In vivo מודל השפעת בדיקה של היפוקסיה על גרורות של גידולים

Summary

This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.

Abstract

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm³. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.

Introduction

יואינג סרקומה (ES) היא גידול ממאיר אגרסיווי המשפיע על ילדים ובני נוער. ¹ הגידולים מתפתחים רקמות ועצמות רכות, בדרך כלל בגפיים. בעוד בנוכחות הגרורה הוא גורם מנבא שהלילי החזק ביותר יחיד לחולי ES, המנגנונים שבבסיס ההתפתחות שלהם עדיין אינם ברורים. היפוקסיה גידול ² הוא אחד הבודדים גורמים מעורבים התקדמות ES. בחולי ES, בנוכחות באזורים שאינם perfused בתוך רקמת הגידול קשורה לפרוגנוזה גרועה. ³ במבחנה, היפוקסיה מגביר הפולשנות של תאי גזע עובריים ומפעיל הביטוי של גנים פרו-גרורתי. ^4-6 עם זאת, על אף דבריו אלה של ראיות, אין הוכחה ישירה להתקדמות ES-induced היפוקסיה והתפשטות קיימת. יתר על כן, את המנגנונים שבאמצעותם היפוקסיה מחולל השפעות כאלה הן, לפי שעה, לא ידועים. לפיכך, יצרנו מודל in vivo כדי למלא את הפער בין הקיים בנתונים במבחנה obser קלינייםvations. מערכת מודל זה מאפשרת בדיקה ישירה של השפעות היפוקסיה על גידולים המתרחשים בסביבתם הטבעית, באמצעות תהודה מגנטית (MRI) כדי לעקוב אחר התקדמות גידול וגרור in vivo בשילוב עם ניתוחים פתולוגיים ומולקולריים vivo לשעבר (איור 1).

מאז אין מודל מהונדס הוקם של ES זמין כעת, מחקרי in vivo על תכונות גרורתי של גידולים אלה מסתמכים על זריקות של תאים אנושיים לעכברים בעלי דיכוי חיסוני. בעוד השימוש בבעלי חיים לקויים אימונולוגית שעלול להמעיט בהערכת ההשפעה של המערכת החיסונית על התקדמות המחלה, את היכולת להשתמש בתאים אנושיים מגבירה translatability של מחקרים כאלה. בין דגמי xenograft שונים, זריקות מערכתיות לתוך וריד זנב הם הקלים ביותר לביצוע, ובכל זאת היא להשמיט את השלבים הראשוניים של intravasation תאים הסרטני ולברוח מן האתר הראשי של צמיחה. ^7-12 מצד שני, orthoto pic xenografting, אשר כרוך זריקות של תאים סרטניים לתוך העצמות (עצם הירך, צלע) או שרירי, הוא יותר מאתגר מבחינה טכנית, אלא גם יותר ביולוגית רלוונטי סרטן אנושיים. עם זאת ^13-16, בעבר, את התחלואה הגבוהה הקשורים צמיחה מהירה של גידולים ראשוניים יש חייבתה לעתים קרובות המתת חסד של בעלי חיים לפני ההתפתחות גרורה. במחקר זה, אנחנו עובדים מודל הוקם בעבר של זריקות תא לתוך שריר הסובך ואחריו כריתה של הגידול הראשוני שהתקבל בשילוב עם ניטור אורך של התקדמות גרורתי ידי MRI. ^17,18 זריקות כאלה לתוך שריר סובך בסמיכות השוקה לאפשר את צמיחת גידול בשתי סביבות ES טבעיות - שרירים ועצמות - ולגרום גרורות מרוחקות למקומות בדרך כלל מושפעים בבני אדם. ¹⁸ ובכך, המודל הזה במדויק משחזר את התהליכים המתרחשים גרורתי בחולים ES במהלך התקדמות המחלה.

