הכנת CD4<sup&gt; +</sup&gt; T תאים עבור ניתוח של ביטוי GD3 ו GD2 ganglioside ממברנה ידי מיקרוסקופית

Summary

אנו מתארים פרוטוקול מכתים נוגדן תקן לשימוש במיקרוסקופ כדי לקבוע את ביטוי הקרום ולוקליזציה של gangliosides ב מנוחה ותאי T מסוג CD4 ⁺ נאיביים אדם הופעל. כמו כן תארו הם ניסויים בזמן אמת באמצעות PCR <40,000 תאים שאינם דורשים ערכות RNA הקלט נמוכות נוספות.

Abstract

השיטות שתוארו לעיל לצורך הפעלה של תאים נאיביים CD4 ⁺ T השעיה ואת דבקותם ב coverslips לניתוח מיקרוסקופיה confocal לאפשר לוקליזציה מרחבים ובראייה של gangliosides מעורב הפעלת תא CD4 ⁺ T, כי ביטוי המשלים פרופיל ניסויים כגון cytometry זרימה, מערבי סופג או בזמן אמת PCR. כימות של ביטוי ganglioside דרך cytometry זרימת לוקליזציה הסלולר שלהם באמצעות מיקרוסקופיה ניתן להשיג על ידי השימוש של נוגדנים נגד ganglioside עם זיקה גבוהה וספציפי. עם זאת, גידול טיפול הולם של תאים בתרחיף כרוך בטיפול צלחות התרבות לקדם את דבקות הנדרשות עבור קרינה או רכישת מיקרוסקופיה confocal. בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול לקביעת ביטוי ganglioside GD3 ו GD2 ו colocalization עם TCR במהלך הפעלת CD4 ⁺ T תאים נאיבית. כמו כן, אמת tIME PCR ניסויים באמצעות <40,000 תאים מתוארים ביחס קביעת GD3 ו GM2 / GD2 גני synthase, הוכחה כי ניסויים בניתוח גנטי יכול להתבצע עם מספר נמוך של תאים וללא הצורך של ערכות RNA הקלט נמוכות נוספות.

Introduction

תאי CD4 ⁺ T לתזמר את התגובה החיסונית באמצעות פונקציות המפעיל שלהם לאחר הפעלה על ידי תאי מציגי אנטיגן ^1. המחקר של המנגנונים התאיים הם מווסתים במהלך ההפעלה מאפשר תובנה תהליך בסיסי של תפקוד מערכת חיסון. עם זאת, המחקר של תאי CD4 ⁺ T נאיבי יכול להיות מסובך, כי הם מייצגים אוכלוסייה קטנה מאוד של תאים בפריפריה דם ^2.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מספר דיווחים לומדים את הלוקליזציה של מולקולות שונות מעורבים הפעיל תא T מסוג CD4 ^+, בעיקר חלבונים הקשורים קרום הפלזמה ^3. Gangliosides הם המכילים חומצה sialic glycosphingolipids ולמרות שהם נחקרו רבות בתאי עצב היכן הם נמצאים בשפע, תאים אחרים כגון תאי מערכת החיסון גם להביע gangliosides עם פונקציות רלוונטיות מבחינה ביולוגית ^4,5. בעבר דיווחנו that במהלך ההפעלה של תאים אנושיים נאיבי CD4 ⁺ T קיימת הגברת הביטוי של α2,8 sialyltransferase ST8Sia 1 (synthase GD3) ואת synthase GM2 / GD2, כי לגרום neoexpression משטח משמעותי GD2 ואת הגברת הביטוי של GD3 ganglioside ^6. מחקר נוסף של GD3, GD2 ו gangliosides האחר בתאי מערכת חיסוניים יש צורך להשלים נוף חלק המבוסס על חלבונים של תפקוד מערכת חיסון.

בדרך כלל, המחקר הביטוי ganglioside מבוסס על טכניקות כגון כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) ^7, אבל טכניקה זו אינה מאפשרת לוקליזציה המרחבי של gangliosides על הממברנה פלזמה או בתאים subcellular, הגבלת ניתוח ביולוגי.

בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בתיווך נוגדנים ולוקליזציה של gangliosides GD3 ו GD2 בתאים אנושיים נאיבי CD4 ⁺ T ו PBMCs לאחר הפעלת אנטי CD3 / אנטי CD28. עם i זה בפרוטוקול זהגם אפשרי לנתח את הגן והביטוי המולקולרי של gangliosides במספר נמוך של התאים בתרחיף, עם הרכישה של תמונות באיכות גבוהה ^6, בהתחשב בגודל קטן של לימפוציטים (9 מיקרומטר).

Protocol

דם היקפיים מתורמים זכר בריא הושג עם הסכמה מדעת ואישור ועדת הביו-אתיקה של Centro de Investigaciòn en Dinámica Celular- Universidad האוטונומית del Estado de Morelos.

בידוד הפעלת 1. הנאיבי האדם CD4 ⁺ T תאים

1. אסוף 2 מ"ל של דם היקפיים נגזר מתורמים אדם בריא באמצעות הסכמה מדעת לדלל עם 2 מ"ל של PBS-EDTA סטרילי (בופר פוספט 1x (PBS), 2 מ"מ EDTA, pH 7.4). מוסיפים את דם מדולל לאט על גבי 3 מ"ל של תמיסת סוכרוז עם 1.077 צפיפות כפי שתואר לעיל ^8.
   הערה: הגירה דיפרנציאלי במהלך צנטריפוגה הנגרמת על ידי הבדלים בצפיפות תגרום אריתרוציטים משקעים לחלוטין שכבה של תאי mononuclear צפופים פחות תהווה לעיל. 2 מ"ל של דם היקפיים יעבד כ 0.5 x 10 ⁶ תאים מסוג CD4 ⁺ T נאיבי לאחר purificatiעל צעדים.
2. צנטריפוגה 30 דקות ב 250 XG ב 21 ° C (הרוטור לשימוש עבור צינורות תחתית עגולה עם בזווית קבועה של 30 מ"מ) ללא הפסקה כדי ליצור שיפוע של תאי דם היקפיים mononuclear (PBMCs). לאחר צנטריפוגה, PBMCs ניתן להבחין בבירור כמו טבעת לבנה. אסוף את PBMCs עם טפטפת להעביר צינור סטרילי לרחצה.
3. אחרי שלושה שוטף עם פתרון PBS-EDTA ב 250 XG במשך 10 דקות והמשך טיהור של תאים מסוג CD4 ⁺ T נאיבי. שיטות מיון או מספר סוגים של ערכות טיהור זמינות למטרה זו. רצוי, להשתמש> 1 x 10 ⁷ PBMCs לטיהור.
   1. לטהר נאיבי תאים מסוג CD4 ⁺ T על ידי סלקציה שלילית עם חרוזים מגנטיים. בצע סלקציה שלילית עם אנטי CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, אנטי TCRγ / δ, אנטי-HLA-DR, ו CD235a (א glycophorin) נוגדנים. להעריך את אחוז טוהר על ידי קביעת CD4 + CD45RA + תאים עד Fcytometry נמוכה.
