Microfluidic מאגר Exchange להנדסת תאים ללא התערבות מיקרו / Nanoparticle

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של אסטרטגיית מיקרופלואידיקה מבוסס אינרציאלית חיץ החליפין לטהר תאים מהונדסים מיקרו / ננו-חלקיקים עם דלדול יעיל של חלקיקים מאוגד.

Abstract

תאים הנדסה עם מיקרו / חלקיקי ננו פעילים בעלי מרכיבים טעונים (NPS) הופך פופולארי יותר ויותר בשיטה כדי לשפר תכונות טיפוליות הילידים, לאפשר הדמיה ביו ולשלוט פנוטיפ התא. סוגיה קריטית עדיין התייחסה כראוי היא המספר המשמעותי של חלקיקים שנותרו מאוגד לאחר תיוג תא אשר לא ניתן להסיר בקלות על ידי צנטריפוגה קונבנציונלי. זה מוביל לעלייה רעשי רקע הדמיה ביו יכול להקנות ההשפעה הטרנספורמטיבית על תאי היעד הלא שכנות. בפרוטוקול זה, אנו מציגים אסטרטגיה חילופית חיץ מיקרופלואידיקה מבוסס אינרציאלית כפי שכונתה חלוקת זרימת דין (DFF) להפריד תאי שכותרתו ביעילות צירופים חינם באופן תפוקה גבוה. Microdevice הספירלה שפותח מסייע באיסוף רציף (> התאוששות תא 90%) של תאים מטוהרים (THP-1 ו MSCs) מרחפי פתרון חיץ חדש, תוך השגה> 95 דלדול% של צבע פלואורסצנטי מאוגד או צירופים טעונים לצבוע (silICA או PLGA). בשלב יחיד זה, אסטרטגית טיהור מבוססת תאי גודל מאפשרת קצב העברת נתוני עיבוד תא גבוה (10 ⁶ תאים / min) והוא שימושי מאוד עבור טיהור תא גדול בנפח של תאים מהונדסי מייקרו / ננו-חלקיקים כדי להשיג יישום קליני ללא התערבות.

Introduction

סוכן טעון מייקרו / חלקיקי הנדסת תאים על ידי (NPS) היא שיטה פשוטה, גנומית אינטגרציה נטולה, צדדי כדי לשפר יכולת bioimaging ומגביר / להשלים התכונות הטיפוליות המקוריות שלו ברפואת רגנרטיבית. ^1-3 שינויים סלולריים מושגות על ידי תיוג קרום או הציטופלסמה פלזמה עם ריכוז עודף של צירופים טעון סוכן להרוות את אתרי הקישור. עם זאת, החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא כמויות משמעותיות של חלקיקים מאוגד הנותרים בתמיסה לאחר תהליכי תיוג תא, אשר יכולים לבלבל זיהוי מדויק של תאים מהונדסים חלקיק או לסבך תוצאות טיפוליות. ^4,5 בנוסף, חשיפה צירופים המכילים טרנספורמטיבי סוכנים (גורמי גדילה, סטרואידים, וכו ') בריכוז גבוה יתר על מידה יכולים לגרום cytotoxicity וחשיפה שגויה עלולים לגרום לתוצאות בלתי צפויות על תאים שאינם יעד. אפילו נושאות חלקיקים המהווים of "ביולוגיים" חומרים [למשל, פולי (שיתוף גליקולית לקטית חומצה), PLGA] יכולים להסית תגובות תא חיסוניות חזקות בתנאים מסוימים גם כן. ⁶ זה מסוכן במיוחד אצל אנשים עם חסינות לקויה (למשל, דלקת מפרקים שגרוניות) אשר באופן פוטנציאלי עיכובים אישור nanoparticle מערכתי. ⁷ לכן, ההסרה ביותר של חלקיקים חינם לפני כניסתה של תאים מהונדסי חלקיקים הוא בעלת חשיבות רבה כדי למזער פרופיל רעיל ולהפחית חשיפה שגויה לחלקיקים טעוני סוכן in vivo.

