איתור מולקולרית ראפיד והבחנה א נגיפי שפעת A ו- B

Summary

אנו מתארים assay מהיר, מולקולרי מבוסס השפעת A ו- B. שפעת assay מזהה כל מטרה בתוך 15 דקות על ידי העסקת הגברת בידוד תרמית עם פריימרים ספציפי שפעת ואחריו איתור יעד עם בדיקות משואה מולקולריות. שפעת A ו- B assay הוא ידידותי למשתמש ונזקק ידות על מינימאליות זמן לבצע.

Abstract

שפעת היא מחלה נשימתית מדבקת הנגרמת על ידי נגיפי שפעת A ו- B בבני אדם וגורמת כמות משמעותית של תחלואה ותמותה מדי שנה. שפעת A ו- B assay היה מבחן השפעת מהירה מולקולרית CLIA-ויתרו הזמין הראשון. שפעת A ו- B הבדיקה פועלת על ידי העסקת הגברת בידוד תרמית עם פריימרים ספציפי שפעת ואחריו איתור יעד עם בדיקות משואה מולקולריות. הנה, את הביצועים של השפעת A ו- B assay על קפוא, בארכיון ספוגית אף ולוע (NPS) דגימות מאוחסנות במדיום תחבורת ויראלי (VTM) הושוו assay לוח נשימה.

המופע של assay שפעת A ו- B הוערך על ידי השוואת התוצאות למודל התייחסות לוח הנשימה. רגישות וירוס הכולל שפעת הייתה 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) ואת סגוליות 86.9% (CI, 71.0-100). עבור בדיקות B נגיף השפעת, הרגישות והסגוליות עמדו 90.2% (CI, 68.5-100) ו 98.8% (CI, 68.5-100), בהתאמה.

מערכת זו יש את היתרון של זמן בדיקה קצר משמעותי מאשר כל assay מולקולרית אחרת קיימים, ואת ההליך פשוט, ללא פיפטה פועלת על משולבים במלואם, סגור, מערכת-טביעת רגל קטנה. בסך הכל, שפעת A ו- B assay העריכו במחקר זה יש פוטנציאל לשמש כמבחן אבחון שפעת מהירה בנקודת הטיפול.

Introduction

נגיף שפעת לגרום כמות משמעותית של תחלואה ותמותה מדי שנה ^{1, 2, 3.} שפעת מסובכת מאופיינת בתסמינים חוקתיים נשימה כגון חום, כאבי שרירים, כאבי ראש, ואת לא פרודוקטיביים שיעול ^{4, 5.} מבוגרים יחידים, ילדים צעירים, בחולים מדוכאי חיסון, וחולים עם מחלות רקע שבבסיס נמצאים בסיכון גבוה יותר לסיבוכים רציניים כמו דלקת ריאות, דלקת שריר הלב, מחלת מערכת העצבים המרכזית, או מוות ^{6, 7.}

זיהום שפעת הוא ייחודי מפני וירוסים נשימה אחרים כי הממשל הפקודה של טיפול אנטי-ויראלי בתוך 48 שעות מהופעת התסמינים יכולים להפחית את חומרת המחלה, אורך ^8. זיהוי מהיר של שפעת כבר גםמפחית את השימוש באנטיביוטיקה מיותרת ^{9, 10.} יתר על כן, חולים מאושפזים עם זיהומי שפעת יש להציב בחדרים מבודדים עם אמצעי זהירות בקרת הזיהום מתאים. עם זאת, מחלות בדרכי נשימה הנגרמות על ידי וירוסים שאינם שפעת יכולות להיות קשות קליני להבחין משפעת. מסיבה זו, בדיקות אבחון מהירות ומדויקות לשפעת חשובה מאוד לניהול מטופל קליני.

מבחנים קיימים מספר לאיתור וזיהוי של נגיפי שפעת. בדיקות לגילוי מהיר אנטיגן שפעת (RIDTs) נמצאים בשימוש נרחב בפרקטיקה הקלינית כבדיקות Point-of-care כי הם פשוט לשימוש לספק תוצאות תוך 15 עד 30 דקות ^{11, 12;} עם זאת, הרגישויות שלהם להשתנות משמעותית (10-80%) בהתאם ליצרן ואת האוכלוסייה נבדקת, ואת סוג שפעת subty^{13 PE, 14, 15.} מבחני קרינה ישירים (DFAs) לספק רגישויות מעולות על RIDTs, אבל הפעם העיבוד גדול (~ 3 שעות) וחייב להסתיים עד וטכנולוגים מיומנים ^{16, 17.} תרבות ויראלי כבר את תקן הזהב לאבחון שפעת ושיפרה רגישות מעל שניהם RIDTs ו DFAs ^18. עם זאת, תרבות ויראלי שפעת יכול לקחת בין 2-14 ד להשלים, הולכת ופוחתת השירות שלה בסיוע וניהול החולה ^19. לבסוף, בדיקות הגברת חומצות גרעין (NAAT) החליפו טכניקות תרבות כתקן הזהב החדש באבחון שפעת. NAAT נחשבת כבעלות רגישות הגדולה לאיתור שפעת בעוד כמה שעות. עם זאת, NAAT הם המבחנים היקרים ביותר ודורש ציוד וטכנולוגים מיוחדים כדי לבצע ⁵ , ^{20, 21, 22, 23, 24, 25.}

