JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A-תפוקה גבוהה, אוטומטית, מתודולוגיה ייצור וטרנספורמציה טבק פרוטופלאסט מתוארת. המערכת הרובוטית מאפשרת ביטוי גנים מקביל מסיבי וגילוי במודל BY-2 המערכת שאמורה להיות לתרגום לגידולים שאינם מודל.

Abstract

בעשור האחרון חלה התעוררות מחודשת השימוש פרוטופלאסט צמח נעים בין מיני מודל לחתוך מינים, לניתוח של מסלולי העברת אותות, רשתות רגולטוריות תעתיק, ביטוי גנים, הגנום עריכה-להשתקת גנים. יתר על כן, התקדמות משמעותית נעשתה ההתחדשות של צמחים מפני פרוטופלאסט, אשר יצרה עניין עוד יותר את השימוש במערכות אלה עבור הגנומיקה צמח. בעבודה זו, פרוטוקול פותח לאוטומציה של בידוד פרוטופלאסט וטרנספורמציה מתרבה השעית טבק 2 'צהובה בוהק "(BY-2) באמצעות פלטפורמה רובוטית. נהלי טרנספורמציה אומתו באמצעות חלבון פלואורסצנטי כתום גן כתב (OFP) (pporRFP) תחת השליטה של ​​אמרגן 35S וירוס פסיפס הכרובית (35S). ביטוי OFP ב פרוטופלאסט אושר על ידי מיקרוסקופ epifluorescence. ניתוח כלל גם שיטות יעילות הייצור פרוטופלאסט באמצעות propidiuיודיד מטר. לבסוף, אנזימי כיתת מזון בעלות נמוכה שמשו הליך בידוד פרוטופלאסט, עקיפת הצורך אנזימי מעבדת כיתה כי הם עלות אוסרני ב תפוקה גבוהה אוטומטי בידוד פרוטופלאסט וניתוח. בהתבסס על הפרוטוקול שפותח בעבודה זו, הנוהל במלואו מבידוד פרוטופלאסט לטרנספורמציה יכול להתנהל תחת 4 שעות, ללא כל קלט מהמפעיל. בעוד פרוטוקול שפותח בעבודה זו קיבלה תוקף עם תרבית תאים BY-2, נהלים ושיטות צריכה להיות לתרגום לכל ההשעיה צמח תרבות / מערכת פרוטופלאסט, מה שאמור לאפשר האצה של מחקר הגנום היבול.

Introduction

בשנים האחרונות חלה תנופה משמעותית דגש על העיצוב של יבולים מהונדסים להתגבר מחלות שונות 1, מעניק עמידות עשבים 2, להעניק בצורת 3,4 וסובלנות מלח 5, למנוע herbivory 6, להגדיל את התשואה ביומסה 7, ולהקטין סרבנות דופן תא 8. מגמה זו כבר שנעזר בפיתוח כלים מולקולריים חדשים להפקת צמחי מהונדס, כולל הגנום עריכה באמצעות CRISPR ו TALENs 9, ואת הגן השתקה דרך dsRNA 10, מירנה 11, ו siRNA 12. בעוד הטכנולוגיות הללו יש לפשט את הדור של צמחים מהונדסים, הם גם יצרו צוואר בקבוק, שבו המספר העצום של צמחים מהונדסים שנוצר לא יכול להיות מוקרן באמצעות מערכות מסורתיות המסתמכות על התחדשות צמח. הקשורים צוואר הבקבוק הזה, תוך השתקה בונה לעריכת הגנום יכול להיות מוכנס לתוך במהירות צמחים, רבים שלתכונות ממוקדות מצליחות לייצר את האפקט הרצוי, אשר לעתים קרובות ומתגלה רק צמחים מנותחים בחממה. בעבודה זו, פיתחנו שיטה מהירה, אוטומטית, הקרנת תפוקה גבוהה של פרוטופלאסט צמח, במיוחד כדי לענות על צוואר הבקבוק הנוכחי להקרנה מוקדמת של מספר גדול של עריכת-הגנום הגן השתקה מטרות.