צנטריפוגה שיפוע הקונבנציונלית משמשת לעתים קרובות כדי להפריד תאים מהונדסים מחלקיקים בחינם אבל הוא מייגע ומופעלת במצב יצווה. יתר על כן, מדגישה גזירה שחווה תאים במהלך צנטריפוגה במהירות גבוהה ואת המרכיבים של מדיום שיפוע צפיפות עשויה להתפשר על יושרת תא ו / או התנהגות תא שפעה. ⁸ מיקרופלואידיקה היא חלופה אטרקטיבית עם sevטכנולוגיות הפרדה eral כולל תזוזה לרוחב דטרמיניסטית (DLD) ^9, dieletrophoresis ^10,11 ו acoustophoresis ¹² פיתח להפרדת חלקיקים קטנים ויישומים חילופי חיץ. עם זאת, שיטות אלו סובלים תפוקה נמוכה (1-10 μl · דק ^{'- 1)} והם מועדים סתימת בעיות. פרדות Active כגון שיטות מבוססות dielectrophoresis דורשות גם הבדלים פנוטיפים תא dielectrophoretic מהותי או צעדי תיוג תא נוספים כדי להשיג פרדה. גישה מבטיחה יותר כרוכה מיקרופלואידיקה אינרציה - ההגירה לרוחב של חלקיקים או תאים ברחבי מייעל להתמקד בעמדות נבדלות בשל כוחות להרים דומיננטיים _(L F) בבית המספר ריינולדס גבוה (Re) ¹³ בשל תנאי הזרימה הגבוהה שלה ברזולוצית גודל מעולה. , שהוא נוצל לעתים קרובות להפרדה מבוססת תאים בגודל ^14,15 ויישומים חילופים חיץ. ^16-18 However, ביצועי חיץ חליפין נשארו עניים עם ~10-30% פתרון מזהם כמו התאים המופרדים בדרך כלל להישאר קרוב לגבול בין תמיסות בופר המקוריות וחדשני. ^16-18 יתרה מכך, חלוקת הגודל של תאי יעד צריכה להיות דומה כדי להשיג אינרציה מדויקת התמקדות והפרדה מפתרון החיץ המקורי שמהווה בעיה במיוחד בעיבוד של סוגי תאים הטרוגנית בגודל כגון בתאי גזע mesenchymal (MSCs). ¹⁹

פתחנו בעבר תא מיקרופלואידיקה אינרציה חדשה טכניקת מיון כינה הדין חלוקה זרימה (DFF) לבידוד תאים סרטניים במחזור (CTCs) ²⁰ וחיידקים ²¹ מדם כולו באמצעות מכשיר microchannel ספירלת 2-כניסה, 2-לשקע. בפרוטוקול הווידאו הזאת, נתאר את התהליך של THP-1 תיוג (שורת תאים monocytic חריפה האדם לוקמיה) תאים monocytic ההשעיה (~ 15 מיקרומטר) ו MSCs (10-30 מיקרומטר) עם calcein-lצירופי oaded, ואחריו ייצור ותפעול של microdevice ספירלת DFF עבור התאוששות יעילה של תאים שכותרתו והסרת צירופים מאוגדים. ²² אסטרטגיה לטיהור בצעד אחד זה מאפשרת התאוששות מתמשכת של השעיה שכותרתו תאים חסידים המרחפים פתרון חיץ טרי ללא צנטריפוגה. יתר על כן, הוא יכול לעבד עד 10 מיליון תאים · מיליליטר ^-1, צפיפות תאים מקובלים עבור יישומים ברפואה רגנרטיבית.