אוהל "> הלוקליזציה של גידולים ראשוניים של hindlimb הנמוך גם מקלה על השליטה המדויקת של אספקת הדם אל רקמת הגידול. קשירת עורק ירך (FAL) היא טכניקה מבוססת היטב מנוצלת במחקר אנגיוגנזה לחסום את זרימת דם לאזורים הדיסטלי של הרגל ולחקור כלי דם ברקמה בתגובה איסכמיה. ^19,20 חשוב לציין כי הירידה הראשונית בזרימת דם ואחריו reperfusion פתיחה ורקמות כלי בטחונות נצפו כ 3 ימים לאחר FAL. ²⁰ לפיכך, כאשר היא מבוצעת באיבר נושאות גידולים, מודל זה יוצר מחדש אירועים היפוקסיה / reperfusion הנמצא באופן טבעי גידולים שמתפתחים מהר ומאפשר הבריחה של תאים סרטניים עם גרורות עקב שיקום של זלוף אל hindlimb הנמוך באמצעות כלים בטחונות חדשות שנפתחו. ²¹ חשוב לציין, חייבת להתבצע בהליך זה כאשר גודל הגידול קטן מספיק כדי למנוע היפוקסיה מוגזם בגידולים מלאים (בדרך כלל בחלק כרך עגל נושאות גידוליםume של 150 - 250 מ"מ ^3), הבטחת הבדלים משמעותיים ברמות של היפוקסיה גידול בין מלא קבוצות שטופלו FAL.

בנוסף ניטור אורך של שפעת היפוקסיה על חביון ES ואת התדירות של גרורות, מודל זה מאפשר גם לאיסוף רקמות לבין ההתפתחות של שורות תאים חדשות משני גידולים וגרורים עיקריים. חשוב לציין, הוקמה עבודה קודמת כי שורות תאים שמקורם גרורות להפגין פוטנציאל גרורתי משופר על השבה לבעלי חיים, המציין כי הפצת גידול קשורה שינויים של קבע פנוטיפ התאים הסרטני, ובכך אימות השימוש של שורות תאים אלה להתחקות אחר התהליכים גרורתי. ¹⁸ קולקטיבי, המודלים האלה ניתן להשתמש כעת עבור ניתוחים גנטיים ומולקולריים הנדרש לזיהוי מסלולים גרורתי הנגרמת היפוקסיה.

כפי היפוקסיה הוא גורם פרו-גרורתי שיפור הממאיר של t השונהumors, המודל שלנו יכול לשמש כפלטפורמה לחקור את התפקיד של היפוקסיה ב סוגי גידולים אחרים המתפתחים באופן טבעי בגפיים, כגון אוסטאוסרקומה ו ראדומיוסרקומה. יתר על כן ^21-23, גישה דומה ניתן להחיל על ממאירויות גדל במקומות אנטומיים אחרים עם מסלול מוגדר היטב של אספקת דם. בסופו של דבר, המודל יכול להיות משונה השירות שלה להאריך עוד יותר, בהתאם לצרכי מחקר בודדים.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת ג'ורג'טאון ועדת שימוש.

1. תא הכנה עבור זריקות Orthotopic

1. לתאי גזע עובריים אנושיים תרבות בתנאים סטנדרטיים. השתמש כ צלחת תרבית תאים אחת 15 ס"מ לא יעלה על 70% confluency להזרקה 5 עכברים.
   הערה: במחקר זה, תאי SK-ES1 היו בתרבית הבינונית 5A של מקוי עם 15% עוברי שור סרום (FBS) על צלחות מצופות קולגן ותאי TC71 היו בתרבית RPMI עם 10% FBS ו -1% 4- (2-hydroxyethyl ) -1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES). שניהם התקשורת נוספו עם אנטיביוטיקה - פניצילין (100 יחידות / מ"ל), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל) ו fungizone (1 מיקרוגרם / מ"ל).
2. שוטפים את התאים ES עם בופר פוספט (PBS) ו trypsinize בנקודת המפגש 70% עם חומצה 0.25% טריפסין / ethylenediaminetetraacetic (EDTA) במשך 5 דקות.
3. הסרת תאי ES מהצלחת עם Medi תרבית תאיםa, ואז צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 200 XG בטמפרטורת החדר. Re- להשעות את בתאי גזע עובריים ב 10 מ"ל של קר PBS ולאחר מכן לספור את מספר התאים.
4. צנטריפוגה ES התאים למשך 5 דקות ב 200 XG בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן מחדש להשעות ב 2 x 10 ⁷ (SK-ES1) או 10 ⁷ (TC71) תאים לכל מ"ל בקור PBS. שמור את השעית התא הסופית על קרח בעת ביצוע זריקות.

