JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This protocol describes customizable surface functionalization of the desthiobiotin, streptavidin, and APTES system in order to isolate specific cell types of interest. In addition, this manuscript covers the applications, optimization, and verification of this process.

Abstract

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual nuances in expression from patient to patient. Current methodologies that try to separate cells to fill this niche result in disruption of physiological expression, making the separation technique useless as a diagnostic tool. In this protocol, we describe the functionalization and optimization of a surface for the cellular capture and release. This functionalized surface integrates biotinylated antibodies with a glass surface functionalized with an aminosilane (APTES), desthiobiotin and streptavidin. Cell release is facilitated through the introduction of biotin, allowing the recollection and purification of cells captured by the surface. This release is done through the targeting of the secondary moiety desthiobiotin, which results in a much more gentle release paradigm. This reduction in harsh reagents and shear forces reduces changes in cellular expression. The functionalized surface captures up to 80% of cells in a single cell mixture and has demonstrated 50% capture in a dual-cell mixture. Applications of this technology to xenografts and cancer separation studies are investigated. Quantification techniques for surface verification such as plate reader and ImageJ analyses are described as well.

Introduction

גישות הפרדת תא ספסל העליונות נוכחיות (למשל, תא מופעל קרינת מיון 1, דיסקציה מייקרו הלכידה ליזר 2, הפרדה חרוזה-מגנטי חיסוני 1) יכולה לקחת כמה שעות של הכנה ומיון. סולמות זמן גדולים אלה עלולים להשפיע על מידת תגובה שלהם והביטוי פיסיולוגי, וכתוצאה מכך ניתוחים שאינם נציג התגובה הפיזיולוגית 3. מערכות נדרשות שיכולה במהירות וביעילות לבודדת סוגי תאים מסוימים מבלי לשבש פני קרום תא-רמות הקולטן על מנת לשפר בידוד תא והעשרה עבור יישומים ביו. לכן, רציונל הגישה שלנו הוא לפתח גישה עדינה בידוד תא.

את "מעבדה על שבב" המושג מציע את ההבטחה של סדרי גודל יותר מהר (שעות ל-דקות) בידוד תא, ורוב לעתים קרובות כרוך לכידת תאים על גבי משטח ושחרור תאים או קונטה תאייםnts דרך 4,5 פיזי או בשיטות כימיות 6. למרות שגישות אלו מציעים כמה יתרונות כמו זיהוי ביטוי 7,8 חלבון, זיהוי ביטוי RNA 9-11, או אפילו מתן תאים במבחנה תרבות 12,13, רבים של טכניקות אלה לא יכול להיות מתורגם אבחון כגון אפיון קולטן התא עקב לסביבות הלא הפיזיולוגית שלהם. סוכני הרמת אנזימתי כגון collagenases יכול להשפיע גם על כמויות קולטן אלה 14,15, כלומר טכניקות כימות תא קולטן המשתמשות סוכני הרמה אלה לא יפיקו נתונים פיסיולוגיים מדויקים. תמוגה סלולרית מונעת בידול בין הקולטנים הילידים, ואלו הופנמו בעבר 16. פרוטוקול זה מתאר גישה מהירה ועדינה בידוד תא.

Protocol

ריאגנטים 1. ניקוי משטח הזכוכית ואת ההכנה

  1. מניחים משטח זכוכית מכונת פלזמה חמצן למשך 5 דקות בהספק 50% כדי לנקות אותו.
  2. הכן 2.5 מ"ל 2% מחדש (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) פתרון, על ידי הוספת 50 μl של APTES ו 2.45 מ"ל של אתנול צינור חרוטי.