Protocol

1. חלקיקים (NPS) תיוג של בתאי גזע mesenchymal ומונוציטים

1. בתאי גזע mesenchymal התרבות (MSCs) במדיום של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ואנטיביוטיקה כדי ≥80% confluency לפני התיוג. באופן דומה, תרבות THP-1 תאים (ATCC) ברוזוול ממוריאל פארק המכון (RPMI) בינוני 1640 בתוספת 10% FBS כדי בצפיפות של ~ 10 ⁶ תאים / מ"ל.
2. צירופים סיליקה טען (~ 500 מיקרומטר) עם פתרון צבע calcein (200 מיקרומטר) באמצעות ערבוב בין לילה. לפברק AM PLGA-calcein (CAM) באמצעות פרוטוקול שתואר לעיל. ²²
   1. ממיסים 250 מיקרוגרם CAM ו -100 מ"ג PLGA (50:50) ב כלורופורם על 4 מעלות צלזיוס.
   2. צור צירופים אמולסיה יחיד באמצעות homogenizer במהירות גבוהה (13,600 XG, 60 שניות) בטמפרטורת החדר. לאדות את כלורופורם במנדף כימי (≥3 hr) לפני הגבייה באמצעות צנטריפוגה (3,400 XG במשך 5 דקות), שטיפה (Disti כפולהמים מילאו), להקפיא-ייבוש ואחסון ב- C -20 °.
3. דגירה CAM-PLGA צירופים (1 מ"ג) או צירופים סיליקה calcein (150 מיקרוגרם) בתמיסה 0.01% פולי- L- ליזין (PLL) בטמפרטורת החדר למשך 15 - 20 דקות.
4. צנטריפוגה ב 3,400 XG במשך 5 דקות כדי להסיר supernatant PLL עודף לפני resuspension צירופים ב 1 מ"ל של מדיום תרבות בהתאמה.
5. דגירה צירופים עם תאים (MSCs או THP-1, ~ 1 - 2 x 10 ⁶ תאים בסך הכל) למשך כ 24 שעות (מ"ג 0.1 · מ"ל ^-1 ריכוז תיוג).
6. לנתק ולאסוף את MSCs חסיד שכותרתו באמצעות 2 מ"ל של טריפסין 0.25% (5 דק ', 37 ° C) להרוות עם 6 מ"ל של DMEM. ספין למטה התאים ב (1,000 XG, 4 דק ') ו resuspend לריכוז של 10 ⁵ - 10 ⁶ תאים / מ"ל לעיבוד microfluidic. השתמש שכותרתו תאים THP-1 - ישירות (10 ⁵ 10 ⁶ תאים / מ"ל) לטיהור מיקרופלואידיקה.

