הפקת חומרים פולימריים המבני התאי מ אירובי גרגירי בוצה

Summary

הפרוטוקול מספק מתודולוגיה solubilize בוצה פרטנית אירובית כדי לחלץ פולימרים תאיים דמוי אלגינט (ALE).

Abstract

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na₂CO₃) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca²⁺). From the six extraction methods used, only the Na₂CO₃ extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca²⁺. The Ca²⁺-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.

Introduction

בשנים האחרונות הבוצה פרטנית האירובי (AGS) התהליך הפך תהליך טיפול ביולוגי בשפכים פופולרי, מיושם בהצלחה במפעלי טיהור שפכים כמה בקנה מידה מלאה ^1. בניגוד לתהליך הבוצה הקונבנציונלי הופעל, ב AGS לעבד את מיקרואורגניזמים יוצרים גרגירים במקום flocs ^2. יש גרגירים אלה settleability טוב יותר, מסוגלים לעמוד שיעורים ועומס אורגניים גבוהים, ויש להם סובלנות גבוהה יותר כדי רעיל מ flocs בוצה משופעלת ^3.

בניגוד biofilms, AGS נוצר באופן ספונטני ללא מעורבות של כל חומר הספק ^4. ב AGS, כמו biofilms, מיקרואורגניזמים לייצר כמות משמעותית של חומרים פולימריים תאיים hydrated ביותר (EPS) ⁵ לטופס מטריקס הידרוג'ל שבו הם-משותקת עצמית ^{4 - 6.} EPS הוא תערובת מורכבת, מורכבת סוכרים, חלבונים, חומצות גרעין, (phospשומנים הו), חומרים humic וכמה פולימרים אינטר ^5,7,8. חומרים פולימריים אלה לתקשר אחד עם השני באמצעות כוחות אלקטרוסטטיים, קשרי מימן, כוחות יוניים אטרקטיביים ו / או תגובות ביוכימיות, וכו ^'5, היוצרים מבנה רשת שליישונים צפוף וקומפקטי. הפולימרים ב EPS אשר מסוגלים ליצור הידרוג ^4,9 ו לתרום להיווצרות של מבנה רשת שליישונים הם מבחינה זו נחשבת EPS מבני, קבוצת משנה של EPS הכולל.

EPS אחראי המבנה הכימי ותכונות פיזיקליות של גרגרים ^5. לכן חיוני כדי להבין את תפקידו של כל מתחם EPS. גישות שונות משמשות כדי לחלץ EPS ^{10 - 15.} עם זאת, בשל המורכבות הקיצונית שלהם, זה כמעט בלתי אפשרי לחלץ את כל רכיבי EPS בשיטה אחת. נכון להיום, אין "מידה אחת מתאימה לכולם" שיטה להפקת EPS. הבחירה של שיטת החילוץ משפיעה לא רק את הסכום הכולל, אלא גם את רכב הפולימרים התאוששו ^{13,16 - 20.} בהתאם לסוג של בוצה ואת EPS של שיטות שונות ריבית נדרשת.

חילוץ פולימרים יוצרי ג'ל, אפיון תכונותיהם חוקרת הגומלין שלהם אחד עם השני ועם EPS שאינם יוצרי ג'ל יעזור לחשוף את התפקיד של EPS במבנה בוצה פרטנית אירובית. יתר על כן, פולימרי יוצרי ג'ל גם biopolymers השימושי ביישומים תעשייתיים. אחד יישומים אפשריים כבר הוצגו באמצעות פולימרי יוצרי הג'ל AGS כחומר ציפוי כדי להגדיל את התנגדות המים של נייר ^21.

לכן, שיטות חילוץ, ספציפית עבור EPS יוצרי ג'ל נדרשות. מטרת מחקר זה היא לפתח מתודולוגיה כדי לחלץ EPS יוצרי הג'ל AGS. שש שיטות חילוץ ^{10 - 1}5,22, אשר משמשים לעתים קרובות בספרות, נבחרו כדי לחלץ EPS מ AGS. הסכום הכולל ואת רכוש יוצרי ג'ל של EPS חילוץ הושוו עבור כל מתודולוגיה.

Protocol

הערה: AGS נאסף מכור טייס Nereda במפעל הטיפול בשפכים אוטרכט, הולנד. הכור הוזן עם ביוב עירוני. הבוצה גרגירי היה מדד נפח הבוצה _(5min SVI) של 59.5 מ"ל / g _VSS. בוצת נדגמה באפריל בסוף המחזור אירובי. לאחר הדגימה, הבוצה הועברה מיד למעבדה, הסתנן ומאוחסנים ב -20 ° C עד השימוש.