2. APTES ו DSB Functionalization

  1. הוסף פתרון APTES אל המשטחים. פיפטה 150 μl לכל טוב עבור 8 צלחות היטב. פיפטה 100 μl לכל טוב עבור 24 צלחות היטב. פיפטה 1.1 מ"ל במשך 60 x 15 מ"מ מנות זכוכית. מכסה את המשטחים כדי למנוע התאדות חלוקה לא שווה של פתרון APTES. מניח את המשטחים על שייקר פלטפורמה למשך 50 דקות בטמפרטורת חדר, אשר יוצרת חלוקה שווה של שכבת APTES.
    הערה: APTES הוא aminosilane המהווה את השכבה הראשונה של פני השטח. אם אתם משתמשים שונים על פני שטח, heuristically לקבוע את עוצמת הקול של הפתרון הנדרש כדי לכסות את פני השטח.
  2. בחר את הטמפרטורה בתנור, ואילו המשטחים על שייקר: חום עד 55 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות במשך 8 צלחות היטב 24 צלחות היטב. זכוכית חומה רק מנות עד 90 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  3. יש לשטוף את המשטחים עם אתנול.
    1. נהל את כמות האתנול נדרשה על ידי הפניה מבוססת על המשטח המשמש. להוסיף 150 אתנול μl היטב כל עבור 8 צלחות היטב. להוסיף 125 אתנול μl היטב כל 24 צלחות היטב. להוסיף 1.1 מ"ל אתנול עבור כלים מזכוכית.
    2. יש לשטוף את המשטח על ידי הזרמה וציור הנוזל מנקודה קבועה כגון בפינת הבאר. החזק את פיפטה בזווית של כ- 70 מעלות כך הקצה אינו מכוון ישירות אל פני השטח. לשטוף פעמיים נוספות אתנול משתמש.
      הערה: אם כל אחד הצלחות גם תחתיות הזכוכית שום פלסטיק בם, לא לחמם אותם מעל 65 מעלות צלזיוס, כמו הפלסטיק יתחיל להמס עיוות.
  4. יבש עם 100% חנקן גז לוותר מטנק. מניח את המשטחים ב oVen.
  5. הכן 2.5 מ"ל של ד-desthiobiotin (DSB) פתרון על ידי שילוב של 1.5 מ"ג / מ"ל ​​DSB ב 37.5 μl של sulfoxide דימתיל (DMSO), ו -5 מ"ג / מ"ל ​​1-אתיל-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) ב 2462.5 μl של M 4-morpholinoethanesulfonic 0.1 מימה חומצה (MES) (pH 6) חיץ. ואז לשלב שני הפתרונות.
  6. הוסף 1 μl של mercaptoethanol 2-β, לאחר 15 דק ', אל הפתרון להרוות את התגובה בין DSB ו EDC. הסר APTES החם פונקציונלי משטחי זכוכית מהתנור. מתן 5-10 דקות עבור משטחי הזכוכית להתקרר.
  7. להוסיף MES חיץ פני השטח לשטוף, באמצעות כמויות מבוססות על פני השטח. להוסיף 150 MES μl חיץ היטב כל עבור 8 צלחות היטב. להוסיף 125 MES μl חיץ היטב כל 24 צלחות היטב. הוסף חוצץ 1.1 מ"ל MES עבור כלים מזכוכית.
  8. יש לשטוף לפני השטח על ידי הזרמת וציור הנוזל מנקודה קבועה כגון בפינת הבאר. החזק את פיפטה בזווית של כ- 70 מעלות כך הקצה אינו מכוון ישירותאל פני השטח. לשטוף פעמיים נוספות עם חיץ MES.
  9. החל פתרון DSB על המשטחים לאפשר להם לדגור. להוסיף 150 פתרון DSB μl לכל טוב עבור 8 צלחות היטב. הוספת 100 פתרון DSB μl לכל טוב עבור 24 צלחות היטב. להוסיף 1.1 מ"ל עבור פתרון DSB כלים מזכוכית.
  10. מניחים את משטחי זכוכית מכוסה DSB על מגבת נייר לחה בתוך צלחת פטרי. מכסים דגירה מקרר 4 ° C. עבור 18-24 שעות.