השימוש פרוטופלאסט, בניגוד בתאי צמח שלם, יש מספר יתרונות לפיתוח פלטפורמה אוטומטית. ראשית, פרוטופלאסט מבודד לאחר העיכול של דופן תא צמח, ועם המחסום הזה כבר לא קיים, יעילות שינוי היא גדלה 13. בתאי צמח שלמים יש רק שתי שיטות ותיקות לטרנספורמציה, biolistics 14 ו Agrobacterium בתיווך טרנספורמציה 15. אף אחת מהשיטות הללו יכולים להיות מתורגמים בקלות לפלטפורמות טיפול נוזל, כמו biolistics דורש ציוד מיוחד עבור transformation, ואילו Agrobacterium טרנספורמציה בתיווך דורשת שיתוף תרבות והסרה הבאה של החיידקים. לא ניתנים עבור שיטות תפוקה גבוהות. במקרה של פרוטופלאסט, שינוי מתבצע באמצעות פוליאתילן גליקול שיגרתי (PEG) transfection בתיווך 16, מחייב חילוף פתרון מספר בלבד, והוא אידיאלי עבור פלטפורמות טיפול נוזל. שנית, פרוטופלאסט, מעצם הגדרתו, תרבויות תא בודד, ובכך הבעיות קשורות היווצרות בצעדים כבדה שרשרת בתרביות תאי צמח, אינם שנצפה פרוטופלאסט. מבחינת לסינון מהיר באמצעות ספקטרופוטומטר מבוסס-צלחת, התקבצות של תאים, או תאים במטוסים מרובים יובילו קושי ברכישת מדידות עקביות. מאז פרוטופלאסט צפוף גם מאשר התקשורת והתרבות שלהם, הם משקעים לתחתית בארות, ויצרו בשכבה, שהיא תורמת spectrophotometry מבוסס צלחת. לבסוף, בעוד תרבויות השעית תא צמח הם primarily נגזר יבלת 17, ניתן לקצור פרוטופלאסט ממספר רקמות הצמח, מה שמוביל את היכולת לזהות ביטוי רקמות ספציפיות. לדוגמא, היכולת לנתח root- או ביטוי ספציפי עלים של גן יכול להיות חשוב מאוד לניבוי הפנוטיפ. מסיבות אלה, פרוטוקולים שפותחו בעבודה זו אומתו באמצעות פרוטופלאסט מבודד טבק-בשימוש נרחב (Nicotiana tabacum L.) 'צהוב בוהק' 2 (BY-2) תרבות ההשעיה.

תרבות ההשעיה BY-2 תוארה תא "הלה" של צמחים גבוהים יותר, בשל השימוש הנפוץ שלה באנליזה מולקולרית של בתאי צמח 18. לאחרונה, BY-2 תאים שמשו כדי לחקור את ההשפעות של צמח לחצי 19-22, לוקליזציה חלבון תאית 23,24, ביולוגיה של תא בסיסי 25-27 הוכחת השירות הרחב של תרבויות אלה בביולוגית צמח. יתרון נוסף של תרבויות BY-2 הואהיכולת לסנכרן התרבויות עם aphidicolin, מה שעלול להוביל שחזור משופר עבור ביטוי גנים שלומד 28. יתר על כן, שיטות פותחו עבור החילוץ של BY-2 פרוטופלאסט באמצעות אנזימים בעלות נמוך 29,30, כמו אנזימים מסורתיים המשמשים לייצור פרוטופלאסט הם עלות גבוהה למערכות תפוקה גבוהה. ככזה, הפרוטוקול המתואר להלן יאומת באמצעות תרבות השעית BY-2, אבל זה צריך להיות amendable לכל תרבות השעית תא צמח. הוכחה של קונספט ניסויים מבוצעים באמצעות חלבון פלואורסצנטי כתום (OFP) גן כתב (pporRFP) מן Porites האלמוגים הקשה porites 31 תחת השליטה של אמרגן 35S CAMV.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הקמת תא תרבויות השעיה