1. הפקת EPS

הערה: בוצה פרטנית צנטריפוגה ב 4000 גרם × ו -4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, למזוג supernatant. אסוף גרגירים הגלול עבור העקירות. המוצקים הכולל (TS) ו המוצקים נדיפים (VS) של הגרגרים נקבעו על ידי השיטות הסטנדרטיות ^23. גורם ההמרה בין משקל רטוב גרגיר - המשקל של הגרגרים נלקחים ישירות הגלול - ואת TS נקבע לפני החילוץ. כל העקירות נעשו triplicates.

הערה: 3 g g הרטובranules שמש עבור כל שיטת חילוץ. TS וערכיהם VS (TS 0.39 גרם ו 0.34 גרם VS), נמדד triplicates, שימשו על מנת לחשב את התשואה החילוץ.

1. מיצוי צנטריפוגה ¹¹
   1. העברת 3 גרם (משקל רטוב) גרגירים לתוך צינור צנטריפוגה ולמלא את הצינור צנטריפוגה 50 מ"ל עם מים demineralized.
   2. מעט לנער את הצינור צנטריפוגה ביד.
   3. צנטריפוגה צינור צנטריפוגה המכיל את התערובת על 4,000 גרם × ו -4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   4. איסוף supernatant בכוס זכוכית, וזורקים את הכדור ולהמשיך עם supernatant כמפורט בסעיף 1.7.
2. מיצוי Sonication ¹⁰
   1. העברת 3 גרם (משקל רטוב) גרגירים לתוך צינור צנטריפוגה ולמלא את הצינור צנטריפוגה 50 מ"ל עם מים demineralized.
   2. החל sonication פעם על קרח למשך 2.5 דק 'ב 40 W לתערובת.
   3. צנטריפוגה צנטריפוגהשפופרת המכילה את התערובת על g 4,000 × ו -4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   4. איסוף supernatant בכוס זכוכית, וזורקים את הכדור ולהמשיך עם supernatant כמפורט בסעיף 1.7.
3. חומצת Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) מיצוי ¹¹
   1. העברת 3 גרם (משקל רטוב) גרגירים לתוך בקבוק זכוכית 100 מ"ל ולמלא את הבקבוק עד 50 מ"ל עם 2% (w / v) פתרון EDTA.
   2. מעט לנער את הבקבוק ביד ולאחסן אותו במקרר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
   3. מעבירים את התערובת לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
   4. צנטריפוגה צינור צנטריפוגה המכיל את התערובת על 4,000 גרם × ו -4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   5. איסוף supernatant בכוס זכוכית, וזורקים את הכדור ולהמשיך עם supernatant כמפורט בסעיף 1.7.
4. Formamide - מיצוי נתרן הידרוקסידי (NaOH) ¹³
   1. העברת 3 גרם (משקל רטוב) גרגירים לתוך 100בקבוק זכוכית מ"ל ולמלא את הבקבוק עד 50 מ"ל עם מים demineralized.
   2. להוסיף 0.3 מ"ל 99% לפוראמיד.
   3. מעט לנער את הבקבוק ביד ולאחסן אותו במקרר ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
   4. הוסף 20 מ"ל 1 M NaOH להשהייה גרגיר.
   5. מעט לנער את הבקבוק ביד ולאחסן אותו במקרר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
   6. מעבירים את התערובת באופן שווה לשתי צינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
   7. צנטריפוגה צינורות צנטריפוגה המכילים את התערובת על 4,000 גרם × ו -4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   8. איסוף supernatant בכוס זכוכית, וזורקים את הכדור ולהמשיך עם supernatant כמפורט בסעיף 1.7.
5. פורמלדהיד - NaOH חילוץ ¹¹
   1. העברת 3 גרם (משקל רטוב) גרגירים לתוך בקבוק זכוכית 100 מ"ל ולמלא את הבקבוק עד 50 מ"ל עם מים demineralized.
   2. להוסיף 0.3 מ"ל 37% פורמלדהיד.
   3. מעט לנער את הבקבוק ביד וחנותאותו במקרר ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
   4. הוסף 20 מ"ל 1 M NaOH להשהייה גרגיר.
   5. מעט לנער את הבקבוק ביד ולאחסן אותו במקרר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
   6. מעבירים את התערובת באופן שווה לשתי צינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
   7. צנטריפוגה צינורות צנטריפוגה המכילים את התערובת על 4,000 גרם × ו -4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   8. איסוף supernatant בכוס זכוכית, וזורקים את הכדור ולהמשיך עם supernatant כמפורט בסעיף 1.7.
6. טמפרטורה גבוהה - מיצוי סודיום קרבונט (Na ₂ CO ₃₎ ^9,22,24
   1. טרום חום 150 מ"ל מי ברז בכוס זכוכית 1,000 מ"ל על בוחש מגנטי עד 80 מעלות צלזיוס.
   2. העברת 3 גרם (משקל רטוב) גרנולות בתוך 250 מ"ל מבולבל הבקבוק למלא את הבקבוק עד 50 מ"ל עם מים demineralized.
   3. להוסיף 0.25 g Na ₂ CO ₃ נטול מים או 0.67 גרם Na ₂ CO ₃ • 10H _{2 O לתוך הבקבוק כדי להשיג 0.5% (w / v) Na 2 CO ריכוז 3.}
   4. שים את הבקבוק המכיל את התערובת לתוך אמבט מים. מכסה את הבקבוק ואת כוס הכוס בנפרד בנייר אלומיניום כדי למנוע אידוי.
   5. מערבבים את התערובת במשך 35 דקות ב 400 סל"ד ו -80 מעלות צלזיוס.
   6. מעבירים את התערובת לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
   7. צנטריפוגה צינור צנטריפוגה המכיל את התערובת על 4,000 גרם × ו -4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   8. איסוף supernatant וזורקים את הכדור.
7. TS ו VS מדידה כל התמציות פי השיטות הסטנדרטיות ^23.
   1. קח את supernatant dialyze זה למשך 24 שעות נגד 1,000 מ"ל מים ultrapure (שקית דיאליזה עם 3,500 משקל מולקולרי Da מנותקים (MWCO)) ^11,12. להחליף את מי דיאליזה לאחר 12 שעות כדי להגביר את האפקט של הדיאליזה.
   2. עבר חלק סביר (סביב 1/3) של supernatant dialyzed כדיצלחת אלומיניום עבור TS ו VS המדידה ^23.
      הערה: יבש המדגם לילה ב 105 מעלות צלזיוס. ההבדל במשקל של מנת האלומיניום הריקה ואת מנת האלומיניום המכיל המדגם המיובש הוא תוכן TS. ואז לשרוף את אותה מנת אלומיניום המכיל המדגם ב 550 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. ההבדל במשקל בין צלחת האלומיניום הריקה ואת מנת האלומיניום המכיל המדגם הנשרף הוא תכול האפר. ההבדל בין תוכן TS ואפר הוא התוכן VS.
   3. עבור כל קטע, להעביר את החלק היחסי שיורית של supernatant dialyzed עד 10 כוסות זכוכית מ"ל. לעבות את supernatant עבור 2 ימים ב 60 ° C עד נפח סופי של 1-2 מ"ל כדי להגדיל את הריכוז פולימר ב supernatant.