2. הזרקת orthotopic של בתאי גזע עובריים לתוך הגסטרוקנמיוס שרירים

1. השתמש 4-6 בשבוע עכברים ישנים נקבת SCID / בז '.
2. כדי להזריק תאי גזע עובריים, בעדינות להחזיק את העכבר ולייצב רגל שמאל שלו בין האצבעות הרביעית והחמישית, חושף את הצד המדיאלי של hindlimb נמוך.
3. באמצעות מחט 28 G ½, להזריק 0.1 מ"ל של ההשעיה תא שהוכן קודם לכן שמכילה 2 x 10 ⁶ (SK-ES1) או 10 ⁶ (TC71) בתאי גזע עובריים לתוך שריר הסובך (איור 2 א).
   הערה: למרות ומקסימלית עבור inj שריריתections הוא בדרך כלל 0.05 מ"ל, עבור פרוצדורה מסוימת זה מהגידול הכמותי 0.1 מ"ל נחוץ בשל את מספר הסלולרי גבוה מוזרק. הליך זה אושרה על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת ג'ורג'טאון ועדת שימוש.
   1. הכנס את המחט לתוך שריר הסובך anteriorly בכ 30 - בזווית של 45 מעלות לכיוון הרכס / גַבשֶׁשֶׁת השוקה.
   2. מעט לשלוף את המחט פעם הוא בא במגע עם ציצה / גַבשֶׁשֶׁת השוקה. לאט לאט להזריק את הפתרון ההשעיה התא, משיכת המחט בהדרגה לשחרר לחץ.
4. לפקח על העכברים שהוזרקו מעל 24 השעות הבאות עבור סימני מצוקה.
   הערה: חוקרת עם פחות ניסיון בטיפול בבעלי חיים צריכה לשקול הרדמת עכברי זריקות תאים סרטניים. מוסדות מסוימים עשויים לדרוש הרדמה מטעמי בטיחות.

3. מעקב גדילת גידול ראשונית

1. לפקח על הצמיחה של גידולים ראשוניים דaily עד גודל הגידול מגיע בנפח הרצוי.
   הערה: במחקר הנוכחי, נפח עגל של 250 מ"מ ³ שימש כנקודת המוצא של הניסוי (איור 2 ב). בדרך כלל, זה לוקח בערך 1 - 2 שבועות עבור גידולים להגיע לגודל הזה.
   1. מדוד את גודל העגל יומי עם מחוגה דיגיטלית באמצעות אורכי המדיאלי-לרוחב קדמי, אחורי שלה.
   2. לקבוע את עוצמת הקול עגל על ידי הנוסחא (D XD ^2/6) x 3.14, כאשר D היא בקוטר הארוך d הוא קוטר הקצר מבין hindlimb התחתון נושאות הגידול.
      הערה: הגודל של עגל מבוגר עכבר רגיל הוא של כ 40 - 50 מ"מ ^3. נפח יגדל בשל צמיחת גידול בשלבים מאוחר העגל יורכב בעיקר של רקמת גידול.