  1. הכן נוזלי BY-2 מדיה ידי הוספת 4.43 גרם Linsmaier & Skoog התקשורת בסל, 30 גרם של סוכרוז, 200 מ"ג KH 2 PO 4, ו -200 מיקרוגרם של 2,4-dichlorophenoxyacetic חומצה (2,4-D) ל -900 מ"ל של מזוקקים מי pH 5.8 עם 0.1 M KOH. לאחר תקנון pH, להתאים את עוצמת סופית 1,000 מיליליטר עם מים מזוקקים חיטוי. מדיה ניתן לאחסן עד 2 שבועות 4 ° C.
  2. לחסן בבקבוק 250 מ"ל Erlenmeyer עם 100 מ"ל של נוזל BY-2 התקשורת חתיכה אחת של יבלת BY-2 (> 1 ס"מ קוטר) גדל על BY-2 התקשורת מוצק (נוזל BY-2 מדיה בתוספת 1% אגר) ואת החותם עם רדיד אלומיניום. דגירת התרבות ב C 28-30 מעלות עם רעד במשך 5 ימים.
    הערה: BY-2 יבלת מתוחזק על תקשורת מוצקה עבור אחסון לטווח ארוך, כמו תרבויות נוזל תהיינה לגדול יותר במהירות. נפח תרבות יכול להיות מותאם לפי צורך, בדרך כלל תרבות 100 מיליליטר תהיה מסוגל טעינת שלושים ושלושה 6-wצלחות ell.
  3. העברת 2 מ"ל של שלב יומן BY-2 תרבות 98 מ"ל של התקשורת BY-2 טריים דגירה של 5-7 ימים ב 28-30 מעלות צלזיוס עם רעד.
    הערה: culturing-Sub של תרבויות נוזליות הוקמו יכולה להתבצע באמצעות בקביעות 1: 100 דילולים של תרבויות ישנות 5-7 יום, ולא חיסון עם יבלת.
  4. מערבבים את התרבות ביסודיות, כמו תאים יישב במהירות, והעברת 6 מ"ל של תרבית תאים לצינור צנטריפוגות התחתונה חרוטי 15 מ"ל ולתת התאים להסתפק דקות 10 לפחות. התאם את נפח תא ארוז 50% מכלל נפח על ידי הסרת supernatant.
  5. Shake צינור ידי היפוך ו pipet 500 μl לבאר כל צלחת 6-גם לעיכול. השתמש pipets רחב נשא להעביר את התאים בשלב זה, כפי שהם צפופים יסתום טיפים pipet סטנדרטי.