3. streptavidin Functionalization

  1. שטפו כל משטח זכוכית שלוש פעמים עם 1 מ"ל של 1.0x בופר פוספט (PBS). יש לשטוף לפני השטח על ידי הזרמת וציור הנוזל מנקודה קבועה כגון בפינת הבאר. החזק את פיפטה בזווית של כ- 70 מעלות כך הקצה אינו מכוון ישירות אל פני השטח. לדלל את streptavidin (SAV) הפתרון המניות 0.4 מ"ג / מ"ל ​​(מומלץ).
    הערה: PBS הוא שוה, כך שהוא יכול לשמש כמדיום דילול ושטיפה. PBS משמש כממיס עבור SAv, ולכן, לא ישפיע על היכולת של SAV להיקשר אל פני השטח.
  2. החל 0.4 מ"ג / מ"ל ​​של תמיסת SAV שווה על משטחים כך שכבה דקה של צורות בתחתית הכוס, לבחור את כמות פתרון המבוסס על פני השטח. במשך 8 צלחות היטב, להוסיף 150 μl 0.4 מ"ג / מ"ל ​​פתרון SAV לכל טוב. במשך 24 צלחות היטב, להוסיף 100 μl 0.4 מ"ג / מ"ל ​​פתרון SAV לכל טוב. לקבלת כלים מזכוכית, להוסיף 1.1 מ"ל 0.4 מ"ג / מ"ל ​​פתרון SAV.
  3. מכסים להזיז את הצלחות כדי בצלחת 14 ס"מ פטרי כדי לשמור על הלחות. דגירת צלחת פטרי במקרר למשך 18-24 שעות.
    הערה: זה חיוני כדי לנצל כרכים עקביים של APTES, DSB, ו SAV על כל משטח.
  4. שטפו כל משטח זכוכית שלוש פעמים עם 150 μl של PBS להסיר SAV. יש לשטוף לפני השטח על ידי הזרמת וציור הנוזל מנקודה קבועה כגון בפינת הבאר. החזק את פיפטה בזווית של כ- 70 מעלות כך הקצה אינו מכוון ישירות אל פני השטח.
  5. להרטיב מגבת נייר wה- i לא מיונן מים ומניחים את מגבת נייר שטוח 14 ס"מ צלחת פטרי סביב צלחות כדי לשמור על לחות במי הקידוחים. מכסים את צלחת פטרי המכילה את הבארות. דגירת צלחת פטרי במקרר 4 ° C בטיחות ביולוגי ברמת 1 (BSL-1) עד צורך.

לכיד ולשחרר Cell 4.