הפקת 2. אלגינט דמוי פולימר תאי (ALE)

1. Dialyze התמצית שהושגה בשלב 1.6.8 על פי צעד 1.7.1.
2. מעבירים את תמצית dialyzed לתוך כוס זכוכית 250 מ"ל. לְהַאֵטly ומערבבים החילוץ ב 100 סל"ד ו בטמפרטורת החדר. כל הזמן לעקוב אחר שינויים pH עם אלקטרודה pH, תוך הוספת 1 חומצה הידרוכלורית M (HCl) על pH הסופי של 2.2 ± 0.05 להשיג ALE בצורת חומצי.
3. לאחר התאמת ה- pH 2.2, להעביר את תמצית לתוך צינור צנטריפוגות צנטריפוגה 50 מ"ל ב 4000 g × ו -4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
4. בטל supernatant ולאסוף גלולה דמוי ג'ל. הגלולה דמוית ג'ל היא ALE בצורת חומצי.
5. כדי להשיג את נתרן (או אשלגן) בצורת ALE, לאט להוסיף 0.5 M NaOH (או 0.5 M אשלגן הידרוקסידי) הג'ל שהושגו בשלב 2.4, תוך ערבוב את הג'ל לאט עם מקל זכוכית ביד עד pH 8.5 הוא הגיע.