2. בידוד פרוטופלאסט

  1. הפעל את כל המרכיבים של מערכת רובוטית (איור 1A) ולפתוח את המשימה מניעת צלחת תזמון רךכלי. תכנית תזמון משימות משלבת את מניע microplate עם הציוד האחר כדי לאפשר העברת הצלחות בין כל חלקי ציוד.
  2. לפני ניסויים, להגדיר את המפרט הטכני עבור מעבדתי (למשל, צלחות, מכסים) בשימוש בפרוטוקול, כמו גם התחלה ועמדות מסתיימות עבור כל פיסת מעבדתי, בתוכנה המניעה צלחת, כדלקמן:
    1. לחץ על הגדרה מסרגל הכלים הראשי בתוכנה המניעה צלחת ובחר את פקודת סוגי מכולות ניהול.
    2. אם סוג המכל מופיע בספריית הסוג מיכל הקיימת, ולאחר מכן בחר את המכל המתאים.
    3. אם סוג המכל אינו רשום בספריית סוג המכל הקיימת ולאחר מכן לחץ על הוספה כדי לציין סוג מכל חדש.
    4. לאחר הוספת סוג מיכל חדש, הכנס את הממדים של המכל החדש (גובה, רוחב, מידות ערמה, ואת תפסן לקזז) לתוך הכרטיסיות רצויות ולחץ על שמור.
      1. אם הממדים הנכונים אינם זמינים מהיצרן, אז לקבוע במדויק בכל הממדים עד המילימטר הקרוב באמצעות מחוגה. שגיאות במדידת הממדים מיכל תגרומנה לכישלון מניע הצלחת.
    5. חזור על שלבי 2.2.2 דרך 2.2.4.1 לכל סוגים מיכל שמניע הצלחת יפגוש. לאחר השלמת שלב זה עבור כל מעבדתי, יש צורך להגדיר את ההתחלה מיקום הסיום עבור כל מכולה (שלב 2.2.6).
      הערה: עבור פרוטוקול זה המעבד כוללת את 6-גם צלחת, צלחת העמוקה היטב, ואת 96-גם צלחת הקרנת ניאון.
    6. כדי להגדיר את מיקום ההתחלה וסיום של כל מכולה, לחץ על כרטיסיית ההתחלה / סיום בפרוטוקול ספציפי. ראשית, בחר את מיקום ההתחלה של כל מכולה. בשלב הבא, סמן את התיבה עבור עפעפיים / Unlidded היא ברמה של ההתחלה וסיום המיקום. חזור על הפעולה עבור כל מכולה.
      הערה: אם המיכל יישאר על עוד פיסת סוסיםipment (במקום מניע הצלחת) המיקום סוף ניתן להשאיר ריק.
  3. בשלב זה באופן ידני לטעון את כל הצלחות לתוך למצב ההתחלתי עבור כל העבודה. טען את צלחות ההקרנה פלורסנט 96-היטב לתוך מלון 2, 6 צלחות היטב עם BY-2 תאים לתוך מלון 3, צלחת 96 עמוק היטב אשר ישמשו לטרנספורמציה על הקן מחמם צלחת / ילר 2, ו חרוטי 50 מ"ל שפופרת המכילה את פתרון האנזים (ראה קובץ משלימה, סעיף 1.2.2) על מתקן המצב המרובה.
    1. אם השינוי יתבצע בפרוטוקול, טרום לטעון 96 צלחת עמוקה היטב עם 10 μl של ה- DNA פלסמיד לכל טוב (1 מיקרוגרם / μl, A 260/280> 1.8) המכיל את לבנות כתב OFP דגירה על הצלחת דוד / ילר ב 4 ° C.. כל טוב ישמש טרנספורמציה יחיד, ובכך הגיע מספר בארות מלא יהיה תלוי בהגדרת הניסוי.
  4. טענת את כל האספקה ​​והצלחות על האוטומציהלפלטפורמת טיפול ד נוזלי במקומות המיועדים ולהגדיר את המיקום של כל פריט ב תוכנות שליטה אוטומציה (איור 1B).
    1. טען צלחת 96-היטב מראש עם 200 μl של PEG 40% ב MMG (0.4 M מניטול, 100 מ"מ MgCl 2, 4 מ"מ MES, pH 5.7) בטור 1, 200 μl של יודיד propidium (PI, 1 מיקרוגרם / מ"ל) בטור 2, ו -200 μl של אתנול בעמודה 3 (הקן 2), וקופסת טיפים פיפטה בקן 8.
    2. כדי להגדיר את מיקומו של מעבדתי בתוכנה של פלטפורמת טיפול הנוזל אוטומטית, כלים מהתפריט ולחץ עורך Labware.
    3. בחר את סוג מעבדתי מהתפריט הנפתח או להגדיר סוג מעבדי חדש באמצעות הלחצן Labware החדש.
    4. הגדר את המיקום של כל פיסת המעבדת שנבחרה על ידי בחירת הכרטיסייה ראש הפרוטוקול ולחיצת Labware Configure. ודא כי כל פיסת מעבדתי להוסיף על פלטפורמת טיפול נוזל אוטומטית היאכהגדרתו ערב הפעלת הפרוטוקול.
    5. כדי לעורר את הפרוטוקולים האוטומטיים, לחץ על חלון פרופיל Explorer ובחר את שמו של הפרוטוקול שיופעל (בידוד פרוטופלאסט, ספירת תאים, וטרנספורמציה בתיווך PEG).
    6. לחץ על הפעל כדי לאתחל את כל ההתקנים אשר ישמשו בפרוטוקול.
    7. לבסוף, בחלון העבודה Explorer, לחץ על הוסף יחידת עבודה כדי לאמת את כל המכולות / מעבדתי במערכת ולהתחיל הפרוטוקול האוטומטי.
      הערה: תיאור מלא של הפרוטוקולים האוטומטיים מוכלים קובץ המשלימה.