שפעת assay A ו- B המתואר כאן הוא מבחן השפעת המהיר המולקולרי CLIA-וייתר הראשון שכבר זמין. assay זה עובד על ידי העסקת תגובת הגברה שסחב Endonuclease (NEAR) המשתמשת הגברת בידוד תרמית עם פריימרים ספציפי שפעת ואחריו איתור יעד עם בדיקות משואה מולקולריות. assay זה מבדיל שפעת A מ- B, דורש 2 דקות כדי להגדיר ולעבד דגימה אחת, ודורש בסך הכל 15 דקות כדי להשלים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור assay שפעת A & B. בנוסף, אנו מספקים נתונים לדוגמה להגדיר השוואת הביצועים של שפעת A ו- B assay על ספוגית האף והלוע בארכיון (NPS) דוגמאות טיפוסיות מאוחסן במדיום התחבורה ויראלי (VTM) למשנהו assay לוח הפתוגן הנשימה.

Protocol

מסר אתיקה: שימוש שמאל מעל דגימות קליניות יאושר והוא פועל בהתאם להנחיות של דירקטוריון הסקירה המוסדי במרכז לחקר סרטן קטרינג סלואן הזיכרון.

1. לפני הפעלת Assay

הערה: השפעת A ו- B assay מאושר דגימות ספוגית אף ולוע ועבור מטליות אף ולוע מאוחסנות תקשורת תחבורת ויראלי. מטליות כלולות בערכה ויש להשתמש בם עבור ביצועים אופטימליים. עם זאת, זהורית, קצף, נהר מטליות או ספוגיות אף פוליאסטר יכולות לשמש גם כדי לאסוף דגימות ספוגית אף.

1. כדי לאסוף דגימת אף ספוגית, הכנס את הספוגית לתוך הנחיר כי יש ניקוז הבולט ביותר או כי הוא הכי צפוף. עם סיבוב עדין, לדחוף את הספוגית לתוך הנחיר עד ההתנגדות הוא פגשה לסובב מספר פעמים כנגד קיר האף לפני ההסרה לאט מהנחיר. אחסן את מטליות ו להסיעם בקבוקונים המכילים 3 מ"ל של התקשורת התחבורה ויראלי (VTM).
   הערה: תשומת לב קפדנית approprאוסף הדגימה iate חייב להתפרש אוסף הדגימה לקוי עשוי להניב תוצאות שגויות.
   הערה: דגימות ספוגיות צריכים להיבדק בהקדם האפשרי לאחר איסוף. עם זאת, הם עשויים להיות מאוחסנים בטמפרטורת חדר למשך עד שעה 2 או בקירור ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך עד 24 שעות אם בדיקות אינן זמינות מייד. טרי דגימות שנאספו הם אידיאליים עבור ביצועים במבחן אופטימליים. טיפול מדגם לא נכון, אחסון, ו / או הובלה עשוי להניב תוצאות שגויות.
   הערה: כאמצעי זהירות, אנשי ביצוע בדיקה זו צריכים להתייחס לכל הדגימות בפוטנציה זיהומיות שמירה על הנחיות בטיחות אוניברסלית בעת טיפול דגימות.
2. תביאו כל הדגימות לטמפרטורת החדר לפני הבדיקה.
   הערה: כל מרכיבי הבדיקה מיועדים לשימוש יחיד בלבד ולא אמור לשמש לביצוע בדיקות מרובות. אין לערבב מרכיבי ערכת ממספרים הרבה שונים. אין להשתמש ריאגנטים ערכה מעבר לתאריך התפוגה שלהם.
3. תביא את מקלט המדגם הכחול Rooטמפרטורה מ לפני הבדיקה. בסיס המבחן הכתום ניתן לבדוק ללא הצורך לחמם לטמפרטורת חדר.
4. השאירו את כל פיסות הבדיקה בתוך האריזה רדיד עד מיד לפני השימוש. הפעל את המכשיר על ידי לחיצה על לחצן ההפעלה בצד של המכשיר. הזן את מזהה המשתמש ולחץ על 'אישור'.