      הערה: אם תרצה, תוכל להמשיך הדגירה של PBMCs לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עם צפיפות של 1 x 10 מ"ל ⁶ תאים / ב 10 מ"ל של מדיום בתוספת לקדם דבקות מונוציטים ולהמשיך עם טיהור תא נאיבי CD4 ⁺ T. ההתאוששות היעילה של תאים מהסוג CD4 ⁺ T נאיביים מדם היקפי תלויה במידה רבה על מערכת הטיהור.
4. כן צלחות תרבית תאי 24 גם על ידי הוספת 250 μl לכל טוב של PBS עם 5 מיקרוגרם / מיליליטר נוגדנים חד שבטיים CD3 אנטי דגירה במשך שעה לפחות 2 ב 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: צלחות עם 96 בארות ניתן להשתמש כאשר מספר קטן יותר מתאי CD4 ⁺ T נאיביים משמש (למשל, 2 x10 ⁴ -1 x 10 ^5).
5. הסר את דילול נוגדן CD3 אנטי מ -24 היטב או 96 צלחות היטב ולשטוף את הצלחות פעמיים באמצעות PBS 1x סטרילי.
6. לדלל את תאי CD4 ⁺ T הנאיביים עם> 95% של טוהר (CD4 +CD45RA +) לצפיפות של 1 x 10 מ"ל ⁶ תאים / במדיום מתקדמים RPMI 1640 בתוספת 3% בסרום שור העובר (או RPMI בתוספת 10% נסיוב), 2 מ"מ גלוטמין ואנטיביוטיקה (1 U / פניצילין מ"ל, 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין).
   הערה: אם לוקליזציה ganglioside נדרשת PBMCs, לעקוב אחר פרוטוקול זהה עבור דילול וגירוי כמתואר להלן.
7. הוסף 500 μl של דילול התא לבארות אנטי מצופה CD3 ו לבארות הלא מצופה (תאי שליטה) ב 24 את הצלחת היטב. לחלופין, להוסיף 100 μl של דילול התא אל הבארות של 96 את הצלחת היטב.
8. השלם את התנאים גירוי של תאים נאיביים CD4 ⁺ T בבארות אנטי CD3 מצופה על ידי הוספת 1 מיקרוגרם / מ"ל של נוגדן CD28 אנטי.
9. שמור על תאים מסוג CD4 ⁺ T נח כמו שליטה הבארות הלא מצופה ללא תוספת של נוגדנים CD28 אנטי. CD4 ⁺ T תא דגירה להשראה והופעל עבור 0 כדי 72 שעות בתנאים סטנדרטיים של 37 מעלותC ו 5% CO _2.
10. כדי לאמת הפעלה נאותה להעריך על ידי זרימת cytometry הביטוי של סמן ההפעלה מוקדם CD69 (16 שעות שלאחר הפעלה) או סמן הפעלה מאוחר CD25 (48 שעות שלאחר הפעלה) ב מנוחה והופעל תאי CD4 ⁺ T נאיביים וטופחו על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO ₂ ב היעדרותם ונוכחותם של CD3 אנטי / נוגדנים CD28 ^9,10.

דבקות 2. של מנוחה הופעלו תאים הנאיביים CD4 ⁺ T

1. לעקר 12 מ"מ עגול coverslips ידי מעוקר וחשיפה לאור UV למשך 15 דקות לפחות.
2. מקום coverslips צלחות תרבית תאים סטריליים 24 גם.
   הערה: עבור תרבויות עם פחות מ 1 x 10 ⁵ תאים עדיף להשתמש בתאי שקופיות עם בארות קטנות המותאמות למנוע פיזור של תאים coverslip.
3. coverslips מעיל (או תא שקופיות) עם 200 μl של פולי- L- ליזין (MW 150-300 KDA) 0.1% (w / v) פתרון דגירה במשך 5 דקות ב rטמפרטורת אום (RT), להסיר ויבש לפחות שעה 1 ב RT.
4. מערבב בזהירות ולאסוף להשראה והופעל תאי CD4 ⁺ T נאיביים מצלחות 24 גם. ספירת התאים ובמידת הצורך להתאים עם המדיום השלימו טריים להעביר 1 x 10 ⁵ תאים על coverslips מצופה פולי- L- ליזין. דגירה התאים למשך תקופה מינימלית של 6 שעות ב 37 ^מעלות צלסיוס ו 5% CO _2.

3. איסוף קיבוע של מנוחה הופעלו הנאיבית CD4 ⁺ T תאים

1. מוציא בזהירות את מדיום מנוחה תרבותית והופעלו תאי CD4 ⁺ T נאיביים.
2. הוסף 500 μl של RT סטרילי PBS לאט.
   הערה: בנוסף זהירות והסרת פתרונות מבארות מונע ניתוק של תאים מן coverslip.
3. בטל PBS ולהוסיף עוד 500 μl PBS להסיר תקשורת ותרבות ביסודיות.
4. תקן את התאים על ידי תוספת של 500 μl מסוננים 4% paraformaldehyde (filtמנת מסיר microparticles שיכול להפריע ניתוח מיקרוסקופיה) דגירה במשך 30 דקות ב RT (מועדף) או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
   זהירות: Paraformaldehyde הוא תרכובת רעילה ונפיצה. זה ידוע להיות קרצינוגן אדם. השתמש בזהירות עם פרוטוקול בטיחות מתאים.
5. הסר מקבע ולשטוף לפחות פעמיים עם PBS ב RT.
6. המשך לשלב הבא או לשמור על בארות צלחת עם 500 μl של PBS על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים עד מכתים.
   הערה: עקרות במהלך תהליך זה עוזר למנוע צמיחה מיקרואורגניזם.

4. מכתים, הרכבה ויזואליזציה ידי מיקרוסקופית Confocal

1. הסר את PBS מהבארות. הוסף 500 μl של חיץ חסימה קר (PBS 1x, 0.5% אלבומין בסרום תקן כיתה שור, 1% pH בסרום שור עוברי 7.4). דגירה במשך 20 דקות על קרח.
2. הסר את חוצץ החסימה בזהירות ולהוסיף הנוגדנים הראשוניים (R24 שיבוט אנטי gangliosides GD3, שיבוט GD2 14G2a),PE מצומדות CD25 אנטי APC מצומדות אנטי TCR ו isotypes שולטת מדולל חסימת חיץ 2.5 מיקרוגרם / מ"ל.
3. דגירה 2 שעות על הקרח או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: התסיסה מסלולית איטית עדיפה.
4. הסר את הנוגדן בזהירות ולהוסיף לאט 500 μl של PBS. חזור פעמיים.
5. מוסיפים את נוגדנים משני (IgG3 אנטי מצומדות FITC עבור GD3 R24 אנטי, Alexa פלואוריד 488 מצומדות או אלקסה פלואוריד 647 מצומדות IgG2a אנטי עבור 14G2a אנטי GD2) מדולל חסימת חיץ 0.1 מיקרוגרם / מ"ל.
6. דגירה במשך שעה 1 על הקרח בחושך בלי לרעוד.
7. לשטוף שלוש פעמים PBS כמתואר 4.4). שמור את הבארות עם מספיק PBS כדי למנוע התייבשות של דגימות.
8. להוסיף Hoechst 333,258 כתם מדולל PBS ל 0.1 מיקרוגרם / מ"ל.
9. דגירה 15 דקות ב RT ולהסיר. לשטוף שלוש פעמים PBS.
10. מניחים את השקופיות על מגבת נייר ולהוסיף 20 μl של פתרון גובר (גליצרול 50% ב- PBS) או פתרון גובר מסחריים כדי למנוע דהייה מרווה ממדגמים.
11. בזהירות להרים את coverslip עם פינצטה בסדר ומניח אותו על הפתרון הגובר. ודא שהצד של coverslip שבו התאים מחוברים נמצא בקשר עם הפתרון. חותם את coverslips עם לק ולנתח באמצעות קרינה או confocal.

בידוד 5. של RNA

1. כן נוגדני CD3 אנטי (5 מיקרוגרם / מיליליטר) מצופה 96-גם צלחות. דגירה 4 x 10 ⁴ תאים מסוג CD4 ⁺ T נאיבי / גם ב 100 μl של המדיום תרבות בתוספת נוגדנים CD28 אנטי (1 מיקרוגרם / מ"ל) כדי להשלים את הגירוי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עבור 0 כדי 72 שעות.
2. לאחר פעמים שלאחר הפעלה שונות למקם את התאים לתוך צינור microcentrifuge.
3. הוסף 500 μl של PBS ו צנטריפוגות ב 250 XG במשך 5 דקות ב RT.
4. הסר את supernatant ולהוסיף מגיב Trizol 1ml.
5. דגירה במשך 5 דקות ב RT ולשמור המדגם ב -8076; C במשך שעה 24 לפחות. המשך עם בידוד RNA בעת הצורך.
   הערה: השארת המדגם ב -80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות משפרת תשואת RNA. כמו כן, שימוש בכפפות יד חיוני כדי למנוע שפלת RNA על ידי RNases.
6. הפשר את המדגם על ידי דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות באמבט מים.
7. הוספת 200 כלורופורם μl ולנער במרץ ביד במשך 30 שניות (כדי למנוע ערבוב אגרסיבי של RNA על ידי vortexing). דגירה 5 דקות ב RT.
8. צנטריפוגה 15 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C.
9. לשחזר את השלב המימי לתוך צינור microcentrifuge חדש.
10. הוסף 500 μl isopropanol ו להפוך את הצינור שלוש פעמים.
11. דגירה 10 דקות ב RT ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C.
12. בטל supernatant על ידי היפוך.
13. הוסף 1 מ"ל של אתנול 75% קר קרח 10 דקות צנטריפוגות ב XG 12,000 ב 4 ° C..
14. לגמרי לבטל את supernatant ומייבשים גלולה RNA על ידי השארת את הכובע של הצינור פתוח.
    לֹאדואר: בשלב זה הגלול, אינו ברור. המשך בכל זאת.
15. Resuspend גלולה ב 20 μl של מי כיתה מולקולריים. חשב את הריכוז וטוהר של חומצות גרעין על ידי מדידת ספיגת 260 ננומטר ו -280 ננומטר באמצעות nanodrop.
16. המשך בזהירות סינתזה של cDNA באמצעות כל ערכת transcriptase הפוכה קונבנציונלית בעקבות פרוטוקול manufacturer's.
    הערה: כ 0.5-2 מיקרוגרם RNA מתקבל 4 x 10 ⁴ תאים מסוג CD4 ⁺ T נאיבי. cDNA ניתן synthetized מ 100 ננוגרם של רנ"א המשמש PCR תגובות בזמן אמת ללא צורך ערכות קלט RNA הנמוך.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה הופך באיכות טובה של בתרבית ולנוח דבקה והופעלו תאים אנושיים נאיביים CD4 ⁺ T (איור 1). התאים מופעל CD4 ⁺ T להראות את פרופיל שגשוג מאפיין (איור 1B) בהשוואה למצב המנוחה (איור 1 א). סמן ההפעלה מאו...

Discussion

הפרוטוקול המתואר יכול לשמש כדי לבצע לוקליזציה gangliosides או חלבונים השעיות התא של תאי CD4 ⁺ T או תאי חיסון אחרים (למשל, PMBCs, איור 5) החל ממספר קטן של תאים. בגלל גודלו הקטן של תאי T ומאפיינים לא חסידים, רכישת תוצאות תמונות מיקרוסקופיות קרינת מידע עני או באיכו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	12633-012	Suplemented with 3% FBS
mouse anti human CD3 antibody	eBioscience	16-0037-81	OKT3 clone
mouse anti human CD28 antibody	ebioscience	16-0288-81	CD28.6 clone
mouse anti human GD3  antibody	Abcam	ab11779	R24 clone
mouse anti human GD2 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-53831	14G2a clone
FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody	Abcam	ab97259
Alexa Fluor 488 conjugated antimouse	Thermo Fisher Scieni¡tific	A-21131
IgG2a antibody
Alexa Fluor 647 conjugated antimouse	Thermo Fisher Scieni¡tific	A-21241
IgG2a antibody
Hoechst 333258	Sigma-Aldrich	861405
Ficoll Paque-Plus	GE	17-1440-02
Trizol Reagent	Invitrogen	15596-026
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human	MACS Miltenyi Biotec	130-094-131
BD FACSAria II	BD Biosciences		Sorting
Nunc Lab-tek chamber slide system	Sigma-Aldrich	C7182
Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)	Olympus		Upright BX61WI and IX81
Forward sequence primer GD3 synthase	5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´		Ref. 7
Reverse sequence primer GD3 synthase	5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´		Ref. 7
Forward sequence primer GM2/GD2 synthase	5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´		Ref. 7
Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase	5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´		Ref. 7