3. יקבע תקן Curve עבור ספירת תאים

  1. ידנית להתרכז פרוטופלאסט בריכוז של 1 x 10 6 פרוטופלאסט / מ"ל בנפח של 1 מ"ל. צנטריפוגה פרוטופלאסט XG ב 1000 למשך 10 דקות, ולהסיר supernatant.
  2. הוספה ידנית של 900 μl של אתנול 70% (שמרו על 4 מעלות צלזיוס) כדי גלולה פרוטופלאסטמחדש להשעות גלולה. דגירה במשך 10 דקות על קרח כדי לתקן תאים.
  3. הוספת 100 μl של PI (1 מיקרוגרם / מ"ל) אל פרוטופלאסט לתייג את הגרעינים ולאפשר זיהוי על ידי הקורא צלחת.
  4. טען 80 μl של נוזל BY-2 מדיה לתוך כל שורה ועמודה של צלחת הקרנת פלורסנט 96-היטב החל עמודת 2.
  5. בטור 1 של צלחת ההקרנה פלורסנט 96-היטב, להוסיף 70 μl של פרוטופלאסט ו -50 μl BY-2 התקשורת היטב כל בעמודה.
  6. מניח את צלחת קן 6 של פלטפורמת טיפול נוזל אוטומטית, ולהפעיל דילול סדר פי 2.
    1. כדי לערוך דילול סדר על פלטפורמת טיפול נוזל אוטומטית, לחץ הפעל אשף דילול סדר ולהתאים את עוצמת קול ההעברה (60 μl), מספר תערובות ונפח (2, 70 μl), בארות ראשוניות (טור 1, שורות AF), דילול בארות (עמודות 2-11, שורות AF), ואת לשאוב ומאפיינים לוותר (0.5 מ"מ היטב למטה).
    2. לאחר הגדרת הפרמטרים, לשמורd להריץ את הפרוטוקול.
      הערה: מכיוון שכל פרוטופלאסט מסומן עם PI (בשל קיבעון של תאים), הקרינה היא מידתית לריכוז פרוטופלאסט.
    3. לאחר דילול סדרתי יושלם, הסר את הצלחת מן הקן 9 ולהכניס לתוך קורא הצלחת ולהפעיל את הפרוטוקול העקום הסטנדרט בתוכנה קוראת צלחת.
      הערה: עקומת סטנדרט אז תופק על ידי השוואת הקרינה מן PI (עירור 536 ננומטר / פליטה 620 ננומטר) בכל טוב עם ריכוז פרוטופלאסט ידוע.
  7. עם השלמת הפרוטוקול הקורא הצלחת, להסיר את הצלחת לאסוף את כל תאים מהונדסים עבור מעוקר או נהלי דה-חִיוּן נוספים שנקבעו פרוטוקולי בטיחות ביולוגיים ".

4. ניתוח מיקרוסקופי של טרנספורמציה

  1. הסר את הצלחת עם פרוטופלאסט טרנספורמציה (התוצר של אוטומט פרוטוקול 3, קובץ משלימה) ממלון 1 של מערכת רובוטית.
  2. לפנותעל מיקרוסקופ הפוכה, מצלמה, ואת מנורת פלורסנט.
  3. בחר את המטרה 10X עבור היין הראשי התמקדות פרוטופלאסט, להדליק את מנורת הלוגן, ולסגור את התריס על מנורת פלורסנט.
  4. צלחת טען גבי מערכת מיקרוסקופית ולהתמקד פרוטופלאסט באמצעות brightfield.
  5. לאחר התמקדות פרוטופלאסט, לכבות את נורת הלוגן ולפתוח את התריס על מנורת פלורסנט.
  6. בחר את מסנן CY3 / TRITC להגדיר להדמיה של חלבון pporRFP שהביע פרוטופלאסט המהונדס.
  7. סרוק היטב כל כדי לקבוע את מספר פרוטופלאסט להביע pporRFP סמן ניאון.
  8. חשב את יעילות השינוי כמספר הכולל של פרוטופלאסט המבטא את בסמן פלורסנטי המספר הכולל של פרוטופלאסט.
  9. איסוף כל צלחות המכילות תאים מהונדסים בשקיות בטיחות ביולוגיות שאושרו מעוקר או נהלי דה-חִיוּן נוספים שנקבעו פרוטוקולי בטיחות ביולוגיים ".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