4. ירך עורק קשירה (FAL) גרימת היפוקסיה הגידול נושא Hindlimb

1. מכינים את כלי הניתוח הדרוש לפעולה זו: נוכved או הצביעו מלקחיים בסדר, הצביעו מלקחיים, מספרי כירורגיים בעל מחט. לעקר כלים אלה לפני הניתוח באמצעות חיטוי או מעקר חם חרוז. בנוסף, יש צמר גפן בסדר מוכן לניתוח הזה.
   הערה: מומלץ כי הכלים מחדש מעוקרים בקצות לפי הצורך במהלך ההליך.
2. להזריק סוכן כאבים (Carprofen 5 מ"ג / ק"ג) תת עורי (SQ). כדי לזהות ולאשר היפוקסיה, להזריק hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 מ"ג / ק"ג).
   הערה: מנה זו משווה ל 1.5 מ"ג לכל העכבר מושגת על ידי הזרקת 0.1 מ"ל של 15 מ"ג / מ"ל ​​פתרון hypoxyprobe ב PBS intraperitoneally (IP). Hypoxyprobe אז לאחר המוות לגילוי ברקמות בעלי חיים על ידי אימונוהיסטוכימיה.
3. מניחים את העכבר בתא אינדוקציה הרדמה המכיל 3 - isoflurane 5% ב 100% חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר / דקה.
4. השאירו את העכבר בתא אינדוקציה עד שהוא מגיב לגירויים חיצוניים. ואז להסיר את החיה מן iתא nduction. מניח את החיה במצב שכיבה על וילון סטרילי להציב על גבי כרית חימום על פני שטח ההפעלה. השתמש חרטומו לחבר אותו זרימה רציפה של 1 - 3% isoflurane ב 100% חמצן בקצב זרימה של 0.8 ליטר / דקה.
   1. החל הלא תרופתי סטרילי משחת עיניים לכל עין כדי למנוע התייבשות קרנית. כדי את השער באזור הניתוח יש למרוח קרם להסרת שיער, והשאיר אותו על העור במשך לא יותר מ -10 שניות. ואז לנגב את הקרם להסרת שיער באמצעות כרית הכנת אתנול.
5. רחב ולאבטח את hindlimb עם חתיכת הסרט כ 45 מעלות מן קו האמצע של העכבר. לאחר hindlimb מאובטח, ולנגב את העור חשוף עם 10% povidone / יוד ספוגית / פתרון, ואחריו אתנול, חוזר עוד פעמיים כל אחד. במשך שארית של ההליך הכירורגי, השתמש במיקרוסקופ סטריאו להשיג תצוגה מוגדלת של האזור hindlimb.
6. בעזרת מלקחיים מחודדים מספרי כירורגיות, עושה חתך של skב, כ ארוך 1 ס"מ, מאמצע הירך כלפי האזור מפשעתי. באמצעות צמר גפן בסדר לחלח מלוחים, בעדינות לסלק רקמת השומן התת עורית סביב שריר הירך.
7. בזהירות לחשוף את עורק הירך הבסיסי באמצעות דיסקציה קהה דרך רקמת שומן תת עורי. ייצב את פצע כירורגית שדה לחשוף את כלי הדם של שריר adductor האמצע עליון.
8. בעזרת מלקחיים בסדר, בעדינות פירס דרך נדן הירך קרומי לחשוף את צרור העצבים וכלי הדם. באמצעות סט נקי של מלקחיים בסדר, לנתח ולהפריד את עורק הירך מן הווריד עצב הירך במיקום הפרוקסימלי ליד המפשעה, דיסטלי רצועה מפשעתי. היזהר, כדי למנוע פירסינג קיר וריד הירך.
9. בעקבות לנתיחה, לעבור קווצת תפר משי 6-0 מתחת העורק דיסטלי הירך לסניף של עורק הירך גג לרוחב (LCFA). לחסום את עורק הירך באמצעות קשרים כפולים (איור 3).
10. סגירת החתך באמצעות תפרים 6-0 פוליפרופילן. לאחר סגירת החתך, להזריק SQ 0.5 מ"ל של תמיסת מלח חם לטיפול מאזן הנוזלים. מניח את החיה על גבי כרית חמה עטופה בכלוב ההתאוששות ולפקח באופן רציף עד ער.
11. לפקח על בעלי החיים במהלך 6 שעות לאחר הניתוח ולהזריק סוכן הכאבים (Carprofen 5 מ"ג / קילו, SQ) כל יום במשך 3 ימים. סר תפרים 10 ימים לאחר ניתוח באמצעות מספריים סטרילית.

5. כריתת גידול ראשונית ידי רגל קטיעה

הערה: לקטוע את hindlimb התחתון נושאות הגידול כשגודל עגל מגיע 250 מ"מ ³ עבור קבוצת הביקורת או 3 ימים לאחר FAL עבור הקבוצה היפוקסי.

1. לגלח את השיער מן איבר נושאות הגידול מן השוקה דיסטלי לאזור האגן עם קוצץ שיער תוך החזקת החיה בעדינות. להזריק את סוכן כאבים (Carprofen 5 מ"ג / ק"ג, SQ) לפני ההליך.
2. מניחים את העכבר לתוך ch אינדוקציה הרדמהענבר המכיל 3 - 5% isoflurane ב 100% חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר / דקה. השאירו את העכבר בתא אינדוקציה עד שהוא מגיב לגירויים חיצוניים. ואז להסיר את החיה מן תא אינדוקציה.
3. מניח את החיה במצב שכיבה לרוחב ממש על וילון סטרילי מונח על כרית חימום על פני שטח ההפעלה. השתמש חרטומו לחבר אותו זרימה רציפה של isoflurane 1 - 3% ב 100% חמצן בקצב זרימה של 0.8 ליטר / דקה. החל הלא תרופתי סטרילי משחת עיניים לכל עין כדי למנוע התייבשות קרנית
4. מכינים את האתר כירורגית באמצעות 10% povidone / יוד ספוגית / פתרון, ואחריו אתנול, חוזר 3 פעמים. למרוח גזה סטרילי (למשל, לעטוף כירורגית) על העכבר כדי לקבל שדה כירורגי סטרילי.
5. לעשות חתך בעור היקפי ירך באמצע, ואחריו לנתיחה בוטה הכחשה של העור proximally. לחשוף את pedicle העצב וכלי דם הירך המדיאלי בצד החציוני של הרגל, ולאחר מכן ולקשורליד הרצועה מפשעתי באמצעות 4-0 ומצופה (polyglactin 910) חומר תפר נספג.
6. בצע חיתוך רוחב אמצע הירך של קבוצות שרירים במספריים, ואחריו לנתיחה בוטה של ​​רקמות רכות למפרק coxofemoral. באמצעות חותך העצם, לבצע osteotomy אמצע הירך. באמצעות ספוגית כותנה קנס סטרילית או ספוג הג'לטין נספגים, לחץ בעדינות על האתר osteotomy לצמצום ומניעת דימום.
7. סגור את העור שמעליה באמצעות קליפים פצע כירורגית להזריק 0.5 מיליליטר של SQ מלח החם לטיפול מאזן נוזלים. מניח את החיה על גבי כרית חמה עטופה בכלוב ההתאוששות ולפקח באופן רציף עד ער.
8. לאחר הניתוח, לאסוף דגימות רקמה גידולים ראשוניים עבור RNA, DNA או בידוד חלבון, הצמד להקפיא בחנקן נוזלי חנות ב -80 C. עבור תרבית תאים ראשונית, לאסוף דגימות רקמה בשלב זה, כמפורט בסעיף 9 להלן. לתקן את רקמת האיבר שנותר 10% פורמלין ניטראלי שנאגר עבור היסטולוגיה immunochemisלנסות, כולל זיהוי hypoxyprobe-1.
9. צג החיות לתנועה, הכאב וצריכת מזון במהלך 6 השעות הראשונות לאחר הניתוח, ולאחר מכן בכל יום במשך 3 ימים. להזריק את סוכן כאבים (Carprofen 5 מ"ג / ק"ג, SQ) כל יום במשך 3 ימים. הסר את קליפים פצע 10 ימים לאחר קטיעה באמצעות מסיר קליפ פצע.

6. עכברי ניטור עבור הנוכחות של גרורות

1. הקפד על עכברים יומי ולהעריך אותם סימנים קליניים של גרורות לפחות פעמיים בשבוע.
   1. שים לב החיות לנוכחות macrometastases הצגה כמו המונים המתפתחים במקומות שונים, בדרך כלל בכתפיים, ברגליים נגדיות ולסתות. לשם כך, בזהירות למשש הראש, הצוואר ואזורים בבית השחי, ואת hindlimb הנגדי. בדוק גרורות איברים פנימיים באמצעות נפיחות בטנית יחד עם סריקת MRI.
   2. לבדוק את קיומו של גרורות סרטניות בריאות על ידי לחיצה על תהליך xyphoid (החלק התחתון של עצם החזה) עם אינסוףx אצבע. ²⁴
      הערה: לחץ זה מקטין את יכולת הנשימה סרעפתי. עכברים עם גרורות ריאות מתקדמות להראות סימני מצוקה נשימתית המתבטאת נשימה מאומצת.
   3. שים לב החיות עבור סימפטומים נוירולוגיים, כגון שיתוק ברגלו אטקסיה מצביע גרור למערכת העצבים המרכזית.
   4. צג העכברים לפחות פעם בשבוע לצורך ההרזיה, כאינדיקציה להתקדמות מחלה פוטנציאלית. גוף הרזיה תעלה על 15% מהמשקל מראש פרוצדורליים נחשבת קצה אנושי.

7. הדמיית תהודה מגנטית (MRI) עבור גרורות זיהוי

1. בצע MRI לגילוי גרור בנקודות זמן רצויות. ¹⁸
   הערה: במסגרת המחקר הנוכחי, ספקטרומטר אופקי 7-טסלה היה בשימוש. MRI בוצע ימים 15 ו -35-קטיעה פוסט עבור תאי SK-ES1 ובאותו יום 15 עבור TC71 תאים.
2. מניחים את העכבר לתוך chambe אינדוקציה הרדמהr המכיל 1 - 3% isoflurane בתערובת גז חמצן 30% ו -70% תחמוצת החנקן.
3. השאירו את העכבר בתא אינדוקציה עד שהוא מגיב לגירויים חיצוניים. ואז להסיר את החיה מן תא אינדוקציה.
4. מעביר את העכבר הרדים על בעל stereotaxic עם נשימה והטמפרטורה monitorization עם ממשל רציף של isoflurane 1.5% ו -30% תחמוצת חנקן. החל הלא תרופתי סטרילי משחת עיניים לכל עין כדי למנוע יובש קרני. תמונה החיה בין בהליך מ"מ 40 או 23 סליל העכבר נפח Bruker הדמיה הגוף או המוח כולו, בהתאמה.
5. השתמש רצף נדיר דו מימדי, T2-weighted: TR = 3,000 msec, TE = 24 msec, מטריקס = 256, FOV = 4.35 x 3.0 ס"מ, עובי פרוסה = 0.5 מ"מ, גורם נדיר = 4 וממוצעים = 4. ¹⁸
6. מניח את החיה בכלוב התאוששות חמה ולפקח באופן רציף עד ער.
   הערה: העכברים יתאוששו במהירות מאז מטוס של הרדמה רדוד משמש.
7. לפקח על בעלי החיים במהלך הדמיה 6 השעות לאחר הראשונות לוודא כי אין תופעות לוואי של ההרדמה.

8. המתת חסד Necropsy

1. להרדים את העכברים פעם החיות הנוכחיות עם גרורות לזיהוי באמצעות MRI ו / או תסמינים קליניים של התקדמות מחלה.
   הערה: במסגרת המחקר הנוכחי, העכברים הוקרבו על ימים 50 ו -25 שלאחר קטיעה חיות נושאות SK-ES1 ו xenografts TC71, בהתאמה. במקרים מסוימים, המתת חסד קודם לכן היה הכרחי בשל נטל גרורות גבוהה.
2. להרדים את העכברים על ידי חשיפת CO ₂ ב 1.5 L / min (CO ₂ ב 10 - 30% של דקות המתת חסד קאמרי כרך /). כדי להבטיח מוות חי, לבצע נקע בצוואר רחם לאחר חשיפת ₂ CO.
3. תרסיס העכבר כולו עם אתנול 70% ולמקם אותו לתוך מכסה המנוע זרימה למינרית. אסוף את הדם על ידי לנקב לב באמצעות מחט 25 G ½ עם מזרק 1 מ"ל ולהעביר איסוף דם tuלהיות המכיל 2 מ"ג של EDTA.
4. אסוף את הרקמות הבאות: טחול, בלוטת יותרת כליה, שחלות, כליות, כבד, ריאות, מוח, רגל ימין, מח העצם humeri ושדרתי, כמו גם גרור מקרוסקופיות נוכחית במקומות אחרים. ^25,26
5. תקן חצי של כל רקמות 10% פורמלין נייטרלי שנאגרו עבור היסטולוגיה immunochemistry, כולל זיהוי hypoxyprobe-1. הצמד להקפיא את החצי השני בחנקן נוזלי, ולאחר מכן לאחסן ב -80 צלזיוס למשך RNA, DNA או בידוד חלבון. ^25,26 עבור תרבית תאים ראשוניים, לאסוף דגימות רקמה כמפורט בסעיף 9 להלן.

9. תרבית תאים ראשונית

1. כדי לבצע תרבית תאים ראשונית, לנתח רקמות מן האיבר הכרות (סעיף 5 לעיל) או במהלך necropsy (סעיף 8 לעיל) בתנאים סטריליים במנדף זרימה למינרית.
2. כן מתאים תקשורת תרבית תאים עבור הקו הסלולרי משמש זריקות orthotopic, השלם עם פניצילין (200 יחידות / מיליליטר),סטרפטומיצין (200 מיקרוגרם / מ"ל), fungizone (1 מיקרוגרם / מ"ל), ו אנטיביוטי מניעתי 0.2% mycoplasma. מניחים 2.5 מ"ל של המדיום התרבות העיקרי לתוך צלחת תרבית תאים 6 ס"מ.
3. בחר באזורי רקמת גידול קיימא מגידולים או גרורות ראשיים ולאחר מכן לבודד שני לשלושה מיגזרי ב 2-3 מ"מ כל באמצעות מספריים סטרילית.
   הערה: רקמת גידול בת קיימא נמצאת בדרך כלל על הקצוות של הגידול והוא יכול להיות מופלים מן נימק לפי צבע ורדרד או אדמדם, שופע משמעותית ומראה רטוב הכולל. לעומת זאת, רקמות נימקים נתפסו בדרך כלל במרכז של הגידול ומציגה כגוש צבע לבנבן / שמנת עם מראה חסר חיים, גביני. ²⁷
4. מעביר את הפלחים המבודדים לצלחת תרבית תאי 6 סנטימטר המכילה בינוני התרבות העיקרי שמתואר בשלב 9.2.
5. תרבות תאים בתנאים סטנדרטיים, כמתואר בסעיף 1 (הערה) ו -9.2. ^18,28 בדוק את תרבות תולדת הסלולר הנובעים פיסות הרקמה, WHich יש לשים לב תוך מספר ימים. לאחר התאים מגיעים למפגש, trypsinize ולהרבות אותם בהתאם לטכניקות תרבית תאים סטנדרטיים.
   הערה: תרבית התא הראשונית ניתן לאחר מכן נעשתה שימוש כדי להעריך צמיחה ומאפיינים גרורתי של התאים שמקורם מלאים גידולי חוסר חמצן, כמו גם התכונות המולקולריות שלהם, כפי שתואר לעיל. ¹⁸

תוצאות

בעקבות הזרקה של בתאי גזע עובריים לתוך שריר הסובך, הגידולים העיקריים הם מותר לגדול לגודל עגל של 250 מ"מ ³ (איור 1, 2). את הזמן הדרוש עבור גידולים להגיע בכרך זה בדרך כלל נע בין 10 - 15 ימים עבור TC71 20-25 ימים xenografts SK-ES1, בהתאמה. גידולים בווליום עגל ...

Discussion

המודל שלנו כולל השוואה של גרורות בשתי קבוצות ניסוי - קבוצת ביקורת, שבהם גידולים מותרים להתפתח hindlimb ואחריו קטיעה בהגיעם נפח עגל של 250 מ"מ ^3, וקבוצה חשופה-היפוקסיה, שבו tumor- hindlimb נושאות נתונה FAL באותו נפח, ואחריו קטיעה 3 ימים לאחר מכן. למרות בניסויים אלה הגידולים שט?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells	ATCC
TC71 Human ES cells			Kindly provided from Dr. Toretsky
McCoy's 5A (modified) Medium	Gibco by Life Technologies	12330-031
RPMI-1640	ATCC	30-2001
PBS	Corning Cellgro	21-040-CV
FBS	Sigma-Aldrich	F2442-500mL
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life Technologies	25200-056
Penicillin-Streptomycin	Gibco by Life Technologies	15140-122
Fungizone® Antimycotic	Gibco by Life Technologies	15290-018
MycoZap™ Prophylactic	Lonza	VZA-2032
Collagen Type I Rat tail high concetration	BD Biosciences	354249
SCID/beige mice	Harlan or Charles River	250 (Charles River) or 18602F (Harlan)
1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle	BD	329424
Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP)	Hospira, INC	NDC 0409-7984-37
Digital calipers	World Precision Instruments, Inc	501601
Surgical Tools	Fine Science Tools
Rimadyl (Carprofen) Injectable	Zoetis
Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid)	HPI, Inc	HP-100mg
hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg)	HPI, Inc	CCI-103F-250mg
Povidone-iodine Swabstick	PDI	S41350
Sterile alcohol prep pad	Fisher HealthCare	22-363-750
LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment)	Major Pharaceuticals	NDC 0904-5168-38
VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56617-014
Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade	Oster	078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade)
Nair Lotion with baby oil	Church & Dwight Co., Inc.
Silk 6-0	Surgical Specialties Corp	752B
Prolene (polypropylene) suture 6-0	Ethicon	8680G
Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0	Ethicon	J386H
Fisherbrand Applicators (Purified cotton)	Fisher Scientific	23-400-115
GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4	Pfizer Pharmaceutical	9039605
Autoclip Wound Clip Applier	BD	427630
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Autoclip remover	BD	427637
Aound clip	BD	427631
MRI 7 Tesla	Bruker Corporation
Paravision 5.0 software	Bruker Corporation
CO2 Euthanasia system	VetEquip
25 G 5/8 Needle (for heart-puncture)	BD	305122
0.1 ml syringe (for heart-puncture)	Terumo	SS-01T
K3-EDTA Micro tube 1.3 ml	Sarstedt	41.1395.105
10% Neutral Buttered Formalin	Fisher Scientific	SF100-4