  1. התחל עם בקבוק T175 (ים) של תאים המיועדים הניסוי. לשאוב את התקשורת מן הבקבוק (ים). יש לשטוף היטב את התקשורת הנותרים עם 5 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר. לשאוב PBS מהבקבוק (ים).
  2. הוסף 10 מ"ל של סוכן הרמת אנזימטית, כגון פתרון התא דיסוציאציה, אל הבקבוק של תאי T-175. שים את הבקבוק בחממה במשך 6 דקות, כדי לאפשר הסרת התאים מהבקבוק.
  3. לאחר 6 דקות, להוסיף 10 מיליליטר של תמיסת המלח המאוזנת של קר האנק (HBSS; ראה רשימת חומרים) כדי להשבית את סוכן ההרמה. להוציא 20 μl של תאים לספור מספר התאים בתמיסה באמצעות hemacytometer.
    הערה: בהתאם funcהולאם משטחים השתמשו בניסוי ללכוד, את מספר תאי דרוש משתנה. לקבלה פונקציונלית 8 צלחות היטב, השתמש 300,000 תאים לכל טוב. עבור מנות כוס פונקציונליות, להשתמש 1.1 מיליון תאים. במשך 24 צלחות גם פונקציונליים, 125,000 תאים מומלצים. מידע נוסף על ספירת תאים נמצא במוסף.
  4. חזור על שלבים 4.1- 4.3 עבור בקבוק אחר של תאים, אם פחות תאים נוכחים מהדרוש לצורך הניסוי. שלב השעיות תא ותאי ספירה חוזר לקבל מספר כולל של תאים בתמיסה.
  5. ספין למטה השעית תא בצנטריפוגה ב XG 500 עבור 5 דקות ב 4 ° C כדי לקבל גלולה של תאים מרוכזים. מצא את הכמות המתאימה של HBSS להוסיף את ההשעיה התא כדי לקבל ריכוז של 1 x 10 6 תאים לכל מ"ל, ואז לשאוב supernatant מתאי הסתחרר למטה, ולהוסיף נפח מחושב. נפח זה יכול להיות מחושב באמצעות משוואות במוסף.
  6. עד פיפטה ומטה (triturate) כדי resuspend התאי דואר בתמיסה ולהפחית clumping הסלולר בתמיסה שעשויה להפחית מחייב נוגדנים. פיצול הפתרון הסלולרי לתוך שליטה נפרדת ופתרונות ניסיוניים. צפייה בקבצים משלימים עבור רכיבים וחישובים.
  7. מוסיף את נוגדני biotinylated לפתרונות תאי בהתאמה כמתואר קובץ המשלימה. דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C על מערבל הקצה על הקצה.
    הערה: עבור תאים MCF7GFP, 0.5 מ"ג / מ"ל ​​hIgG או 0.5 מ"ג / מ"ל ​​נוגדנים HLA-ABC המומלצים. עבור מקרופאגים RAW, 1 מ"ג / מ"ל ​​mCD11b המומלצים במחצית נפח כדי להסביר את ההבדלים דילול. עבור לתאי אנדותל האדם טבורי וריד (HUVECs), 0.5 מ"ג / מ"ל ​​hCD31 מומלץ.
  8. שטוף את משטח הזכוכית הפונקציונלית עם HBSS. לצורך ניסוי זה, צלחת היטב 8 מומלצת.
    1. להוסיף 150 μl HBSS היטב כל עבור 8 צלחות היטב. לשטוף פעמיים נוספות באמצעות HBSS. יש לשטוף לפני השטח על ידי הזרמת וציור הנוזל מנקודה קבועה כגון בפינת הבאר.החזק את פיפטה בזווית של כ- 70 מעלות כך הקצה אינו מכוון ישירות אל פני השטח. שמור על קור על 4 מעלות צלזיוס.
  9. להוסיף פתרונות תא אל הבארות ולהמתין 45 דקות עבור התאים כדי לדגור על קרח על שייקר. הפוך את הפתרון של ביוטין ב סטרילי HBSS באמצעות כרכים מחושב כמתואר במוסף.
  10. הסר את פתרון התא מבאר הזכוכית באמצעות HBSS.
    1. בעדינות פיפטה 150 μl HBSS לבאר כל אחד. ואז פיפטה את HBSS. יש לשטוף לפני השטח על ידי הזרמת וציור הנוזל מנקודה קבועה כגון בפינת הבאר. החזק את פיפטה בזווית של כ- 70 מעלות כך הקצה אינו מכוון ישירות אל פני השטח.
    2. חזור על עוד פעמיים. לאחר כביסה, להוסיף HBSS על הבארות כדי לשמור על התא רטוב.
  11. להוסיף 150 μl של פתרון ביוטין 20 מ"מ לכל מהדורה בהתאמה היטב, ולאחר מכן לחכות 20 דקות, כדי לאפשר תגובה.
  12. לזכור תאים שאינם דווקא כבולהים על ידי שטיפה עם HBSS כאמור לעיל, ולאחר מכן, אם באמצעות תאים שכותרתו fluorescently, להמשיך קרינת תמונת התאים. כמו כן תמונה חיה תאים בבקבוק (כביקורת, להשוות עם התאים היטב). אם באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוקים (GFP) תאים transfected, העירור יהיה 470 ננומטר, ואת הפליטה תהיה 515 ננומטר.