במחקר הנוכחי, שיעור ההכפלה של BY-2 נע בין 14-18 שעות תלויות בטמפרטורה שבה התרבויות הודגרו, עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים של אורך מחזור התא ממוצע של 15 שעות. עם שיעור הכפלה זו, ביחס של 1: בידוד החל 100 שמש ליזום תרבויות, מה שמוביל תרבויות עם נפח תא ארוז (PCV) של 5...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול המתואר לעיל יאומת בהצלחה לבידוד פרוטופלאסט, ספירה, וטרנספורמציה באמצעות תרבית תאי השעית טבק BY-2; עם זאת, הפרוטוקול יכול בקלות להיות מורחב על כל תרבות השעית צמח. נכון לעכשיו, בידוד וטרנספורמציה פרוטופלאסט הושגה בצמחים רבים, כולל תירס (Zea Mays) 10, גזר

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרים.

Acknowledgements

This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Orbitor RS Microplate moverThermo Scientific
Bravo Liquid HandlerAgilent
Synergy H1 Multi-mode ReaderBioTek
MultiFlo FX Multi-mode DispenserBioTek
TeleshakeInheco3800048
CPAC Ultraflat Heater/coolerInheco7000190
Vworks Automation SoftwareAgilentSoftware used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum SoftwareThermo ScientificTask scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 SoftwareBiotekSoftware used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted MicroscopeOlympus
Zyla 3-Tap microscope cameraAndor
ET-CY3/TRITC Filter SetChroma Technology Corp49004
Rohament CLAB Enzymessample bottlelow-cost cellulase
Rohapect UFAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase
Rohapect 10LAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal MediumPhytotechnology LaboratoriesL689
2,4-dichlorophenoxyacetic acidPhytotechnology LaboratoriesD295
propidium iodideSigma AldrichP4170
Poly(ethylene glycol) 4000Sigma Aldrich95904-250G-FFormerly Fluka PEG
Propidium IodideFisher Scientific25535-16-4Acros Organics
CaCl2Sigma AldrichC7902-1KG
Sodium AcetateFisher ScientificBP333-500
MannitolSigma AldrichM1902-1KG
SucroseFisher ScientificS5-3
KH2PO4Fisher ScientificAC424205000
KOHSigma AldrichP1767
Gelzan CMSigma AldrichG1910-250G
6-well plateThermo Scientific103184
96-well 1.2 ml deep well plateThermo ScientificAB-0564
96 well optical bottom plateThermo Scientific165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tipsThermo Scientific9405 163
NaClFisher ScientificBP358-10
KClSigma AldrichP4504-1KG
MESFisher ScientificAC17259-5000
MgCl2Fisher ScientificM33-500

References

  1. Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
  2. Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
  3. Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
  4. Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
  5. Marco, F., et al. Plant Biology and Biotechnology. , Springer. 579-609 (2015).
  6. Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
  7. Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
  8. Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
  9. Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327(2014).
  10. Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
  11. Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
  12. Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13(2006).
  13. Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
  14. Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
  15. Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
  16. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  17. Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
  18. Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
  19. Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
  20. Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
  21. Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
  22. Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
  23. Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
  24. Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
  25. de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
  26. Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510(2013).
  27. Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
  28. Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
  29. Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
  30. Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37(2014).
  31. Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680(2008).
  32. Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
  33. Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
  34. Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
  35. Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831(2014).
  36. Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
  37. Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
  38. Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
  39. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
  40. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
  41. Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
  42. Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
  43. De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

115

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved