשר את עדר רפלקס קמצוץ בוהן.
2. למרוח כמות קטנה של משחת וטרינרים לעין כל כדי למנוע יובש במהלך הרדמה. בצע את פעולות כירורגיות הבאות תוך שימוש בטכניקות aseptic ושמלות סטרילי / מסכות / כפפות / מכשירים. לשמור על תנאים סטריליים על ידי ניקוי וחיטוי את אזור הניתוח עם 70% אלכוהול לפני, במהלך, ואחרי הניתוח.
3. הזז את העכבר אל שולחן הניתוחים. מניחים את חיה על וילון סטרילי ב אפרקדן, ולשמור אותו תחת הרדמה באמצעות מסיכת שאיפה isoflurane 2%. ואז, מהדק את טמפרטורת הגוף על 36.5 מעלות צלזיוס באמצעות שמיכה homeothermic עם משוב מדחום רקטלי.
4. לאחר surgiהכנה cal בבטאדין 70% אלכוהול, לעשות חתך אנכי 1 ס"מ באמצעות אזמל על הקרקפת בין האוזן והעין השמאלית. מדביקים את הקצה הדיסטלי של סיב אופטי של flowmeter דופלר לייזר על גבי משטח העצם הטמפורלית נותר חשוף (1 מ"מ שמאלה 4 מ"מ מתחת מן גבחת). לאחר מכן, להתחיל ניטור זרימת דופלר (איור 2 א).
5. הנח את החיה. יישר את הצוואר על ידי משיכת שן העליון הקדמי עם מחרוזת המצורפת סיכה לגלח את אזור הצוואר. ואז, לעשות חתך קו אמצע אנכי 3 סנטימטר, פרש אותה, ולחשוף את האזור הנורה התרדמה שהותיר לנתח פרי-וסקולרית רקמות רכות. היזהר שלא לפצוע את העצב התועה.
6. ולקשור את העורק הראשי משותף הפרוקסימלי שמאלה (CCA) באמצעות תפר משי שחור 6-0 סטרילית, ולקשור הרשפ"ת שמאלה העורק pterygopalatine שמאל (PPA) באמצעות 7-0 סטרילית התפרים משי שחור.
7. לצרוב את העורק התריס מעולה עזב, שהוא סניף של usi עורק התרדמה החיצוני השמאליng כוויית monopolar חשמל, ולקשור את העורק הראשי החיצוני הפרוקסימלי השמאל (ECA) רופף ואתר דיסטלי יותר בחוזקה באמצעות 7-0 סטרילית תפרים משי שחורים.
8. באמצעות-מספריים מיקרו, לעשות חור קטן (כ 0.2 ~ 0.25 מיקרומטר קוטר) בין האתרים ligated של ECA.
9. הכנס את קטטר המכיל פקיק לתוך חור ECA תוך התרופפות קשירת ECA הפרוקסימלית. הדקו את קשירת ECA הפרוקסימלית שוב לאחר ההתקדמות קטטר לתוך CCA כדי cinch את הקטטר במקום.
10. לצרוב לחתוך את החלק הדיסטלי ECA, שהוא דיסטלי לאתר קשירת דיסטלי, וסובב את ECA הפרוקסימלית חינם עם כיוון השעון כדי ליישר אותו לכיוון של הרשפ"ת תוך הוצאת הקטטר מן המרכז לאמנות עכשווית. לאחר מכן, לקדם את הקטטר כ -9 מ"מ לתוך MCA - אזור הסתעפות ACA של האגודה למלחמה בסרטן דיסטלי מיד לאחר התרופפות קשירת ICA. לאחר מכן, להדק את קשירת ICA.
11. מניחים את פקיק לאזור הסתעפות ידי בעדינותלחיצה על מזרק 1 מ"ל להזריק פקיק. בדוק את הירידה של זרימת דם במוח דופלר (CBF), אשר אמור להיות מושפלת על ידי 30% או נמוכים יותר לעומת התחלה, אם פקיק בהצלחה האפיל הספינה (איור 2 ב).
12. הסר את הקטטר, ולקשור את האתר ECA הפרוקסימלי מיד בחוזקה. בנוסף, unligate המרכז לאמנות עכשווית ואת PPA.
13. לסגור את האתר חתך באמצעות 6-0 תפרים משי. עצור הרדמה לאחר המשך ניטור דופלר במהלך פרק זמן נדרש (כאן, למשך 30 דקות לאחר הזרקת פקיק). החזר את העכבר בכלוב ריק, ולשמור אותו חם עם מנורת חימום. אל תשאירו את העכבר ללא השגחה עד שהוא צבר תודעה מספיק כדי לשמור שכיבה sternal.