5. אופטימיזציה נוגדן: טיטרציה נוגדן

  1. בגין על ידי הרמת תאים מהבקבוק T75 או T175 כמוסבר בשלב 4.1- 4.3.
    הערה: כרכים אלה מכוילים עבור 24 צלחות היטב, אך ניתן לשנות כדי להתאים לכל משטחים פונקציונלי זכוכית באמצעות בדיקות האוריסטי. טיטרציה נוגדן נציג מוצגת באיור 1.
  2. ספירת תאים באמצעות hemacytometer, ולאחר מכן לסובב את פתרון תא צינור חרוטי ב XG 500 עבור 5 דקות ב 4 ° C. מחדש תאים 1 מיליון תאים לכל מ"ל, באמצעות חישובים המתוארים במוסף.
  3. פיצול 1 מ 'תאי illion לכל פתרון מיליליטר לשישה פתרונות שונים של 500 μl צינורות צנטריפוגות שונים עבור הנוגדן (AB) פתרונות.
    1. לדלל את הפתרון המניות נוגדן עד 10 מיקרוגרם / מ"ל, 1 מיקרוגרם / מ"ל, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. צור בקרות באמצעות 100 μl של Stain הצפה (PBS + 1% נתרן יזיד + 1% BSA), ו -500 μl של תאים על הבקרה ללא Ab בו. על הבקרה הריקה (אין Ab ולא תאים), להשתמש בפתרון של 300 μl PBS.
      הערה: זהירות: אזיד הנתרן הוא רעיל מאוד, נפץ, בזהירות רבה יש לנקוט בעת השימוש בו. יש להתייעץ עם גיליון נתוני בטיחות חומרים (MSDS) והשתמש בציוד הבטיחות המתאים.
  4. שלב ו דגירה הפתרונות Ab עם פתרונות סלולריים במיקסר הקצה על הקצה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. יש לשטוף את הצלחות גם 24 הפונקציונליות עם שלוש פעמים HBSS. יש לשטוף את המשטח על ידי הזרמה וציור הנוזל מנקודה קבועה כגון בפינת הבאר. החזק את pipette בזווית של כ- 70 מעלות כך הקצה אינו מכוון ישירות אל פני השטח.
  5. μl Aliquot 125 של כל פתרון מדגם לתוך APTES המתאים, DSB, ו SAV פונקציונליות היטב. דגירה על 4 מעלות צלזיוס או על קרח למשך 45 דקות על משטח הזכוכית. יש לשטוף את המשטח עם HBSS שלוש פעמים כדי להסיר תאים מצורפים שאינו במיוחד. יש לשטוף לפני השטח על ידי הזרמת וציור הנוזל מנקודה קבועה כגון בפינת הבאר. החזק את פיפטה בזווית של כ- 70 מעלות כך הקצה אינו מכוון ישירות אל פני השטח. אין לשטוף בשורה התחתונה, כמו אלה הם בקרות.
  6. להוסיף 150 μl של HBSS לכל נשטף היטב, לשים 24 הצלחות היטב על קרח, ולאחר מכן להשתמש בקורא צלחת למדוד קרינה של תאי GFP (עירור 485 ננומטר / פליטה 528 ננומטר).

