ראפיד רכישת תמונות 3D באמצעות ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית episcopic

Summary

We describe a detailed protocol using high-resolution episcopic microscopy to acquire three-dimensional (3D) images of mouse embryos. This improved protocol utilizes a modified tissue preparation method to enhance penetration of the fluorescent dye, thereby permitting morphometric analysis of both small and large-sized specimens.

Abstract

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) morphometric data. Here, we describe the detailed protocol to image the entire mouse embryo. The protocol consists of four major sections: sample preparation, embedding, image acquisition and finally, 3D visualization. The technology requires specimens to be stained with a fluorescent dye, which can be problematic for large or dense specimens. To overcome this limitation, we have improved the existing protocol to enhance tissue penetration of the dye by pretreating the specimen with a solution containing urea and sodium dodecyl sulfate. The protocol uses only routine laboratory equipment and reagents for easy adaptation in standard laboratory settings. We show that the resulting high-resolution 3D images faithfully recapitulate the detailed morphologic features of the internal organs of mouse embryos, thereby permitting morphometric analyses. Together, we present a detailed and improved protocol using standard laboratory equipment to acquire high-resolution 3D images of small and large sized specimens.

Introduction

The advent of 3D imaging technologies has opened the possibility of systemic analysis of detailed morphological features during fetal development. A variety of 3D imaging modalities is now available include micro-magnetic resonance imaging (micro-MRI), micro computed tomography, high frequency ultrasound, optical coherence tomography, optical project tomography and episcopic microscopy^1-4. Each modality has its own unique features in resolution, contrast, speed, cost, in utero capability and availability.

Episcopic fluorescence image capture (EFIC) and high-resolution episcopic microscopy (HREM) are episcopic microscopy imaging methods⁴. Here, high-resolution serial images are captured continuously from the block face instead of tissue sections. The resulting images faithfully reflect detailed morphological features with minimal or no tissue distortion. The acquired volumetric data is readily converted to high-resolution 3-D images suitable for accurate morphometric analysis. Because of relative low cost and high resolution, HREM and EPIC have become the superior alternatives for systemic assessment of mouse models of human birth defects^2,4-8.

Both EFIC and HREM methods require specimens to be embedded in the suitable medium. EFIC detects autofluorescence emitted from the embedded tissue. Because of this, it is limited to specimens emitting high levels of autofluorescence but not those with relatively weak autofluorescence such as early stage embryos⁹. To overcome the dependency of autofluorescence, specimens are stained with a fluorescent dye such as eosin for HREM imaging. The choices of dyes and staining methods also make HREM more compatible to detect molecular signals in the context of tissue architecture and morphology^4,10.

In this article, we present an improved HREM protocol suitable for whole body assessment of the late stage mouse embryos. To facilitate staining, we include a pretreatment step to increase tissue penetration, thereby enabling HREM imaging of older mouse embryos.

Protocol

כל השימושים חיים מאושרים על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש בבית החולים לילדים בבוסטון.

לדוגמא הכנה 1.

1. הזדווגות מתוזמן
   1. מניחים זכר סוג בר C57BL6 ונקבה יחד באותו כלוב.
   2. בדוק להיווצרות פקק הזדווגות מוקדם למחרת בבוקר. תוספת ההזדווגות (aka, נרתיק או תקע הזדווגות) היא בתצהיר דביקות מוקשה שחוסם את הנרתיק.
   3. הגדר את התאריך תקע 0.5 היום העוברי (E0.5).
2. בידוד של עוברי עכברים
   1. להרדים נשים בהריון בחנק CO _2.
   2. שים עכברים פרקדן על כרית ספיגה ולרסס באזור הבטן עם אתנול 70%.
   3. הרם את העור ולעשות חתך 5 מ"מ ראשוני באזור בטן הזנב באמצעות מספרי כירורגיות. גזור להסיר עור הבטן כדי לחשוף את האיברים הפנימיים מלא
   4. חותכים ליד vaג'ינה להסיר את הרחם כולו.
   5. חותך בין אתרי השתלה לאורך קרן הרחם. מגזר או conceptus כל צריך רק עובר אחד בפנים.
   6. שמור מגזרי הרחם בופר פוספט קר כקרח 1x (PBS).
3. לנתיחה העובר
   1. מניחים כל conceptus בצלחת נפרדת עם קרים כקרח PBS תחת stereoscope.
   2. הסר רקמות רחם, שליה ואז ממברנות העובר ברצף באמצעות מלקחיים לנתח בסדר.
   3. מעביר את העובר גזור לצינור 50 מיליליטר עם קרח 1x PBS הקר בעזרת פיפטה העברה גדולה. הימנע להרים העובר ישירות עם מלקחיים כדי למזער את הנזק לרקמות.
4. קיבוע
   1. תקן את העוברים הגזורים ב 10% פתרון פורמלין שנאגר ניטראלי ב 4 מעלות צלזיוס במשך יותר מ -24 שעות עם כרכים מדגמים 10 לפחות של מקבע.
5. טיפול מקדים
   1. הכן את פתרון הסליקה: 4אוריאה M, 10% גליצרול, 4% נתרן Dodecyl סולפט (SDS) במים מזוקקים פעמיים.
   2. החלף את מקבע עם פתרון הסליקה.
   3. בעדינות לסובב את הדגימה על כיסא נדנדה בטמפרטורת החדר למשך 1 - 2 שבועות. להחליף את פתרון הסליקה פעם על השני וביום השלישי. הדגימה לאט מתבהרת שקופה.
   4. החזר את פתרון סליקה עם 10% פורמלין ולהשאיר על כיסא נדנדה עבור 2 ימים.
6. התייבשות
   1. שטפו את דגימות pretreated עם 1x PBS 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
   2. מייבשים דגימות בסדרה אתנול עולה בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה עדין. עבור עוברי E15.5, השתמש סדרת אתנול עולה כולל 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ו -100% אתנול, 2 שעות כל צעד. עבור עוברים מבוגרים, זמן הדגירה צריך להיות מוגבר.
7. הַכתָמָה
   1. כן הפתרון מכתים: להוסיף 0.1375 גרם Eosin Y Disodium מלח 0.0275 גרם של חמי acridine כתום (כלוריד אבץ) מלח 50 מ"ל של אתנול 100%. מערבבים עבור שעה 2. מסנן עם נייר סינון. אחסן בטמפרטורת החדר ולהימנע האור על ידי כיסוי ברדיד אלומיניום.
   2. עבר דגימת הפתרון המכתים במשך שעה 1.
   3. חלף עם פתרון מכתים טרי לילה כתם.
8. הִסתַנְנוּת
   1. הכן פתרון הסתננות: לשלב 100 מ"ל של פתרון א 'ערכת הטבעה JB-4, 1.25 גרם של Catalyst C, 0.275 גרם של מלח Eosin Y Disodium ו 0.055 גרם של חמי acridine כתום מלח (כלוריד אבץ). מערבבים לערבב (200 סל"ד) בתוך דלי קרח במשך 2 שעות, ולאחר מכן לסנן עם נייר סינון.
   2. אחסן את פתרון ההסתננות ב 4 ° C ולהימנע אור על ידי כיסוי ברדיד אלומיניום.
   3. מעבירים את העוברים על הסתננות פתרון: פתרון מכתים (1: 1), ו דגירה במשך שעה לפחות 3 על כיסא נדנדה ב 4 ° C.
   4. מעבירים את העוברים על הסתננות פתרון דגירה במשך 3 שעותr על כיסא נדנדה בחדר קר.
   5. חלף פתרון הסתננות פעם אחת בכל יום, ולהשאיר בחדר קר על כיסא נדנדה עדינה במשך שלושה ימים נוספים.

Embedding 2.

1. שמור פתרון B ו- הסתננות פתרון על הקרח.
2. הפוך פתרון והטבעה (01:25 של פתרון B ו- פתרון הסתננות) מיד לפני ההטבעה.
3. אוריינט הדגימה בתוך תבנית הטבעה, ואז לשפוך פתרון והטבעה קר לתוך תבנית ההטבעה בעדינות. Re-אוריינט בסיכה במידת הצורך.
4. בעזרת מערוך כדי לבדוק אם פתרון והטבעה הוא התגבש. לדחוף את גוש הדגימה, וקוצצים אותו במידת הצורך.
5. כיוון מחדש של גוש הדגימה באמצעות עובש נפרד להשיג אוריינטציה צלב.
6. שים בעל בלוק על גבי עובש הטבעה. בעדינות יוצקי פתרון והטבעה לתוך התבנית עד העובש בעל לחסום שקוע ידי הטמעת פתרון.
7. שמור את הדגימה במיכל משני ולהשאיר אותהעל קרח למשך 3 - 4 שעות במנדף.
8. אחסן את הדגימות הקרושה בתוך 4 ° C..
9. לקלף את עובש הטבעה. מכניס את הגוש תחת סטראו עם תאורה עקיפה לבדוק עמדה של הדגימה בבלוק. על פניו בלוק, קווי רשת סימן סביב הדגימה.
10. חתוך את הבלוק כדי להסיר גישת כמות הטבעת חומר באמצעות קווי רשת המסומנים אזכור.

3. Image Acquisition

1. הצמד את בלוק דגימת microtome ולקבל משטח טרי. סעיף עובי הגדר (למשל, e9.5-10.5, 1.5 מיקרומטר; e11.5-12.5, 2.0 מיקרומטר; e13.5-15.5, 2.5 מיקרומטר; E16.5-מבוגרים, 3 מיקרומטר). שמור את הדגימה / לחסום במיקום הבית של microtome.
2. הר מיקרוסקופ זום סטריאו אופקי מול פני הבלוק של דגימה.
3. הפעל את המחשב ואת מיקרוסקופ, ולהתחיל את תוכנת רכישת התמונה.
4. דמיינו ולמקד את אופטיקה לבלוק הפניםתחת מצב "תצוגה חיה" של תוכנת הדמיה.
5. יישר מיקרוסקופ microtome במידת הצורך כך פנים בלוק הוא במרכז הכוונת.
6. התאם זום כך לחסום הפנים כולו בתוך העינית.
7. בחר חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מסנן (עירור 470 ± 20 ננומטר, dichroic 495 ננומטר, פליטת 525 ± 25 ננומטר) ולמקד במידת הצורך.
8. מדוד ולהגדיר את זמן החשיפה באופן ידני (למשל, 80 - 400 מינים שניות).
9. לרכוש תמונות של פנים בלוק אחרי כל טריים ולשמור תמונות באופן אוטומטי במידת האפשר.
10. שיא פרמטרים חשובים כוללים רזולוציה, עובי הסעיף וזום.
11. לאחר שסיים את הדגימה כולה, ייצוא להמיר את כל קבצי תמונה בפורמט JPEG במידת הצורך.
12. הפוך את כל התמונות המקוריות באמצעות תוכנת עיבוד הדמיה, ולהתאים את הבהירות והניגודיות.
13. שמור את כל התמונות מעובדות בתיקייה נפרדת.

3D 4.רְאִיָה

1. העלה את כל התמונות מעובדות תוכנה להדמית 3D ביצוע ההוראות.
2. רזולוציית הקלט ועובי סעיף להמיר את כל התמונות כדי נתוני נפח (כלומר, voxel גודל) ולשמור את הקובץ 3D.
3. יישר את כל התמונות באמצעות במצב האוטומטי. התאם תמונות בודדות באופן ידני במידת הצורך.
4. שמור את התמונה מיושרת שם קובץ חדש.
5. לנתח תכונות morphometric של הדגימה באמצעות תוכנת הדמיית 3D.

תוצאות

דיווחנו תמונות HREM באיכות גבוהה של עוברי עכברים בין E9.5 ואת E13.5 ^8. איכות תמונה של העוברי מאוחר מבוים, לעומת זאת, נפגעת משמעותית בשל החדירה לרקמות המוגבלת של eosin צבע פלואורסצנטי. כדי להגביר את היעילות המכתימה, בדקנו מספר שיטות טיפול מקדימות תואמות ?...

Discussion

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שונה באמצעות ציוד מעבדה שיגרתי לרכוש תמונות HREM סדרתי תואמות להדמית 3D מהירה וניתוח morphometric של מבנים מורכבים. מכיוון התמונות ברזולוציה הגבוהה נלקחות ישירות מעל פני הבלוק במקום חלקים בודדים, תכונות מורפולוגיות בסדר נשמרות ושחזרו במהירות דיגיטל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	The Jackson Laboratory	C57BL6
Ethyl Alcohol	Pharmco-Aaper	111000200	200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade
Formalin	Sigma	HT501128-4L
Urea	Sigma	U5128	Clearing Solution
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	Clearing Solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Invitrogen	15525-017	Clearing Solution
Eosin Y Disodium Salt	Fisher scientific	BP241925	Infiltration Solution
Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt	Sigma	A6014	Infiltration Solution
Whatman paper	GE	3030-153
JB-4 Embedding Kit - Solution A	Polysciences, Inc.	0226A-800	Infiltration Solution
JB-4 Embedding Kit - Solution B	Polysciences, Inc.	0226B-30	Embedding Solution
JB-4 Embedding Kit - Catalyst	Polysciences, Inc.	02618-12	Infiltration Solution
Embedding Molds	Polysciences, Inc.	23185-1	16 x 8 mm
Peel-A-Way Sharp Embedding Molds	Polysciences, Inc.	18986-1	22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
JB-4 Plastic Block Holders	Polysciences, Inc.	15899
Disposable Graduated Transfer Pipes	VWR	414004-014
Petrl Dish	VWR	25384-088	Embryo dissection
Forceps Inox Tip	ROBOZ	RS-5015	Embryo dissection
Graefe Tissue Forcep	ROBOZ	RS-5153	Embryo dissection
Delicate Operating Scissor	ROBOZ	RS-6700	Embryo dissection
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes	Falcon	352059
50 ml Polypropylene Conical Tubes	Falcon	352098
Ice Bucket	Magic Touch Iceware International Corp.	R19-343
100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-766
330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-770
Sodium Chloride	MP Biomedicals	102892	PBS Solution
Potassium Chloride	Sigma	P0662	PBS Solution
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5405	PBS Solution
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	PBS Solution
Digital Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Microtome	Leica	RM2265
Illuminator	Carl Zeiss	HXP 200C
Fluorescence Stereo Zoom Microscope	Carl Zeiss	Axio Zoom.V16
Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Fiber Optic Light Source	Leica	KL 1500 LCD
Disposable Microtome Blade	VWR	95057-832
Single Edge Dispenser	Personna	62-0330-0000
ZEN	Carl Zeiss	pro 2012
Photoshop	Adobe	CS6 v13.0
Amira 3D Software	Visage Imaging	5.4
Computer	Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory
Rocking Platform Shakers	VWR	40000-304
Standard Hot Plate Stirrer	VWR	12365-382
Analytical Balance	Mettler Toledo	AB54-S