3. Vivo microCT הדמיה של שיתוק פקיק (איור 3)

1. Re-להרדים את העכבר עם 2% isoflurane כפי שמתואר בשלב 2.1 בכל שהוגדרו מראש זמן נקודות (כאן, 1 hr) בעקבות התפרצותלשבץ תסחיפים בשל המיקום של פקיק בעורק המוחי. ודא עומק נאות של הרדמה על ידי המאשר בהעדר רפלקס קמצוץ בוהן. למרוח כמות קטנה של משחת וטרינרים לעין כל כדי למנוע יובש במהלך הרדמה.
2. Resuspend חלקיקי זהב במיקוד הפיברין (FIB-GC-AuNP ⁴⁾ בריכוז של 10 מ"ג Au / ml ב 10 מ"מ PBS, sonicate הסוכן הדמיה פקיק למשך 30 דקות על מנת להבטיח פירוק ופיזור של חלקיקים. להזריק 300 μl-GC לבלף-AuNP (10 מ"ג / מ"ל) לתוך הווריד הפין.
3. מניח את החיה על המיטה של ​​מכונת microCT, וליישר את הצוואר על ידי משייכת השן הקדמית העליונה עם מחרוזת המצורפת סיכה להפחית הצעת artifacts.
4. בשעה 5 דקות לאחר ההזרקה של לבלף-GC-AuNP, מתחילים להשיג תמונות microCT של המוח. עבור הניסויים שתוארו כאן, השתמש בפרמטרים הדמיה הבאים: 65 KVP, 60 מיקרו-אמפר, 26.7 x 26.7 x 27.9 מ"מ ³ שדה הראייה, 0.053 x 0.053 x 0.054 מ"מ ³ בגודל של פיקסלים, 100 אלפיות לכל מסגרת, 1 המיצוע, 360 צפיות, 512 x מטריקס שחזור 512, 600 פרוסות, 64 שניות סריקה זמן.
5. החזר את העכבר בכלוב ריק, ולשמור אותו חם עם מנורת חימום. אל תשאירו את העכבר ללא השגחה עד שהוא צבר תודעה מספיק כדי לשמור שכיבה sternal.
6. להפוך את נתוני התמונה גלם לתוך ההדמיה הדיגיטלית והתקשורת בפורמט לרפואה (DICOM) באמצעות הפקודה "התחל" של לוח'הרקונסטרוקציה 'בתוך חבילת התוכנה המותקנת על סורק microCT.
7. עבור ניתוחים כמותיים של התמונות (בשלב 6), להמיר את נתוני DICOM לפורמט TIFF באמצעות חבילת תוכנה זמינה באופן מסחרי על פי הוראות היצרן.
8. עבור איכותי מנתח וכן ניתוחים כמותיים בצורה פשוטה יותר ומהירה יותר, להשתמש בחבילת תוכנה ואת תמונות עבות 0.054 מ"מ המקורי בפורמט DICOM להפקת סדרה חדשה שלתמונות ציריות עטרה שניתנו יש מ"מ 1 או 2 (כאן, 2 מ"מ) עובי, כדלקמן.
   1. בחר את תיקיית DICOM על העץ "מקור הנתונים ', לחץ על הכפתור הימני של העכבר, ולייבא את התיקייה' MasterDB 'או' PrivateDB '.
   2. לחץ על 'MasterDB' או 'PrivateDB' בעץ 'מקור הנתונים', ובחר את התיקייה המיובאת. לאחר הלחיצה על הלשונית '3D' בלוח השמאלי ביותר, כאשר החלון 'אפשרויות Loading' צץ, לחץ על 'אישור' כדי לייבא רצף של תמונות בתיקייה כערימה.
   3. שינוי ייצוג התמונה הקרנת העוצמה המקסימלית (MIP) תבנית בלחיצה על המילה 'MRP' ב צירית וחלונות תמונה העטרה ועל בחירת 'MIP' בתפריט המוקפץ. לאחר מכן, לשנות את עובי תמונה 2 מ"מ לאחר לחיצה על 'TH: 0 [מ"מ]' ואותם חלונות.
   4. באמצעות 3D רוחב 2 מ"מ נהvigator בר המאפשר לחקור ערימת תמונה והיא חותכת אותו בזווית ומיקום מתאים, להכין תמונת סעיף צירית בעובי 2 מ"מ עם כיסוי מלא של המעגל ויליס (פרה), אשר מטפח thrombi. לחץ על הכפתור הלכיד (סמל מצלמה) בלוח 'הפלט'. שמור את התמונה בפורמט TIFF.
9. לאחר מכן, להכין חמישה 2 מ"מ תמונות סעיף העטרה עבה שמכסים בסמיכות מן האונה הקדמית במוח הקטן.
   1. ראשית, להכין את הפרוסה השנייה על ידי יישור בר הנווט בזהירות על התמונה צירית כך שהתמונה העטרה בצורה הטובה ביותר להמחיש את MCA - thrombi ACA.
   2. בשלב הבא, להכין ארבע הפרוסות האחרות באופן רציף. לחץ על הכפתור הלכיד (סמל מצלמה) בלוח 'הפלט'. שמור את התמונות בפורמט TIFF.