6. אופטימיזציה נייד: טיטרציה נייד

  1. הרם את התאים כאמור צעדים 4.1 -4.3.
  2. ספירת תאים באמצעות hemacytometer. ספין למטה תאים כךlution בצינור חרוטים ב XG 500 עבור 5 דקות ב 4 ° C. מחדש תאים 1 מיליון תאים לכל מ"ל.
    הערה: מידע נוסף על שימוש hemacytometer ניתן למצוא במוסף.
  3. פיפטה 1.6 מ"ל מפתרון התא עבור המניה 1.6 מיליון תאים ומכניסים צינור חרוטי. פיפטה 800 μl של תאים מפתרון התא עבור מניות 800,000 תאים ומכניס צינור חרוטים. פיפטה 80 μl ממלאי התא עבור מניות 80,000 תאים ומכניסים צינור חרוטים. פיפטה 8 μl ממלאי התא עבור מניות 8,000 תאים ומכניסים צינור חרוטים.
    הערה: ריכוזים ניתנים לכל 8 מדידות הצלחת היטב, לשכפל לפי הצורך. דוגמה של פלט צלחת מוצג באיור 2.
  4. קח את ארבעת פתרונות מניות ספין בצנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. Re- להשעות את כל פתרונות מניות ב 400 μl של HBSS.
  5. להוסיף 1.6 μl של 100 נוגדן ng / ml למלאי 1.6 מיליון תאים, 0.8 μl למלאי 800,000 תאים, ו -0.5 μl לכל מניות אחרות. דגירה נוגדנים במשך 30 דקות במיקסר הקצה על הקצה למשך 30 דקות ב 4 ° C.. שטוף את משטח זכוכית הפונקציונלית עם שלוש פעמים HBSS.
    הערה: הצלחת גם פונקציונלי 8 מומלצת כימות מיקרוסקופיה, בעוד 24 את הצלחת היטב הפונקציונלית מומלצת כימות קורא צלחת. ריכוז נוגדן עבור 8,000 תא מניות היה לא מצטמצם כדי לאפשר את הגורם המגביל של המשטח הלכיד לא להיות חוסר הנוגדנים בתמיסה, אלא את המאפיינים הלכידים של פני השטח.
  6. החל 150 μl של פתרונות מדגם היטב כל אחד. החל את המניה 1.6 מיליון התא בעמודה הראשונה של בארות משמאל. החל את המניות 800,000 התא בעמודה השנייה משמאל. החל את המניות 80,000 התא בעמודה השלישית משמאל. לבסוף להחיל את מניית 8,000 התא בעמודה האחרונה. דגירה במשך 45 דקות ב 4 ° C על שייקר.
    הערה: 1.6 מיליוןמניית התא ממשמשת את הריכוז הגבוה ביותר להיבדק, והוא הכמות כפולה של תאים המשמשת בדרך כלל בניסויי הפרדת תא (600,000 תאים לכל היטב) מניית תא 800,000 משמשת הבקרה של הניסוי כפי שהוא ריכוז הסלולר הטיפוסי המשמש בניסויי הפרדת תא (3,000,000 תאים לכל היטב). מניית התא 80,000 משמשת דילול פי עשרה כדי לבדוק ריכוזים נמוכים עבור לכידת הסלולר (30,000 תאים לכל היטב). מניית התא 8,000 משמשת דילול פי מאה להשתמש כבדיקה על מנת לבדוק את הגבול התחתון של פרדה הסלולר (3,000 תאים לכל טוב).
  7. לשטוף עם שלוש פעמים HBSS. יש לשטוף לפני השטח על ידי הזרמת וציור הנוזל מנקודה קבועה כגון בפינת הבאר. החזק את פיפטה בזווית של כ- 70 מעלות כך הקצה אינו מכוון ישירות אל פני השטח. לאסוף את כל השטיפות.
  8. תמונה התאים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אם באמצעות 8 צלחות היטב, לקחת תמונות של כל surהפנים, ולהחיל 150 μl ביוטין לכל משטח עבור שעה אחת ב 4 ° C על שייקר. לאחר שעה, לשטוף בארות שחרור ביוטין עם 3 פעמים HBSS כמו קודם. לאסוף את כל השטיפות מבארות לספירה עם hemocytometer ותמונת בארות השחרור.
  9. החל 150 μl של 20 מ"מ פתרון ביוטין עודף לנכס בארות שחרור ביוטין עבור שעה 1, אם באמצעות 24 צלחות היטב, ולאחר מכן לשטוף אותם בארות 3 פעמים עם HBSS. לכמת 24 צלחות היטב באמצעות קורא צלחת. השתמש hemacytometer לספור תאים מכל שוטף גם אסף.

ניתוח תמונה 7.

הערה: חבילת תוכנת פיג'י (http://fiji.sc/Fiji) מומלצת לניתוח תמונה. בתחילה, התמונות הוסבו תמונה בגוונים אפורה, ולאחר מכן את הבהירות / ניגודיות שונו כדי להוציא מהם את התאים.

  1. לטעון את התמונה, ולהמיר לגווני אפור ידי לחיצה על כרטיסיית התמונה מכן גלילה למטה כדי "סוג" ולאחר מכן לחיצה על4; 8 ביט ".
  2. הגדל את הניגודיות של התמונה על ידי לחיצה על כרטיסיית תמונה ולאחר מכן גלילה כדי "להתאים". לחץ על "בהירות והניגודיות", ולאחר מכן להשתמש בפסי הגלילה על מנת להפוך את התאים להתבלט. אם באמצעות תמונות קרינה, להפוך את התמונות כדי להפוך את התאים מוגדרים יותר.
  3. טען תוסף על ImageJ בשם ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) כדי לנתח את התמונות.
  4. להרחיב ITCN. כאשר תיבת דו-שיח, המנחה את המשתמש עם מספר פרמטרים כדי להעריך את גודל התא, להגדיר את רוחב מינימלי של התא של הריבית הראשונה. לחץ על האפשרות "זיהוי פיקס האפל" אם התמונה ניאון התאים חשוכים.
  5. הגדר את ערך הסף 2 בתחילה, ולאחר מכן ללחוץ על כפתור "רוזן". גרסה נספרת חדש של התמונה תופיע עם נקודות אדומות המגדירה שבו תאים נספרו.
  6. התאם את פרמטר הסף ורוחב כדי לקבל נתונים סלולריים מדויקים יותר על ידי defining בגודל של "תא". הערה: מספר תאים נספר יהיה בתיבת דו-שיח בצד ימין. פרמטרי שינוי ינתנו מספר שונה של תאים נספרו.
  7. המשך איטרציות הפרמטרים סף ורוחב עד אומדן טוב הוא הגיע למספר תאים.

תוצאות

שימוש בפרוטוקול זה אנו מראים ללכוד תאים (איור 3 א) ושחרור תא (איור 3 ג) של תאי MCF7GFP וכן בקרות תא חיות (איור 4). אנחנו כמתנו את ללכוד תאים כמו 60% ו -80% שוחררו (איור 3 ג). כאשר הרחבנו את הגישה הזאת כדי תערובת של מקרופאגים RAW 264....