3. מבחן גיבוש יונית הידרוג'ל

הערה: כדי לבדוק אם EPS שחולץ היה נכסי היווצרות הידרוג'ל יוניים, מבחן היווצרות חרוז עם יוני Ca ²⁺ שמש ^25.

1. לאחר העיבוי של התמצית בשלב 1.7.3 כדיבהיקף של 1-2 מ"ל, מערבבים את התערובת לאט עם מקל זכוכית ולהתאים pH שלו 8.5 עם 0.5 M NaOH.
2. קח את התמצית של שלב 3.1 או ALE נתרן של שלב 2.5 ולאט לאט לטפטף את התמצית עם פיפטה פסטר לתוך 2.5% (w / v) כלוריד סידן ₍₂ CaCl) פתרון.
   הערה: אם EPS החילוץ יש ג'ל הידרוג'ל היוני להרכיב נכסים, טיפה בצורת (כדוריים) חרוזים יוקמו. אם EPS החילוץ אין ג'ל הידרוג'ל יוני להרכיב נכסים, התמצית תתפזר בפתרון ₂ CaCl.

4. מבחן היציבות של הידרוג'ל יונית

הערה: כדי להמשיך להבין את התפקיד של הידרוג'ל EPS היוני במבנה מבנה AGS, בדיקות יציבות בוצעו על חרוזי הידרוג'ל היוניים של מיצוי Na ₂ CO _3, שנאספו בשלב 3.2.

1. שמור את החרוזים הידרוג'ל למשך 30 דקות בתמיסה ₂ CaCl.
2. בעזרת כף כדי להוציא את החרוזים הידרוג'ל מן CaCl ₂ פתרון ולפצל את החרוזים ארבעה חלקים שווים.
3. חנות חלק 1 ב 10 מ"ל Demineralized מים במשך 4 שעות ב 4 ° C.
   הבדיקות היציבות הבאות בוצעו באותו אופן כפי שמתוארות שיטות חילוץ 1.3 - 1.5.
4. חלק 2 חנות ב 10 מ"ל 2% (w / v) פתרון EDTA במשך 3 שעות ב 4 ° C.
5. חנות חלק 3 ב 7.15 מ"ל Demineralized מים עם 60 μl 99% לפוראמיד עבור שעה 1 ב 4 ° C. לאחר מכן מוסיפים 2.85 מ"ל 1 M NaOH ולאחסן חלק 3 עבור 3 שעות ב 4 ° C.
6. חנות חלק 4 ב 7.15 מ"ל Demineralized מים עם 60 μl 37% פורמלדהיד עבור שעה 1 ב 4 ° C. לאחר מכן מוסיפים 2.85 מ"ל 1 M NaOH ולאחסן חלק 4 עבור 3 שעות ב 4 ° C.
7. צג אם יש התפוררות גלויה של החרוזים במהלך האחסון בתנאים שתוארו ב 4.3 - 4.6 ל- להעריך אם החרוזים לעמוד בתנאי חילוץ.

תוצאות

מיצוי EPS
הופעתו של גרגרים לאחר ומיישום נהלי חילוץ EPS השונה מוצגת באיור 1. המבנה בצורת ג'ל גרגירים היו שלם לאחר צנטריפוגה (איור 1 א) והפקת EDTA (איור 1 ג '). גרגרים נשברו לרסיסים בגדלים שונים על ידי sonication. העכירות בשלב הנוזלי יכולות להיות בגלל השעיה של שברים קטנים (איור 1b) כמו עכירות ירד מאוד לאחר צנטריפוגה. Formamide פורמלדהיד לבד לא תהיה כל השפעה על שינוי הצורה של גרגר ומבנה ג'ל שלה (מידע לא מוצג). לאחר תוספת של NaOH, בשלב נוזל הפך צהבהב. כמה חומר מוכה היה מנותק מן השטח של הגרגירים יצר שכבה על גבי הגרגרים התיישבו (איור 1D ו 1E). ובכל זאת, את הצורה שלגרגירים לא שונו. תוספת של NaOH כנראה השתפר solubilization EPS, אבל לא יכול לפגוע במבנה מטריקס ג'ל. לשם השוואה, גרגירים נעלמו לחלוטין לאחר חילוץ ₃ Na ₂ CO (1F איור). במקום תערובת של חלקיקים דמויי ג'לי נוזליים זעירים סול כמו נוצרה, מראה את מטריקס ג'ל גרגירים היה solubilized אכן.

איור 1. בוצת EPS הפרטנית אירובי עקירות. במשך ויזואליזציה טובה יותר של ההשפעה של כל שיטת חילוץ על הגרגירים, ניסויים נערכו 25 מיליליטר בקבוקי זכוכית. לאחר שהסתיים הליך החילוץ, התמציות הוחזקו במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר כדי לאפשר משנה המושעית להתיישב. (א) החילוץ צנטריפוגה, (ב) מיצוי Sonication, (ג) מיצוי EDTA, (ד) Formamide - NaOH נוסףction, (ה) פורמלדהיד - מיצוי NaOH, (ו) טמפרטורה גבוהה -. Na ₂ CO ₃ החילוץ אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

EPS תשואה ביחס שבר VS לכל שיטה מתוארת באיור 2. התשואה מוצגת מ"ג VS _EPS לכל הראשונית גרם VS _גרגיר. כמות EPS מתקבל על ידי פורמלדהיד + NaOH, לפוראמיד + NaOH ו Na ₂ CO ₃ + חום + ערבוב היה גבוה יותר מזה של צנטריפוגה, sonication והפקת EDTA. תוצאות דומות עבור שיטות מיצוי אלה הוצגו גם על ידי מחקרים קודמים ^{11 - 13,15} המציין כי תנאי בסיסי לשפר EPS מסיס ^26,27. כמות EPS התאוששה על ידי Na ₂ CO ₃ היה הגבוהה ביותר, יותר מ -20 פעמים זה מושג רק על ידי צנטריפוגה. בנוסף, תשואת EPS הכוללת של מיצוי Na ₂ CO ₃ יכולה להיות עוד יותר משופרת על ידי עקירות מרובות. חילוץ שני באמצעות הגלולה מושלכת בשלב 1.6.8 (סעיף פרוטוקול) של החילוץ הראשון הגדיל את התשואה הכוללת על ידי 28%, מיצוי מרובע אפילו הגדיל את התשואה הכוללת על ידי 46%.

איור 2. תוצאות של כל שיטות החילוץ ביחס VS תשואה ותוכן אפר. עבור כל מיצוי הבר הראשון מייצג את התשואה VS במ"ג VS _EPS לכל הראשונית גרם VS _גרגיר. הבר השני מייצג את אחוז המשקל של אפר TS החילוץ. הברים שגיאה להמחיש את סטיית התקן של שלוש עקירות ביצע עבור כל טכניקה החילוץ."_blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אלגינט דמוי פולימר תאי (ALE) מיצוי
אחרי ה- pH של EPS שחולץ על ידי מיצוי Na ₂ CO ₃ הותאם 2.2, 63% מכלל תושבי העיר VS היה זרז. המשקע הוא חומצי ALE ^25. השבר שיורי היה EPS סביר אשר ניתן solubilized בתנאי החילוץ, אך לא יכול להיוצר משקע ב- pH 2.2.

מבחן היווצרות הידרוג'ל יונית
גרגרים אירוביים תוארו כדומה לזו של הידרוג. תהליך הפרור נחשב כתופעת יוצרי ג'ל עם גליקוזידים כסוכן gelling ^4,9,25,28. בדרך כלל, Ca ^{2 +} הוא אחד קטיונים הנפוצים ביותר בשפכים. בנוסף, הוא נקשר בקלות עם סוכרים חומצי (למשל,alginates וחומצה פולי-galacturonic), מן הסתם גם יון לדלפק לתווך gelation ^29. כך וכתוצאה מכך ionically הידרוג'ל צולב. היה נראה כי התוספת של יוני ²⁺ Ca יכולה להאיץ פרור בוצה אירובית ^30. לכן, Ca ^{2 +} -EPS (הידרוג'ל יוני) יכול לשחק תפקיד חשוב בבניית המבנה מטריקס ג'ל בבוצה פרטנית אירובית. מבחינה זו, אם EPS החילוץ מהווה הידרוג'ל יוני עם יוני Ca ^{2 +} יכול לשמש כבדיקה על מנת לבדוק אם EPS החילוץ הוא פולימר מבני תורם להיווצרות של מטריקס ג'ל בבוצה פרטנית אירובי ^9.

במחקר זה, עבור EPS מופק AGS (איור 3 א) על ידי שיטות שונות, רק EPS שחולץ על ידי Na ₂ CO ₃ שנערך בצורת טיפה 2.5% (w / v) פתרון CaCl ₂ ויצר חרוזי הידרוג'ל יוניים יציבים .יתר על כן, ALE נתרן המתקבל זו EPS ידי צעדים נוספים (מיצוי פולימר ALE, איור 3B) מוצג באותו הנכס וכן. הצבע והמורפולוגיה של חרוזי ג'ל -ALE Ca ^{2 +} (איור 3c) דומה בוצה הפרטנית אירובית (איור 3 א). ככל הנראה, EPS חילוץ בשיטת Na ₂ CO ₃ תורם להיווצרות של מטריקס ג'ל בבוצה פרטנית אירובית. ALE, שהנו מרכיב עיקרי של EPS זה הוא פולימרים מבניים, מסוגל ליצור הידרוג'ל יוני.

בדיקת יציבות של הידרוג'ל היוני
היה נראה כי במהלך חילוץ EPS, גרגירים אירוביים שמרה צורה הכדורית שלהם EDTA, פורמלדהיד + NaOH ו לפוראמיד + NaOH (איור 1). על מנת להבין אם פולימרים מבניים חילוץ לשחק תפקיד היציבות של גרגירים, Ca ^{2 +} -ALE חרוזים היולהתייחס אל דברים בדיוק באותו אופן כמו גרגר אירובי במהלך החילוץ. מעניין, Ca ^{2 +} חרוזים -ALE הציגו את היציבות דומה לזה של AGS (3D איור - 3F), כלומר, Ca ^{2 +} -ALE חרוזים היו יציבים מאוד EDTA. וקשה היה למצוא כמות ALE מנותק מפני השטח של Ca ^{2 +} חרוזים -ALE (floc חום זעיר 3E איור ו 3F), כאשר חרוזים Ca ²⁺ -ALE היה טבול פורמלדהיד + NaOH ו לפוראמיד + NaOH במשך שלוש שעות , בהתאמה. דמיון זה במונחים של יציבות בין Ca ^{2 +} חרוזי -ALE וגרגרים אירוביים עולה כי ALE הוא חלק אחד הפולימרים המבניים החשובים להרכיב את מטריקס ג'ל AGS.

איור 3. גרגרים אירוביים חילוץ ALE. (א) גרגירי pr מי demineralizedמיצוי IOR. (ב) ALE חומציים (חילוץ על פי הסעיפים 1.6 ו -2) לאחר צנטריפוגה ב g 4,000 × ו -4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. תוצאות של בדיקת היציבות של הידרוג'ל היוני. (ג) Ca ^{2 +} -ALE-חרוזים מאוחסנים מים demineralized עבור 4 שעות ב 4 ° C.. (ד) Ca ^{2 +} -ALE-חרוזים מאוחסנים EDTA 2%, עבור 3 שעות ב 4 ° C.. (ה) Ca ^{2 +} -ALE-חרוזים מאוחסנים לפוראמיד + NaOH עבור 4 שעות ב 4 ° C.. (ו) Ca ^{2 +-חרוזים} -ALE מאוחסן בפורמלין + NaOH עבור 4 שעות ב 4 ° C. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

הערות על סעיף הפרוטוקול
הפקת EPS / ALE מתואר עבור נפח של 50 מ"ל ו -3 גרם של גרגרי. ערכים אלו אמורים כקווים מנחים. עקירות עם ריכוזי גרגיר גבוהים יכולות להפחית את התשואה של EPS החילוץ. במהלך החילוץ של ALE הטמפרטורה חייבת להישמר קבועה על 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כמה זמן נדרש עבור תערובת לחמם (כ -5 דקות) נכלל בפרוטוקול. יתר על כן, את יעילות החילוץ לשפר באמצעות בר ומערבבים מגנטי באותו הגודל כמו בקוטר של תחתית הבקבוק. זה יגרום נכסי ערבוב טובים ואפקטי טחינה, קידום החילוץ של EPS.

בהמשך סעיף הפרוטוקול, TS ו VS תשואות של כל העקירות (supernatant שנאספו צעדים 1.1-1.6) נחושות. דיאליזה צריכה להתבצע לפני TS ו VS מדידה כדי להקטין שגיאות אפשריות בשל הנוכחות של כימיקלים המשמשים עקירות. אMWCO של 3,500 Da מומלץ להסיר כימיקלים אלה תוך שמירה על מקרומולקולות EPS בתוך שקית דיאליזה. תיק הדיאליזה צריך נפח גדול יותר מאשר הנפח של התמצית. זה הכרחי, כי עוצמת השמע של תמצית יגדל במהלך דיאליזה (למשל, להפקת EDTA עד 40% מהגידול הכמותי). מידת ההסרה כימית על ידי דיאליזה יכולה להיקבע על ידי מדידת pH במדגם לפני ואחרי הדיאליזה. לחלופין, מדידות מוליכות של מי הדיאליזה להראות את מידת הסרת יון.

כדי להשיג ALE מן EPS חילוץ הכולל (שלבי 1.6 ו -2) צעד הדיאליזה הוא אופציונאלי. אף על פי כן, יש דיאליזה שלושה יתרונות: היא מפחיתה את כמות HCl דרושים הממטרים, זה משפרת את ההעברה המוני חומצה בקטע ומפחיתה את תכולת האפר של ALE שהושג. משקעים של ALE מומלץ להשתמש בכוס זכוכית עם נפח גדול בהרבה מאשר extract. Na ₂ CO ₃ הוא מת ממנת יתר בדרך כלל ב החילוץ. המוסף HCl הראשון יגיב עם CO Na _{2 3} עזב בתמצית, וכתוצאה מכך היווצרות פחמן דו חמצני, אם המדגם לא היה dialyzed לפני, ב הקצפה. במהלך התוספת של HCl, התמצית צריכה להתרגש לאט עם בר ומערבבים מגנטי באותו הגודל כמו חלק התחתון של הכוס. בר ומערבבים בסדר גודל כזה ואת ערבוב איטי תגרום אפילו ערבוב בלי לשבור את המבנה של המשקע. אם גושי ג'ל חומצי נוצרים בקטע, הכוס יש הסתחררה מעט ביד. כמות המשקעים היא מתקיימת תוך שימת ריכוז החומצה של 1 M להימנע עלייה בנפח גדול של תמצית ועדיין קבלת חלוקה הומוגנית של חומצה במדגם. ריכוזי חומצה גבוהים יכולים לגרום במערך ירידת pH אזורי גושי ג'ל חומצי. ה- pH נמוך מ 2.0 מצמצם את כמות ALE כי ניתן לשחזר, ככל הנראה בשל שינויים מבנייםשל פולימרים ב- pH נמוך. לכן חשוב לשמור על pH הסופי 2.20 ± 0.05.

מגבלות
שיטת חילוץ ALE שואפת לחלץ פולימרים תאיים מבניים של EPS מ AGS או biofilms בכלל לא נועדה לחלץ את כל EPS הנוכחי. כדי לחלץ את כל EPS, שילוב של יותר מ שיטת חילוץ אחד הוא הכרחי. יתר על כן, כפי שמוצג עם העלייה של תשואת VS _EPS ידי החלת חילוץ כפול מרובע, מיצוי אחד לא לחלץ את כל EPS המבני. מיצוי ALE הוא שיטת חילוץ EPS קשה, שילוב ערבוב מתמיד עם תנאי חום אלקליין. מסיבה זו ייתכן כי חומר תאי כמה מופק יחד עם EPS. למרות תמוגה תא יכול להיגרם על ידי שיטות מיצוי פיסיקלי וכימי (sonication ^31,32, NaOH ^31,32, EDTA ^{11,32, 32} CER, חום ³² ו שיעורי גזירה גבוהה על ידי מ 'ixing ^19), בנוכחות חומר תאי EPS התאושש עדיין צריכה להיות מאומתת. הנכס היוני יוצרי ג'ל של EPS החילוץ הוא המוקד העיקרי של מחקר זה, אם EPS התאושש מכיל חומר תאי לא נותח. מחקר עתידי יתמקד בזיהוי חומר תאי בתוך EPS החילוץ.

Solubilizing המטריצה הידרוג'ל של AGS חיונית כדי לחלץ EPS המבני
צורות EPS מטריצת הידרוג'ל צפופה וקומפקטית ב AGS. למרות EPS מכיל שיעורים שונים של מקרומולקולות אורגניות כגון סוכרים, חלבונים, חומצות גרעין, (phospho) שומנים, חומרים humic וכמה פולימרי אינטר ^7,5,8, לא כולם יוצרים ג'ל. רק אלו פולימרים יוצרי ג'ל נחשבים כאן כמו פולימרים מבניים EPS.

מטרת עקירות EPS היא solubilize EPS הראשון ולאחר מכן לאסוף את EPS solubilized. אם EPS המבני (כלומר, tהוא EPS ויצרו הידרוג'ל) היא היעד של מיצוי, מטריקס ג'ל של AGS יש solubilized הראשון. שיטות יחידות שיכול solubilize מטריקס ג'ל מסוגלות לחילוץ EPS המבני. במחקר זה, כמה קרובות השתמשו בשיטות מיצוי EPS כגון צנטריפוגה ^{10 - 15,} sonication ^10,14,15, EDTA ^{10 - 12,14,15,} פורמלדהיד + NaOH ^{10 - 15} לפוראמיד + NaOH ¹³ לא יכול ביעילות לבודד את מבניים EPS. זאת בשל העובדה כי מטריקס הידרוג'ל של הגרגר האירובי לא היה solubilized בשיטות אלה. מסיבה זו, בדיקות יציבות בסעיף 4 בוצעו רק עם התנאים הנוכחיים EDTA, לפוראמיד + NaOH ו פורמלדהיד + מיצוי NaOH. עקירות שלוש אלה לא היו מסוגלים לבודד EPS המבני, אך עדיין השיגו את התשואה הגבוהה ביותר VS _EPS מלבד חילוץ ₃ Na ₂ CO. תנאי of החילוץ ₃ Na ₂ CO לא יושמו כפי שיטת החילוץ זה בבירור solubilized המטריצה AGS. לפיכך התנאים שיושמו בעת בדיקת יציבות נחשבו נציג.

הפקה עם שרף קטיוני (CER), אחר שיטת חילוץ EPS בשימוש התכוף, לא נחשבה לצורך השוואה זו, כמו במחקרים קודמים על מיצוי EPS עם CER לא הניבו תוצאות טובות יותר מאשר העקירות הכימיות המשמשות כאן.

ג'ל יוצרי EPS ב AGS
ג'ל יוצרי EPS נחשב EPS המבני במטריצה ​​הידרוג'ל של AGS. ראוי לציין כי ישנם סוגים שונים של הידרוג כגון ג'לי יוניים, ג'לים מושרה טמפרטורה וג'ל מושרה pH. מחקר זה מתמקד רק EPS יוצרות ג'לי יוניים. לגבי החלק הגדול של חומר ג'ל מבני חילוץ, זה עשוי להיות EPS מבני הדומיננטי. יש בהחלט אפשרויות שסוגים אחרים של EPSהטופס כי סוגים שונים של הידרוג'ל (למשל, ג'ל מושרה pH ²⁸⁾ קיים מהסוג הזהה או אחר של גרגר אירובי. אף על פי כן, לא משנה איזה סוג של הידרוג'ל הוא ממוקד, solubilizing מטריקס ג'ל EPS היא הצעד החשוב ביותר כדי לחלץ EPS יוצרי ג'ל.

נכון לעכשיו, מחקר קטן שנעשה על EPS המבני של בוצה פרטנית. מיצוי ALE המתואר בפרוטוקול זה הוא מסוגל להוציא EPS יוצרי הג'ל AGS וישמש במחקרים עתידיים לאפיין EPS המבני. מחקר נוסף צריך להיעשות על AGS, EPS המבני EPS הלא מבני כדי להבין טוב יותר את התהליך ותפקוד של פרור ו EPS. במיוחד בשלוש הנקודות הבאות צריכות להיחקר: למה מיקרואורגניזמים לייצר כמות כה גדולה של EPS, מהו ההרכב המדויק של EPS וכיצד הוא בהרכב EPS שהשתנה בהתאם לשינויים סביבתיים. זיהוי וניתוח כל התרכובות המעורבות interacti שלהםons יעזור להבין biofilms ואיך להשתמש בהם לטובתנו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 ml baffled flask	Kimble	25630-250
1,000 ml glass beaker	VWR	213-1128
RCT basic, magnetic stirrer with thermometer	IKA	3810000
sodium carbonate decahydrate	Merck KGaA	1063911000
50 ml centrifugation tubes	greiner bio-one	227261
Multifuge 1 S-R, centrifuge	Heraeus/Thermo Scientific	-
hydrochloric acid, 37%	Sigma-Aldrich	30721-1L-GL-D
250 ml glass beaker	VWR	213-1124
calcium chloride dihydrate	Merck KGaA	1023821000
1 ml Pasteur Pipette	Copan	201C