4. Thrombolysis ובחי microCT הדמיה של שיתוק פקיק (איור 3)

1. הכינו 100 ס"מ PE-10 הצינור עם מחט 30 מד בצד אחד מזרק 1 מ"ל בצד השני. מלאו את הצינור עם או מלוחים (600 μl) או tPA (כאן, 24 מ"ג / ק"ג, 600 μl) תוך הימנעות בועות אוויר.
2. Re-להרדים את העכבר כפי שמתואר בשלב 2.1. הכנס את קצה המחט בתוך הווריד הפין של החיה. מניח את החיה בזהירות על המיטה של ​​מכונת microCT. לאחר מכן, לשתק ולייצב חלק לוריד המוזרק של מערכת קטטר ידי מקליט אותו אל המיטה.
3. בצע פגישת הדמית מעקב, לעומת בסיס טרום טיפול. לאחר מכן, להזריק או 60 μl מלח רגיל או tPA מדכא את בוכנת המזרק לתוך מערכת קטטר. לאחר זריקת בולוס, מתחיל להחדיר הפתרון הנותר (540 μl) על פני תקופה של זמן (כאן, 30 דק ').
4. להשיג תמונות microCT באמצעות אותם הפרמטרים כמו בשלב 3.4 ב שהוגדרו מראש בזמן נקודות: כאן, ב 3 ו 24 שעות לאחר הזרקת בולוס. כדי לבצע את הפעולות הבאות vivo לשעבר NIRF thromהדמיה אוטובוס של המוח, להרדימו בהרדמה ידי נקע בצוואר הרחם.

5. הדמיה פקיק Ex Vivo NIRF ו Triphenyl tetrazolium כלוריד (TTC) מכתים של רקמת המוח (איור 4)

1. לאחר עריפת ראש, להסיר את הקרקפת לחתוך דרך הגולגולת במספריים מן מגנום foramen מתחזק לקראת תפר sagittal. הסר את קמרון גולגולתי ידי הרמת הקצוות בקפידה של הגולגולת החרותה באמצעות מספריים, תוך הימנעות מפגיעת המוח הבסיסי, ובכך עִרטוּל ההמיספרות.
2. חותך את עצבי הראייה בבסיס המוח הקרוב ככל האפשר אל פני שטח המוח, כי הם יכולים לחפוף עם המעגל של עורקים וויליס שאמור להיות דמיין על הדמית NIRF. לאחר מכן, על מנת להמחיש את Y-צורה בבירור "MCA / ACA / ICA דיסטלי 'עבור הדמיה פקיק NIRF, לגזור את ICAs דיסטלי ככל האפשר אל פני השטח במוח לאחר דחיסת בעדינות בבסיס המוח הקטן לחשוף הנקודות חיתוך דואר (איור 4 א).
3. בצע הדמית NIRF (עירור / פליטה, 675/690 ננומטר; 1 חשיפה שנייה) של רקמת המוח סיר עם הבסיס שלה כלפי מעלה (איור 4 ב ', ג'), אשר ממחיש את thromboemboli שכותרתו fluorescently בעורקים של פרה (איור 4D) . לאחר מכן, לבצע הדמיה נוספת עם הקודקוד של המוח כלפי מעלה, אשר מדמיין thromboemboli קליפת המוח. הימנע ייבוש של המוח על ידי הצבת כמה טיפות של תמיסת מלח על הרקמה.
4. שימוש בהתקן מטריקס המוח על פי הוראות היצרן, במהירות להכין פרוסות המוח בעובי 2 מ"מ coronally: 6 חתיכות של 2 מ"מ פרוסות עבות (2.3, 0.3, -1.7, -3.7, -5.7 מ"מ מן גבחת). הימנע ייבוש של פרוסות המוח באמצעות טיפות מי מלח, ולבצע הדמיה NIRF הן מלפנים המשטח האחורי של סעיפים.
5. מכניסים את פרוסות המוח כלוריד 2% triphenyl tetrazolium (TTC) פתרון עבור 20 דקות, תוך הימנעות מחשיפה תאורתt. לאחר מכן, להעביר את פרוסות לתוך בתמיסת פורמלדהיד 4% ב 4 מעלות צלזיוס, תוך הימנעות מחשיפה לאור.

כימות 6. של פקיק פינת באמצעות תמונות microCT ו ImageJ (1.49d) תוכנה (איור 5)

1. פתחו תמונות (איור 5 א).
   1. קבצי תמונה ברצף להרחיב ליצור קובץ מחסנית ידי בחירת 'קובץ'> 'יבוא> רצף תמונה' או 'קובץ'> 'פתח'. להמיר את התמונות בגווני אפור 8 סיביות באמצעות 'תמונה> סוג> 8 סיביות ".
2. המרת היחידה מ אינץ מילימטר (איור 5 א).
   1. כאשר פיקסל אחד של קבצי תמונת CT תואם 0.053 מ"מ, השתמש 'נתח> סולם גדר' להיכנס '1', '0.053 ", ו' mm 'עבור' המרחק בפיקסלים ',' מרחק ידוע ', ו' יחידת האורך ', בהתאמה.
   2. כאשר (בלבד) בר קנה מידה זמין,שימוש באפשרות "הקו הישר" למתוח קו עם אורכו שווה לזה של סרגל מידה. לאחר מכן, השתמש 'נתח> סולם גדר "להיכנס אורך בר מידת מילימטר.
3. חיסור רקע (איור 5)
   1. באמצעות 'ערוך> בחירה> ציין' מקום אזור עגול או מלבני של עניין (ROI) על שטח של המוח parenchyma ללא פקיק או hyperdense אזורים הקשורים העצם. מכיוון ROI שצוין חל על כל פרוסה של המחסנית, לבדוק כדי להיות בטוח אם היא לא חפפה עם אזורי hyperdense בכל פרוסה.
   2. בחר "Plugin> ROI> חיסור BG מהחזר ROI 'והזן 2.0 עבור' מספר סטיית תקן מהממוצע".
4. פילוח Thromboemboli הקשורות Hyperdense הנגעים (איור 5 ג)
   1. בחר 'תמונה> התאם> סף', והזן את הערכים של "Loרמת סף wer 'ו' רמת סף עליון "כמו 22 ו 255, בהתאמה. בחירה 'מעל / מתחת' כדי להציג פיקסלים מתחת לערך הסף הנמוך בפיקסלים כחולים, thresholded בגוונים אפור, ופיקסלים מעל ערך הסף העליון בירוק.
   2. השתמש "כלי בחירת Freehand 'לצייר ROIs המקיף נגעי hyperdense הקשורות thromboemboli מבלי לכלול אזורים גרמיים. במהלך הציור, תמשיך ללחוץ גם על [SHIFT] או [alt] כדי להוסיף או להסיר אזור, בהתאמה.
      הערה: אם נגעי hyperdense תרומבואמבוליים רחוקים מבנים גרמיים, במקום "כלי הבחירה Freehand ',' שרביט הכלי 'ניתן להשתמש בבטחה מבלי לשנות רמת' הסובלנות 'שלה.
5. כימות של הנגעים המקוטעים (איור 5D)
   1. השתמש ב 'לנתח> מדידות סט' לבחור 'פינה', 'Mean גריי ערך', ו 'משולבת בצפיפות (הפינה X Mean)9 ;. בדוק את האפשרויות הבאות: "הגבל ל סף 'ו' תווית תצוגה '. השתמש ב 'לנתח> מדוד' כדי לקבל את הנתונים הניתנים לכימות. כעת שמור את התוצאות כקובץ ".xls".
   2. שמור את קובץ המחסנית בפורמט TIFF. בנוסף, השתמש 'לנתח> כלים> מנהל ROI' להציל את ROIs.

תוצאות

תמונות Baseline microCT, שהושגו vivo שלאחר מתן לבלף-GC-AuNP (10 מ"ג / מ"ל, 300 μl) בשעה 1 שעות לאחר שבץ תסחיפי, פקיק מוחין דמיינו בבירור MCA - אזור הסתעפות ACA של עורק התרדמה הפנימי הדיסטלי (איור 6 ). מעקב הדמית microCT לא הראתה שינוי פקיק פרה עם טיפול מלוח. עם ז...

Discussion

הפגנו את השימוש בשתי טכניקות הדמיה מולקולריות משלימות הדמית פקיק ישירה במודלים ניסיוניים לשבץ תסחיפים: א הפיברין ממוקד ננו-חלקיקים מזהב (FIB-GC-AuNP) בתחום הדמית vivo מבוסס microCT, וכן FXIIIa ממוקד חללית הדמיה אופטית עבור לשעבר vivo הדמיה ניאון.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Machines
microCT	NanoFocusRay, JeonJu, Korea	NFR Polaris-G90
NIRF imaging system	Roper-scientific,Tucson, AZ	coolsnap-Ez
Laser Doppler flowmeter	Perimed, Stockholm, Sweden	PeriFlux System 5000
Surgical microscope	Leica Microsystems, Seoul, Korea	EZ4HD
Inhalation anesthesia machine	PerkinElmer, Massachusetts, USA	XGI-8
Software
NFR control	NanoFocusRay, JeonJu, Korea	NFR Polaris-G90	microCT control software
Lucion	Infinitt, Seoul, Korea	Lucion	3D render imaging software
Lab chart 7	ADInstruments, Colorado, USA	Lab chart 7	rCBF
ImageJ software	Wanye Rasband, NIH, USA	1.49d	imaging analysis
Devices/Instruments
Infusion pump	Harvard, Massachusetts, USA	pump 22(55-2226)
Homeothermic blanket	Panlab, Barcelona, Spain	HB101
Pocket cautery	Daejong, Seoul, Korea	DJE-39
Brain matrice	Ted pella, CA, USA	15003	coronal section
PE-50 tubing	Natsume, Tokyo, Japan	SP-45(PE-50)	I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm
PE-10 tubing	Natsume, Tokyo, Japan	SP-10(PE-10)	I.D. 0.28 mm O.D. 0.61 mm
30 gauge needle	sungshim-medical, Seoul, Korea
Syringe	CPL-medical, Ansan, Korea		1 & 3 cc
Gauze	Panamedic, Cheonan, Korea
Tape	Scotch, Seoul, Korea	3M-810
Micro forceps	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	11253-27	Dumont #L5
Micro scissor	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	15000-03	Vannas spring
Scissor	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	14084-08	8.5 cm
Black silk suture	Ailee, Busan, Korea	SK6071, SK728	6-0 and 7-0
Reagents
meloxicam	Yuhan, Seoul, Korea
vet ointment	Novartis, Basel, Swiss
10% Povidone-iodine (betadine)	Firson, Cheon-an, Korea
FeCl3	Sigma, Missouri, United States	157740-5G
TTC	Amresco, Ohio, USA	0765-100g
Isoflurane	Hana-Pham, Gyeonggi, Korea	Ifran	100 ml
PBS	Welgene, Daegu, Korea	LB001-02	500 ml
Gold nanoparticles			Synthesis
C15 optical agent			Synthesis
Tissue plasminogen activator	Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany	rtPA(actilyse)	20 mg
Normal saline	Daihan Pham, Seoul, Korea	48N3AF3	20 ml