Discussion

שיפורים בטכניקות בידוד תא מקדמים מחקרים מדעיים ביחסי מבנה-תפקוד במדעי המוח 18, גזע תכנות תא בביולוגיה רגנרטיבית, ואיתות angiogenic בביולוגיה וסקולרית 19. ואכן, 20 תרבית תאים ראשונית (למשל, HUVECs) בביולוגית וסקולרית נעשה בעיקר באמצעות השימוש בטכניקות ביד?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank the American Cancer Society, Illinois Division (282802) and the National Science Foundation CBET (1512598) for funding support. We also would like to thank Dr. Dianwen Zhang from the University of Illinois Beckman Institute for microscopy training. Finally, we would like to thank Jared Weddell, Stacie Chen, and Spencer Mamer for insightful discussions.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)Acros Organics919-30-2Used to make 2% APTES solution
Plasma Cleaner PicoDienerModel 1Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass
d-Desthiobiotin (DSB)SigmaD20655Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface. 
dimethyl sulfoxide (DMSO)British Drug Houses (BDH)BDH1115-1LPDissolves the DSB into solution
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)Thermo-Scientific5g: 22980
25g: 22981		Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface.
uncoated 8-well culture slideBD FalconCase of 24: 354118
Case of 96: 354108		Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments
Glass bottom 24-well platesMatTekP24G-0-13-FUsed in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments
MercaptoethanolScience Lab60-24-2Used to quench reaction between EDC and DSB
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate
(MES Hydrate 99%)		Fisher ScientificAC172590250Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction
Precision OvenThermo Scientific11-475-153Used in curing of PDMS and APTES layer.
Titramax 1000 ShakerHeidolph13-889-420Used to ensure even distribution of APTES on surfaces.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg]Proteo Chem9013-20-1Biotin-binding protein. May cause irritation.
5 cm Glass DishFisher Scientific08748AUsed in HUVEC studies as well as future profiling studies.
14 cm Petri Dish with CoverSigma-AldrichZ717231Used to hold samples being functionalized and transport them.
MCF7-GFP cellsCell BiolabsAKR211Stored in liquid nitrogen
RAW264.7 mouse macrophagesATCCTIB-71Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen.
TrypLELife Technologies12605036Stored in 100 ml at room temperature
Dulbecco’s modified Eagle mediumCell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC50003PCSupplier: Corning
Nonessential amino acidsCell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC25-025-CIAlready added into DMEM by facility. Supplier: Corning.
Cell scraperFisher Scientific12-565-58Small 23 cm 50 pack
Cell Dissociation SolutionCorningMT-25-056CIUsed to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments
HemacytometerHausser02-671-54Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity.
BiotinAmresco58-85-5Used to release cells from surface.
HBSSCreated from RecipeN/AUsed to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate.
HLA-ABC AntibodyBioLegend311402Antibody used to capture MCF7gfp cells
hIgG AntibodyBioLegendHP6017Antibody used to capture MCF7gfp cells
MCF7 GFP cellsCell BiolabsAKR-211Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein.
Assorted ConicalsThermo-Scientific15mL: 12-565-26850/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots.
Mini-Tube Rotators (End over End Mixer)Fisher Scientific05-450-127Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix
Axiovert 200M (Fluorescence Microscope)ZeissN/AZeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope.
Zeba Desalting columnsThermo-ScientificPI-87770Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation KitThermo- ScientificUsed to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface
Plate ReaderBioTekSynergy HTX Multimode ReaderUsed to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments.

References

  1. Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage. Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).
  2. De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques. Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).
  3. Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation. Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).
  4. Cheung, L. S. L., et al. Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel. Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).
  5. Privorotskaya, N., et al. Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters. Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).
  6. Park, K., Akin, D., Bashir, R. Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array. Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).
  7. Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device. Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).
  8. Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays. Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).
  9. Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems. Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).
  10. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a. PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).
  11. Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  12. Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. >Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).
  13. Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells. Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).
  14. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors. Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).
  15. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle. PLoS One. 7 (9), e44791 (2012).
  16. Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. Determination of a "critical shear stress level" applied to adherent mammalian cells. Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).
  17. Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. Secondary anchor targeted cell release. Biotechnol. Bioeng. 112 (11), 2214-2227 (2015).
  18. Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol. Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
  19. Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia. Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).
  20. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  21. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts. Cancer Med. 3 (2), 225-244 (2014).
  22. BD Biosciences. . CD Marker Handbook: Human and Mouse. , (2010).
  23. Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnol. Bioeng. 104 (2), 360-370 (2009).
  24. Perritt, D., Wong, P., Macpherson, J. L., Henrichsen, K., Symonds, G., Pond, S. . Processing Blood. , (2014).
  25. Fukuda, S., Schmid-Schönbein, G. W. Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes. J. Leukoc. Biol. 72 (July), 133-139 (2002).
  26. dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival. J. Cell Sci. 125 (Pt 4), 831-843 (2012).
  27. Allard, W. J., et al. Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.". Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).
  28. Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
  29. Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor. Submiss. , (2016).
  30. Vasa, M., et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ. Res. 89 (1), E1-E7 (2001).
  31. Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).
  32. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey. Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).
  33. Wu, X., et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).
  34. Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling. J. Mater. Chem. B. 1, 6434 (2013).
  35. Hornes, E., Korsnes, L. . Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. , (1996).
  36. Naranbhai, V., et al. Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function. J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).
  37. Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces. Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Cancer Research115BioengineeringdesthiobiotinSAVfunctionalizationAPTESMCF7 GFPRAW 264 7

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved