Assay מבוסס-הקרינה של פעילות פוספוליפידים Scramblase

Summary

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Abstract

Scramblases translocate פוספוליפידים ברחבי bilayer הממברנה באופן דו-כיווני בצורה ATP-עצמאית. Scramblase הראשון להיות מזוהה ומאומת ביוכימית היה opsin, את apoprotein של rhodopsin קולטי האור. Rhodopsin הוא G חלבון בשילוב קולטן מקומי ממברנות דיסק קולטי אור מוט של הרשתית שבו הוא אחראי על תפיסת האור. פעילות scramblase של Rhodopsin אינה תלויה ליגנד שלה 11- ציס -retinal, כלומר, opsin apoprotein פעיל גם scramblase. למרות פוספוליפידים מכוננים מוסדרים ערבול לשחק תפקיד חשוב בפיזיולוגית תא, רק כמה scramblases פוספוליפידים זוהה עד כה מלבד opsin. כאן אנו מתארים assay מבוסס קרינה של פעילות scramblase של opsin. Opsin הוא מחדש לתוך ליפוזומים unilamellar גדול המורכב phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol וכמות זכר PC שכותרתו NBD ניאון (1-palmitoyl-2- {6- [7-ניטרו-2-1,3-benzoxadiazole-4-י.ל.) אמינו] hexanoyl} - SN -glycero-3-phosphocholine). פעילות Scramblase נקבעת על ידי מדידת המידה שבה מולקולות NBD-PC ממוקמות העלון הפנימי של השלפוחית ​​מסוגלות לגשת העלון החיצוני שבו הקרינה שלהם מתבטלת כימית על ידי סוכן צמצום שאי אפשר לחצות את הממברנה. השיטות נתאר יש תחולה כללית והוא יכול לשמש כדי לזהות ולאפיין פעילויות scramblase של חלבונים בממברנה אחרים.

Introduction

Rhodopsin קולטי האור, קולטן חלבון בשילוב אבטיפוס G (הנסקרת למשל ביחס ^1), הוא scramblase פוספוליפידים הראשון להיות מזוהה מבחינה ביוכימית אומת ^2,3. Scramblases הם מובילי פוספוליפידים להגביר את הקצב האיטי מיסודם של transbilayer תנועה פוספוליפידים לרמות מתאימות פיזיולוגית בתוך דו-כיוונית, ATP-עצמאי באופן ^4-6. דוגמאות לפעולות שלהם ניתן למצוא ב reticulum endoplasmic הממברנה cytoplasmic חיידקים שבו מכונן ערבול דרוש הומאוסטזיס וצמיחת קרום, כמו גם עבור מגוון רחב של מסלולי glycosylation ^5. פוספוליפידים מוסדרים ערבול נדרשת לחשוף phosphatidylserine (PS) על פני השטח של תאים אפופטוטיים שבו היא פועלת כמו "לאכול-לי" -signal עבור מקרופאגים ⁷ והוא מספק משטח procoagulant על ​​טסיות הדם מופעל כדי לזרז את הייצור של גורם חלבוןs דרוש קרישת דם. בממברנות דיסק קולטי אור, פעילות הערבול של rhodopsin הוצעה כדי לנטרל את חוסר האיזון פוספוליפידים בין שני העלונים הממברנה של bilayer כי מופק על ידי ATP תלוי, השומנים חד כיווני flippase ABCA4 ^{4,8,9 10-12.}

למרות החשיבות פיזיולוגיות של scramblases, זהותם נותר חמקמק עד rhodopsin היתה כפי שדווח scramblase דיסקים קולטי האור ^2, בני משפחת חלבון TMEM16 זוהו Ca ²⁺ scramblases תלויי הדרושים חשיפה PS על הממברנה פלזמה (הנסקרת תוך התייחסות ^13), ואת החלבון חיידקי FtsW הוצע בתור ליפידים השנייה scramblase הדרושים לסינתזת פפטידוגליקן ^14. תגליות אלו התבססו על הכינון מחדש של חלבונים מטוהרים ליפוזומים והדגמה של הפעילות scramblase ב proteoliposomes וכתוצאה מכך באמצעות describ מתודולוגיהאד כאן. Scramblases פוטנציאליות נוספות ^15-21 - החלבונים MurJ ו AMJ מעורב ביוסינתזה פפטידוגליקן, WzxE וחלבונים הקשורים מעורב ערבול מבשרי O-אנטיגן, חלבון MprF צריכה translocate phosphatidylglycerol aminoacylated דרך הממברנה cytoplasmic בקטריאלי, ובני משפחה Xkr8 כי הוצעו לחשוף PS על פני השטח של תאים אפופטוטיים - להישאר להיבדק ביוכימית. זה מדגיש את החשיבות של assay חזק כדי לזהות ולאפיין פעילות scramblase.

כאן, אנו מתארים את הכינון מחדש של opsin המטוהר, את apoprotein של rhodopsin קולטי האור, אל שלפוחית ​​unilamellar הגדולה (חביב), ואת ניתוח בדיעבד של פעילות scramblase ב proteoliposomes וכתוצאה מכך באמצעות assay המבוסס-קרינה. ישנם מספר פרוטוקולים היטיבו לתאר זמינים בספרות לביטוי Heterologous וטיהור opsin, ולכן אנחנו לא לתאר את זה בפרוטוקול זה; אנו משתמשים בפרוטוקולים המתואר גורן ואח '. ³ אשר מניב FLAG-מתויג, opsin thermostable בסביבות 100 ng / μl ב 0.1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM).

כינון מושג על ידי טיפול חביב עם חומר ניקוי מספיק כך שהם להתנפח אבל אינם נמסים. בתנאים אלה, חלבון הממברנה - סיפק בצורת מיצלות חלבון-דטרגנט - ישתלב ליפוזומים הופכים מחדש לתוך הממברנה ליפוזום עם הסרת חומר ניקוי, וכתוצאה מכך proteoliposomes. כדי לשקם opsin (שהושג כמו פרוטאין טהור ב 0.1% (w / v) DDM), חביבי ערוכים מתערובת של POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine) ו POPG (1- Palmitoyl-2-oleoyl- SN -glycero-3- [-rac- phospho (1-גליצרול)]) ורווי DDM לפני הוספת opsin ו-PC NBD. הדטרגנט מוסר מכן על ידי טיפול המדגם עם חרוזי פוליסטירן.

הילדה = "jove_content"> העיקרון שבבסיס assay הקרינה המבוססת מוצגת באיור 1B. החביבים הם מחדש באופן סימטרי עם כמות זכר-PC NBD או אחרים כתב פוספוליפידים פלורסנט NBD שכותרתו (איור 1 א). על הוספת dithionite, dianion קרום impermeant, מולקולות-PC NBD בעלון החיצוני של חביבי ניתנים ללא ניאון כמו קבוצת ניטרו של NBD מצטמצם אמינו-קבוצה ללא ניאון. כמו לא מולקולות-PC NBD ולא dithionite מסוגלים לחצות את קרום על הזמן בקנה מידה של הניסוי (<10 דק '), זו התוצאה 50% הפחתה של אות ניאון. עם זאת, אם ליפוזומים הם מחדש עם scramblase, מולקולות-PC NBD בעלון הפנימי יכולים לזחול במהירות אל מחוץ שבו הם מופחתים. זו התוצאה של אובדן מוחלט של הקרינה במקרה האידיאלי (תרשים 1C).

es / ftp_upload / 54,635 / 54635fig1.jpg "/>
. איור 1: ייצוג סכמטי של assay פעילות scramblase את assay משתמשת שומנים כתבו ניאון שכותרתו NBD; NBD-PC מוצג (א). שלפוחית ​​unilamellar גדולה הן מחדש עם כמות זכר-PC NBD. כינון מייצר שלפוחית ​​סימטרית, עם NBD-PC מופץ באופן שווה את הכרוזים החיצוניים ופנימיים. Dithionite (S ₂ O ₄ ²⁾ כימי מפחית את הקבוצה נטר של NBD אל אמינו-קבוצה ללא ניאון. טיפול של ליפוזומים ללא חלבון עם dithionite (B, למעלה) גורמת ירידה של 50% של הקרינה מאז רק מולקולות-PC NBD בעלון החיצוני מופחתים: dithionite טעון שלילית ולא יכול לחצות את הממברנה להגיב עם מולקולות-PC NBD בעלון הפנימי. טיפול Dithionite של proteoliposomes המכילים opsin (B, למטה), כלומר, proteoliposomes scramblase-פעיל, התוצאות בהפסד 100% של fluorescence כמו opsin מקל תנועה של NBD-PC בין הפנימי לבין העלון החיצוני. (C) מראה עקבות קרינת אידיאליזציה מתקבלות על טיפול ליפוזומים חינם בחלבוני proteoliposomes המכיל opsin עם dithionite. שיעור הפסד קרינה הוא זהה בשני המקרים המציין כי הירידה הכימית של NBD ידי dithionite היא הגבלת קצב, וכי ערבול מתרחש בקצב שווה או גדול מהשיעור של התגובה הכימית. עקבות המתקבלות ניסוי בפועל מוצגות באיור 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

השיטות אנו מתארים ניתן להשתמש בו כדי לשקם ו assay חלבונים מטוהרים אחרים, כמו גם תערובות של חלבונים בממברנה שהושגו, למשל, על ידי מיצוי microsomes עם חומר ניקוי ^22.

Protocol

1. הכנה ליפוזומים Proteoliposomes

1. גיבוש liposome
   1. באמצעות מזרק זכוכית, להוסיף 1,435 μl POPC (25 מ"ג / מ"ל, כלורופורם) ו -160 μl POPG (25 מ"ג / מ"ל, כלורופורם) בבקבוק תחתית עגולה להשיג 52.5 μmol שומנים טוחנת יחס של POPC: POPG = 9: 1.
   2. ייבש את השומנים למשך 30 דקות באמצעות מאייד סיבובי במהירות סיבוב של 145 סל"ד (לא באמבט מים דרוש נפח זה של ממס), ולאחר מכן להעביר את הבקבוק כדי ואקום ייבוש לפחות 3 שעות, או הלילה, בטמפרטורת חדר (RT).
   3. מימה הסרט השומנים יבשים עם 10 מ"ל של 50 מ"מ HEPES pH 7.4, 100 מ"מ NaCl (להלן המכונה חיץ) על ידי מתערבל את הבקבוק בעדינות עד תוצאות ההשעיה הומוגנית, עכור;
      הערה: ריכוז השומנים בשלב זה צפוי להיות 5.25 מ"מ כמו שאף פסדים צריכים התרחשו עד כה.
   4. Sonicate ההשעיה באמבט מים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם תדר of 40 קילוהרץ. הפתרון ייראה קצת יותר ברור.
   5. שימוש מכבש, להעביר את ההשעיה 10 פעמים דרך קרום עם גודל נקבובי 400 ננומטר, ואחריו מחזור שני של שחול עם 4 עובר דרך קרום עם גודל נקבובי 200 ננומטר.
      הערה: הקוטר הממוצע של חביבי המתקבלים הוא ~ 175 ננומטר. במידת הצורך, את הגודל ואת ההומוגניות של חביבי ניתן לבדוק על ידי Dynamic Light פיזור על פי הוראות היצרן.
   6. לכמת את ריכוז פוספוליפידים של ההשעיה LUV כמפורט בסעיף 1.2).
      הערה: בגלל הפסדים במהלך שחול, הריכוז הוא בדרך כלל סביב 3.6 מ"מ.
   7. אחסן את חביבי ב 4 מעלות צלזיוס למשך כ 2 שבועות אם לא נעשה שימוש באופן מיידי.
2. כימות פוספוליפידים
   הערה: כדי לקבוע את ריכוז פוספוליפידים של ההשעיה LUV המשמש הכינון מחדש, כמו גם זה של proteoliposomes כי הם בסופו של דבר שנוצר, aliquot של המדגם הוא subjected לחמצון על ידי חומצה על-כלורית. הליך זה מתפרק פוספוליפידים לשחרר פוספטים אנאורגניים כי היא לכמת מכן על ידי assay colorimetric בהשוואה לתקני ^23.
   1. כן פתרון מניות 40 מ"מ של פוספט נתרן ₍₄ Na ₂ HPO) במים מזוקקים deionized.
   2. לדלל את פתרון המניות עם מים מזוקקים deionized להשיג 4 מ"מ ו -0.4 מ"מ עובד פתרונות שישמשו סטנדרטי כיול.
   3. באמצעות הפתרונות עבודה, להכין סטנדרטים 13 x 100 מ"מ ² צינורות זכוכית בטווח שבין 0 ל 80 פוספט nmol נתרן בנפח סופי של 50 μl.
   4. קח 10 μl כל אחת מהדגימות LUV ו proteoliposome כדי לכמת לדלל עם 40 μl של DDH ₂ O ב 13 x 100 מ"מ ² צינורות זכוכית.
      הערה: ככל ריכוז השומנים של חביבי ו proteoliposomes הוא בטווח 2.5-5 מיקרומטר, 10 μl של מדגם אמור להכיל 25-50 nmol זרחן השומנים.
   5. הוספת 300 μl perchloric חומצה לכל אחד מן הסטנדרטים דגימות וחום עבור שעה 1 ב 145 ° C בתוך גוש חימום. שים גולה על הצינורות כדי למנוע אידוי.
   6. תנו צינורות להתקרר לטמפרטורת החדר ומוסיפים 1 מ"ל של DDH ₂ O.
   7. להוסיף 400 μl כל אחד מוכן טרי 12 גר '/ ל אמוניום molybdate ו ascorbate נתרן 50 גר' / ל ו מערבולת לערבב.
   8. חום במשך 10 דקות ב 100 מעלות צלזיוס עם גולות על גבי הצינורות. הסר את הצינורות מגוש החימום ולתת להם להתקרר לטמפרטורת חדר.
   9. מדוד את הספיגה של הדגימות נגד (המדגם סטנדרטי המכיל פוספט נתרן 0 nmol) הריק עם ספקטרומטר באורך גל של 797 ננומטר.
   10. קבע את התוכן פוספט של דגימות נגד עקומת סטנדרט כיול.
3. כינון של opsin
   הערה: יש צורך לקבוע תנאי נפיחות אופטימליים עבור כינון מחדש כמו אלה תלוי אופיו של חומרי הניקוי, כמו גםכמו הרכב השומנים וריכוז של חביבי. כפי חביבים לשנות תכונות פיזור האור שלהם על נפיחות התהליך יכול להיות במעקב על ידי מדידה ספיגה (איור 2) כפי שנסקר על ידי ריגו, לוי ²⁴ ו Geertsma et al. ^25.
   1. פיפטה 800 μl של חביבי (מסעיף 1.1; התאוששות שומנים לאחר שהחול היא 70%, הריכוז הצפוי של חביבי הוא 3.6 מ"מ פוספוליפידים) לתוך צינור microfuge 2 מיליליטר.
   2. להוסיף 5.3 μl של חיץ ו 34.7 μl של 10% (w / v) DDM מומס חיץ א
   3. דגירה של 3 שעות בטמפרטורת החדר עם ערבוב הקצה על הקצה.
   4. בינתיים מכינים את חרוזי פוליסטירן:
      1. השתמש 400 מ"ג של חרוזים לדגימה ולשקול אותם בכוס זכוכית.
      2. לשטוף אותם פעמיים עם מתנול, שלוש פעמים עם מים ופעם עם חיץ א עבור כל שימוש כביסה צעד 5 מ"ל של נוזל ומערבבים לאט במשך 10 דקות.
         הערה: מומלץ להכין את פוליסטירןחרוזים במשך כמה דגימות בעת ובעונה אחת, למשל, לשקול 6 גרם של חרוזים ולשטוף עם 75 מ"ל של נוזל. חרוזים עודפים ניתן לאחסן במקרר למשך כמה ימים.
   5. במהלך יציבות שלפוחית ​​30 דקות של האחרון לייבש את פוספוליפידים NBD שכותרתו בתוך שפופרת זכוכית בורג מכסה ( "שפופרת זכוכית הכינון מחדש '): מדגם Per, 9.5 μl של NBD-PC (1 מ"ג / מ"ל ​​כלורופורם, מניב 0.4 mol% של פוספוליפידים סה"כ) הם מיובשים תחת זרם של חנקן בתוך שפופרת זכוכית מומס וכפועל יוצא מזה 45 μl של 0.1% (w / v) DDM ב חיץ א
   6. אחרי 3 שעות של יציבות שלפוחית ​​להוסיף פוספוליפידים מומס-NBD שכותרתו, החלבון-solubilized DDM ואת הצפת כך נפח סופי של 1 מ"ל מכיל 0.36% (w / v), כלומר, 7 מ"מ, DDM.
      1. לכן, כדי ליצור ליפוזומים חלבון ללא (המשמש מאז כמדגם שליטה) להוסיף 45 μl של-PC NBD (מומס 0.1% DDM), 60 μl של DDM 0.1% ו -55 μl של חיץ; עבור proteoliposomes להוסיף, לבחינהple, 40 μl של חלבון (מפתרון המניות אופייני ~ 110 ng / μl) ב DDM 0.1%, 45 μl של-PC NBD (מומס DDM 0.1%), 20 μl של DDM 0.1% ו -55 μl של חיץ .
         הערה: הסדר של תוספת צריך להיות כפי שרשום.
   7. מערבב את המדגם עבור קץ hr נוסף על הסוף בטמפרטורת חדר.
   8. הוסף 80 מ"ג של חרוזי פוליסטירן מוכן דגירה המדגם עם ערבוב הקצה מעל לקצה עבור שעה 1 ב RT.
   9. הבא להוסיף 160 מ"ג נוספים של חרוזי פוליסטירן דגירה עם ערבוב הקצה על הקצה במשך שעה 2 נוספת ב RT.
   10. מעבירים את המדגם (עזיבת חרוזי פוליסטירן בילה מאחורי) לצינור זכוכית בורג מכסה המכיל 160 מ"ג של חרוזי פוליסטירן טרי ומערבבים לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
       הערה: הדרך הקלה ביותר להעביר את המדגם ולהימנע מתחנפים חרוזים היא להשתמש פיפטה פסטר כי נדחק לתחתית שפופרת הזכוכית עם לחץ חיובי קטן. לאחר קצה פיפטה הוא בתקיפות בביתהחלק התחתון של הצינור, ואז המדגם ניתן למשוך בקלות ללא הפרעה מן החרוזים.
   11. למחרת בבוקר, להעביר את המדגם כדי צינור microfuge ללא ובה למעלה חרוזים ומניחים על קרח כהכנה assay פעילות scramblase.

2. Assay פעילות Scramblase

הערה: עוצמת הקרינה של ליפוזומים או proteoliposomes מדולל חיץ מנוטרת לאורך זמן על התוספת של dithionite בספקטרומטר קרינה. כדי לקבל עוצמת החל יציבה, הקרינה היא רשמה שני 50 לפחות (או עד אות יציבה מושגת) לפני הוספת dithionite מדגם לנער ללא הפסקה ולאחר מכן הוא במעקב במשך לפחות 500 שניות לאחר הוספת dithionite.

1. להוסיף 1,950 μl של חיץ א 'עד קובט פלסטיק המכיל ומערבבים-מיני בר.
2. הוסף 50 μl של proteo המוכן (ליפוזומים) ולתת המדגם לאזן את spectro הקרינהמטר עם ערבוב מתמיד במשך כמה שניות.
3. בינתיים מכינים תמיסה של 1 M dithionite ב 0.5 M unbuffered טריס (למשל, עבור שני מדגמים לשקול את 20 מ"ג של dithionite בתוך שפופרת microfuge ו להתמוסס 114 μl קרים כקרח 0.5 M טריס ישירות לפני השימוש ולשמור על הקרח עבור הבא לִטעוֹם).
   הערה: פתרון dithionite חייב להיות מוכן טרי ולא צריך לשמש יותר מ 20 דקות לאחר הכנה; אם מדידות רבות הם להיעשות, aliquots של dithionite יכול להישקל החוצה מראש ופיזר ממש לפני השימוש.
4. הפעל את ניטור הקרינה (עירור 470 ננומטר, פליטת 530 ננומטר, ושיסף ננומטר 0.5 רוחב).
5. הוסף 40 μl של פתרון 1 M dithionite ל- SEC 50 קובט לאחר תחילת הקרינה הקלטה (להשתמש מחצה במכסה של החדר קובט אם אפשר) ולהמשיך להקליט את הקרינה במשך שניות 400-600 נוספת.
6. לנתח את הנתונים כפי שתואר בסעיף 3.

3.ניתוח נתונים

1. קינטיקה של ערבול
   1. לאפיין את עקבות הקרינה של כל מדגם המתקבל על ידי assay פעילות scramblase ידי הגדרת הקרינה הראשונית, F _אני, לפני הוספת dithionite, ואת קרינת נקודת סיום, F, הגיע לאחר> 400 שניות. _אני F נקבע עבור כל דגימה כערך הממוצע של קרינה לתקופת 30 שניות לפני תוספת של dithionite.
   2. קבע את נתוני נקודת הסיום המתאים את היקף הפחתת קרינה, R = 100 • F / F _i. אנו משתמשים _L R התנאים ליפוזומים חלבון ללא ו- R _P עבור proteoliposomes המכיל opsin.
2. קביעת המשקל המולקולרי של Scramblase מחדש מהבחינה התפקודית
   1. המרת נתוני הפחתת קרינה על פי המשוואה הבאה:
      p (≥1 scramblase) = (R _P - R _L) / _{(מקסימום} R - R _L) (משוואה 1)
      הערה: איפה _{מקסימום} R הוא ההפחתה המקסימלי מתקבלת כאשר חלבון מספק מחדש כך שכל השלפוחית ​​במדגם להחזיק לפחות scramblase אחד פונקציונלי, p הוא ההסתברות כי שלפוחית ​​בפרט במדגם מורחב 'scramblase-אקטיבית " כלומר, הוא בעל לפחות scramblase אחד תפקודי. הערך עבור _L R הוא בדרך כלל 45% ³ ואילו R _{מקסימום} הוא בדרך כלל 82.5% ^3, במקום _{(מקסימום} R יכול להיקבע באופן ניסיוני עבור proteoliposomes opsin עם PPR של> 1 מ"ג / mmol) 100% צפוי. כפי R _{מקסימום} <100% הנחה היא כי שלפוחית ​​תת-אוכלוסייה של הוא עקשן כינון מחדש. _מקס R = 82.5%, את החלק היחסי של שלפוחית ​​כי אינה יכולה לקבל חלבון הוא 0.35.
   2. תאר את היחסים בין p (≥1 scramblase) ומקום מגורי הקבע (פוספוליפידים חלבון / מילימול מ"ג) על ידי הסטטיסטיקה פואסון כדלקמן:
      p (≥1 scramblase) = 1 - e -m = 1 - exp (-PPR / α) (משוואה 2)
      הערה: כאשר m = מספר scramblases לכל שלפוחית ​​α =-מונו מעריכית מתמדת בכושר ביחידות של פוספוליפידים חלבון / מילימול מ"ג.
   3. כשבר של השלפוחית ​​אינו תורם ערבול אפילו PPR גבוה (ראה דיון), לשנות את המשוואה:
      p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (משוואה 3)
      הערה: איפה PPR * = PPR / (1- ו), כאשר f הוא האוכלוסייה העקשנית של שלפוחית ​​או, במקרה זה, PPR * = PPR / 0.65 (משוואת 4).
      הערה: α הקבוע בכושר נקבע על ידי התאמת גרף של p (≥1 scramblase) לעומת PPR * עם פונקציה מונתה מעריכים. אם opsin (משקל מולקולרי 41.7 KDA) מבחינה תפקודית reconstitutes לתוך 175 ננומטר בקוטר שלפוחית ​​(לכל אחד מהם יש שלפוחית ​​280,000 פוספוליפידים ²⁶⁾ בתור מונומר, α = 0.187 מ"ג מילימול ^-1. אם opsin dimerizes לפני כינון ³ להניב שלפוחית ​​scramblase-פעיל, אז α= 0.37 מ"ג מילימול ^-1. אם PPR ולא PPR * היו לשמש לניתוח, לאחר מכן את הערכים α המתאים יהיה 0.122 ו 0.244 מ"ג מילימול ^-1. הערכים החזויים אלה עבור α להניח שכל מולקולות opsin מבחינה תפקודית המוסמכות. אם רק חלק קטן של המולקולות מוסמך לטרוף שומנים, לאחר מכן את הערכים המתאימים של α יהיו גדולים.

תוצאות

אנו מתארים את הכינון מחדש של opsin לתוך חביבי לאפיין את פעילות scramblase שלה באמצעות assay המבוסס-קרינה. אנחנו מנתחים את התוצאות להציב גבול תחתון על השיעור של פוספוליפידים בתיווך opsin ערבול ולקבוע מדינת oligomeric שבו opsin reconstitutes תפקודי לתוך השלפוחית.

Discussion

את assay פעילות scramblase אפשרה לנו במקור לקבוע opsin שיש לו פעילות פוספוליפידים scramblase ^2. את assay גם אפשר לנו לאפיין את פעילות scramblase של opsin ידי בדיקה סגולית (השתמשנו במגוון של שומנים כתב שכותרתו NBD כגון NBD-phosphatidylethanolamine, שכותרתו עם NBD על שרשרת acyl כפי שמוצג על-PC NBD באיור 1 א &#...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850457C	POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids	840457C	POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	810130C	NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid	VWR Scientific	EM-5330	HEPES
NaCl	Sigma	S7653-1KG	NaCl
Dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310 5 GM	DDM
Fluorimeter cuvettes	sigma	C0918-100EA	cuvettes
Spectrofluorometer	Photon Technology International, Inc.	fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85%	Sigma	157953-5G	dithionite
GraphPad Prism 5 software			Prism
Tris Base	VWR	JTX171-3	Tris
LIPEX 10 ml extruder	Northern Lipids, Inc.		Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm	Sigma	28156-243	Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110607	400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110606	200 nm membrane
sodium phosphate	Sigma	S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm	VWR Scientific	47729-572	glass tubes
Perchloric acid	Sigma	30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Sigma	A-7302	ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma	A7631-25G	sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents	Bio Rad	1523920	polystyrene beads
2.0 ml Microtubes clear	VWR Scientific	10011-742	Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube	VWR Scientific	53283-800	Reconstitution glass tubes
Zetasizer	Malvern		DLS