2. הכנת התקן Microfluidic

1. ייצור מכשיר
   1. לפברק את מכשיר microfluidic הספירלה (500 מיקרומטר (w) x 115 מיקרומטר (ח)) עם polydimethylsiloxane (PDMS) מתוך ערכה מסחרית באמצעות צעדים ליתוגרפיה רכים רגילים. ²³
   2. מערבבים 30 גרם של prepolymer בסיס ו -3 G סוכן ריפוי ביסודיות בסירה במשקל. דה-גז התערובת בתוך תא ייבוש במשך 60 דקות כדי להסיר בועות אוויר.
   3. יוצקים את התערובת PDMS על עובש אמן פרוסות סיליקון בדוגמת עם העיצוב ערוץ ספירלה בקפידה עד לגובה של ~ 5 - 10 מ"מ.
   4. דה-גז התערובת בחלל ריק ייבוש למשך 60 דקות שוב כדי להסיר בועות אוויר. חזור על התהליך עד שכל הבועות בוטלו.
   5. לרפא את התערובת PDMS בתנור C 80 מעלות במשך שעה 2 עד PDMS מוגדר. ודא רקיק אינו מוטה במהלך ריפוי לקיים לגובה מכשיר קבוע.
   6. חותך את מכשיר ספירלת PDMS באמצעות אזמל מקלף בזהירות את לוח PDMS מתבנית האב.
   7. Trim את הקצוות של המכשיר עם אזמל כדי להבטיח משטח חלק מליטה.
   8. פאנץ שני חורים (1.5 מ"מ) עבור צריכת האוויר ושני חורים (1.5 מ"מ) עבור השקעים במכשיר PDMS באמצעות אגרופן ביופסיה 1.5 מ"מ.
   9. שטפו את המכשיר עם isopropanol (IPA) כדי להסיר כל פסולת ולייבש את המכשיר בתנור 80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   10. נקה את המשטח התחתון של המכשיר PDMS (עם תכונות ערוץ) באמצעות דבק.
   11. אחד נקי בצד של זכוכית שקופית (2 "על ידי 3") באמצעות דבק.
   12. בזהירות במקום ולחשוף את המשטחים הנקיים של מכשיר PDMS וחלק זכוכית בתא של שואב הפלזמה לייחד להם מקום לשאוב במשך 60 שניות. לאחר מכן, לעבור על כוח הפלזמה למקסימום ולהפחית את הלחץ הקאמרי עד לתא הופך ורוד בצבע.
       1. לחשוף את משטחי פלזמת אוויר עבור 60 שניות. פלזמה יוצר מינים תגובתי על פני השטח החשוף של PDMS וזכוכית המאפשרת מליטה חזק כאשר הם מובאים לזירת physicקשר אל. כבה את כוח הפלזמה לשחרר את הלחץ מן שואב הפלזמה כדי לאחזר את שקופית המכשיר וזכוכית.
   13. איגרות חוב מכשיר PDMS וזכוכית השקופיות יחד על ידי לחיצה על משטחי הפלזמה חשופות בחוזקה להבטיח כי אין בועות לכודות בין שני המשטחים.
   14. מחמם את המכשיר מלוכד באמצעות פלטה חשמלית נקבעה על 80 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי לחזק את המליטה.
2. מבצע ההתקנים
   1. חותך שתי חתיכות של צינורות (1.52 מ"מ OD) של ~ 15 - 20 סנטימטרים עבור מזרקי הכניסה ולצרף קצה מזרק (מד 23) בקצה אחד של כל צינורות.
   2. חותכים שתי חתיכות של צינורות (1.52 מ"מ OD) של ~ 5 - 10 ס"מ עבור שקעים ולצרף החורים לשקע של המכשיר PDMS.
   3. לפני לדגום ריצה, ידני ממשלה מכשירה עם מזרק המכיל אתנול 70% עד שהוא זורם מתוך הצינור לשקע. אפשר לשבת אתנול למשך 30 שניות עד 1 דקות כדי לעקר את המכשיר.
   4. טען 30 מ"ל של מסוננים(0.2 מיקרומטר נקבוביות) חיץ נדן (פוספט-בופר (PBS) עם 0.1% שור סרום אלבומין (BSA)) לתוך מזרק 60 מ"ל ומאובטח את המזרק על משאבת מזרק. הגדר את המשאבה את ההגדרות הנכונות (גודל מזרק: 60 מ"ל, נפח: 60,000 μl).
      הערה: התוספת של BSA כדי PBS היא למזער תאי תאי חייב הלא ספציפי מחייב בין תאים והתקן PDMS.
   5. טען 3 מיליליטר של תאים שכותרתו לתוך מזרק 3 מ"ל ומאובטח את המזרק על משאבת מזרק נפרדת. הגדר את המשאבה את ההגדרות הנכונות (גודל מזרק: 3 מ"ל, נפח: 3,000 μl).
   6. בדוק כי אין בועות אוויר לכודות המזרקים כדי להבטיח זרימה יציבה. הסר את כל בועות אוויר על ידי ולהוציא בעדינות כמה טיפות של נוזל מתוך הנחיר.
   7. חבר את טיפי מזרק כניסת צינורות אל המזרקים, ולהכניס אותם לתוך פתחי הכניסה בהתאמה של המכשיר (נדן ועל כניסת מדגם). ודא שאין בועות לאורך הצינורות.
   8. הר המכשירים על גבי הפוךמיקרוסקופ שלב בניגוד ed הדמיה בזמן אמת במהלך תהליך מיון התא.
   9. Secure מבחנה פסולת קטנה ושני 15 מיליליטר צינורות קרובה המכשיר על במת מיקרוסקופ באמצעות דבקים.
   10. מניח את tubings לשקע לתוך הכוס הפסולת.
   11. הגדר את יחס תזרים עבור מדגם נדן חיץ 1:10 ו להתחיל הן משאבות מזרק כדי להתחיל בתהליך המיון (דוגמה: 120 μl / min מזרק מדגם ו -1,200 μl / min מזרק נדן; מהירות זרימה בתעלות ~ 0.38 מ '/ שנייה ).
   12. הפעל את המכשיר עבור 1.5 דקות עבור קצב הזרימה כדי לייצב. זה יכול להיות מאושר על ידי נוכחות של תאים ממוקדים inertially ליד הקיר הפנימי הערוץ תחת בהיר שדה עם ניגודיות שלבו באמצעות מצלמה במהירות גבוהה (~ 5,000 - 10,000 מסגרות לשנייה (fps), זמן חשיפה: 10-50 μsec).
   13. מקם את tubings לשקע לתוך צינורות שונים כדי לאסוף את eluents משקע התא לשקע פסולת.

תוצאות

לאחר סימון התאים עם צירופי סוכן טעון הדמיה ביו לילה, התאים שכותרתו (המכיל חלקיקים חינם) נקצרים מטוהרים על ידי microdevice ספירלת DFF להסיר צירופים חופשיים (איור 1 א) יחיד שלב בתהליך. 2-הכניסה, microchannel ספירלת 2-לשקע הוא תוכנן על ידי תוכנת הנדסת microfabricated ...

Discussion

טכנולוגית טיהור תא DFF המתוארת כאן מאפשרת הפרדה מהירה ומתמשכת של תאים שכותרתו באופן תפוקה גבוה. גישת פרדה זו היא אידיאלית עבור נפח דגימה גדול או עיבוד מדגם ריכוז תא גבוה, והוא טוב יותר מאשר סינון מבוסס קרום קונבנציונלי אשר נוטה וסותם לאחר שימוש ממושך. באופן דומה, הפרדה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell lines & Media
Mesenchymal Stem Cells (MSCs)	Lonza	PT-2501
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Lonza	12-614F
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
THP-1 monocyte cells (THP-1)	ATCC	TIB-202
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media	Lonza	12-702F
Reagents & Materials
0.01% poly-L-lysine (PLL)	Sigma-Aldrich	P8920
3 ml Syringe	BD	302113	Syringe 3 ml Luer-Lock
60 ml Syringe	BD	309653	Syringe 60 ml Luer-Lock
Bovine Serum Albumin (BSA)	Biowest	P6154-100GR
Calcein, AM (CAM)	Life Technologies	C1430
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Isopropanol	Fisher Chemical	#P/7507/17	HPLC Grade 2.5 L
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Lonza	17-516Q/12
Plain Microscope Slides	Fisher Scientific	FIS#12-550D	75 x 25 x 1 mm3
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	SYLGARD® 184
Scotch tape	3M	21200702044	18 mm x 25 m
Silica NPs (∼200 μm)	Sigma-Aldrich	748161	Pore size 4 nm
Syringe Tip	JEC Technology	7018302	23 G 0.013 x 0.25
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies	25200-056
Tygon Tubing	Spectra-Teknik	06419-01	0.02 x 0.06" 100
Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50)	Sigma-Aldrich	P2191
Equipment
Biopsy punch	Harris Uni-Core	69036-15	1.50 mm
Dessicator	Scienceware	111/4 IN OD
High-speed Camera	Phantom	V9.1
Inverted phase-contrast microscope	Nikon	Eclipse Ti
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-002
Syringe Pump	Chemyx	CX Fusion 200