2. הרצת מבחן

1. כדי להתחיל בתהליך הבדיקה, לגעת 'הפעלה נסיונית "במסך המכשיר. הזן את מזהה המטופל באמצעות המקלדת שעל המסך או סורק ברקוד ולחץ על 'אישור'. פתח את המכסה והכנס את בסיס מבחן אורנג לתוך מחזיק בסיס מבחן אורנג '.
2. אשר שהמבחן הנכון מוצג על המסך ולחץ על 'אישור'. הכנס את מקלט המדגם הכחול לתוך החזיק מקלט מדגם הכחול.
   הערה: אין לפתוח את השפופרת מדגם לפני הצבת המכשיר זה ימנע למאגר elution מלהגיע טמפרטורת ההפעלה הנכונה ועלול להשפיע על הביצועים במבחן.
3. חכו מקלט מדגם להתחמם. כאשר תתבקש על ידי המכשיר, להסיר את החותם בנייר כסף ומניחים ספוגית החולה להיבדק לתוך השפופרת המדגם.
   הערה: בעת הסרת הרדיד, הנח שתי אצבעות על שפת הכונס לדוגמא כדי לוודא שהוא נשאר במקום.
4. במרץ לערבב את הספוגית בנוזל במשך 10 שניות, לחיצה על הראש הספוגי כנגד צד המקבל מדגם כפי שאתה לערבב אותו כדי לעזור לסלק את הדגימה מן הספוגית. 'אישור' לחץ כדי להמשיך. אם מטליות בדיקות מאוחסנות במדיום תחבורת ויראלי, מערבולת VTM במשך 10 שניות ולאחר מכן להוסיף 200 μl למקלט המדגם.
5. לחץ על מחסנית ההעברה הלבנה לתוך שפופרת המדגם הכחולה. המשך ללחוץ על המקלט מדגם עד שהחיווי הכתום עולה.
6. רם ולאחר מכן חבר את מחסנית ההעברה לבסיס הבדיקה. שים את המחוון הכתום יורד פעם העברה המחסנית מחוברת כהלכה. לסגור את המכסה ואל תפתח עד "מבחן השלם"מופיעה הודעה על המסך.

3. בקרת איכות

1. לגעת 'הפעלה QC Test' במסך הבית. בחר את פעולת QC שיופעל. אשר את סוג הבדיקה כדי להתאים מדגם QC שנועד לבדיקה על ידי נגיעה על 'אישור' ובעקבות על מסך כדי להשלים בדיקות.

4. פרשנות תוצאה

1. לאחר ריצת השלמת הבדיקה, לבחון את תוצאות הבדיקה המוצגת על המסך עם פרשנויות לנוכחות של השפעת A, B, תת ידוע. לקבלת תוצאות חוקיות לחזור על הבדיקה.

תחזוקה וניקיון 5.

1. נקו את המכשיר באזור הספסל שמסביב יומי עם אתנול 70% או פתרון אקונומיקה 10%. תרסיס לניקוי על מטלית לחה, נטול סיבים לניקוי. אין לשפוך הפתרונות ישירות על המכשיר.

תוצאות

במחקר זה, בארכיון דגימות NPS נאספו מאושפזים עם הצגת תסמינים דמויי שפעת במרכז הסרטן ממוריאל סלואן קטרינג (MSKCC) במהלך התפרצות שפעת בין 15 בדצמבר, 2012 ו -1 במארס 2013. דגימות NPS הוגשו 3 מ"ל של VTM ונבדק כחלק בפועל קליני שגרתי עם assay מולקולרי שמזהה פאנל של וירוסים...

Discussion

נגיפי שפעת גורמים משמעותיים עולמי של תחלואה ותמותה. אבחון מהיר ומדויק של שפעת הוא אחד המפתחות העיקריים לניהול התפרצויות שפעת בעונת נשימה. בדיקות אחרות מבוסס אנטיגן הן מהירות וקלות לביצוע; עם זאת, יש להם רגישויות נמוכות ^13. מצד השני, בדיקות מולקולריות מ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alere i Instrument	Alere	NAT-000 (Global), NAT-024 (US)
Alere i Influenza A & B 24 Test Kit	Alere	425-000 (Global), 425-024 (US)
Alere i Barcode Scanner	Alere	EQ001001
Alere Universal Printer	Alere	55115 (Global), alereiprinter (US)
200 µl precision pipette
200 µl disposable pipette tips
Viral transport medium	Remel	M4-RT