מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Summary

אנו מדווחים פרוטוקול באמצעות תא קרינת מיון מופעל לבודד תאי דנדריטים plasmacytoid (PDC) עם טוהר גבוה ממח העצם של עכברי זאבת נוטה ללימודי תפקודיים של PDC.

Abstract

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

Introduction

Efficient separation of a cell population of choice from other cells enables studies of the population that may not be possible otherwise. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a method to enrich an interesting cell population with high purity. ^1,2 Different cell types usually express unique molecules, or a unique combination of several molecules, on the plasma membrane that can distinguish one cell population from another. Upon binding of these cell surface molecules by specific fluorescence-conjugated antibodies, a detecting machine called flow cytometer/sorter is able to excite and detect the light signals of different fluorescent dyes that represent different molecule markers on the cells at the single cell level. The combined information consisting of either the presence of a light signal (representing positive expression of the corresponding surface molecule) or the absence of a light signal (representing negative expression of a molecule) defines the phenotype of the cell. After passing through the detector, cells with the same phenotype of interest are diverted towards a designated collecting tube based on electrical charge.

FACS is broadly applied in various studies as long as the population to be enriched is labeled with fluorescence.^3-7 It has been used to separate immunoglobulin (Ig)A-coated bacteria from non-IgA coated bacteria in the gut microbiota ⁸ and sort genetically engineered cell populations expressing fluorescent proteins. ⁹ Importantly, it has the capacity to separate more than one population simultaneously, which not only saves time and reagents but also allows for more sophisticated study designs. ¹⁰ However, FACS also has its limitations. If a population of interest is very rare (less than 1%), the sorting efficiency may be reduced, causing significant cell loss. In addition, some antibody binding may activate intracellular signal transduction that induces functional changes of the sorted cell population. ¹¹ Therefore, the phenotype used for sorting should be selected carefully.

Other methods exist besides FACS that are also based on cell surface markers for the enrichment of specific cell populations, such as magnetic-activated cell sorting (MCS). ¹² Similar to FACS, magnetic beads-conjugated antibodies can target specific cell surface molecules. Upon antibody-antigen interaction, magnetic beads-coated cells can be separated from non-coated cells after passing through a magnetic field. However, only a limited number of molecules can be targeted in MCS, as magnetic beads are, unlike various fluorescent colors in FACS, undistinguishable. It is thus difficult for MCS to define a cell phenotype with a complicated combination of surface markers. ^13,14 In addition, MCS is also able to cause unintended activation of target cells.

In our studies of a mouse model of systemic lupus erythematosus (SLE), ¹⁵ we intended to purify plasmacytoid dendritic cells (pDC) to investigate their functional changes with disease progression. We first used MCS to enrich pDC from the bone marrow by targeting PDCA-1, a molecule highly and uniquely expressed on murine pDC at steady state. ¹⁶ However, the cell purity was unexpectedly low, likely due to the upregulation of PDCA-1 on other cell populations in an inflammatory environment such as SLE.¹⁶ Ultimately, we have used FACS with a combination of four surface markers (CD11c, CD11b, B220 and PDCA-1) to separate high-purity pDC as CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+ population. Murine pDC has another specific surface marker Siglec-H. We decided not to use Siglec-H, as antibody binding of this molecule represses the function of pDC to produce IFNα. ¹¹

Protocol

הערה: MRL / MP-פאס ^LPR (MRL / LPR) עכברים נוטה זאבת גידלו ומתוחזק מתקן הפתוגן ללא הספציפיים הבאים בדרישות של טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) וירג'יניה טק (מספר אבטחת צער בעלי חיים: A3208-01). מחקר זה בוצע בהתאם קפדן עם המלצות המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו תחת פרוטוקול IACUC # 12-062.

1. תא תרבות בינונית הצפת המיון

1. כן בינוני תרבית תאים מלא (C10) באמצעות RPMI 1640 בתוספת 10% בסרום שור עוברי, פירובט סודיום 1 מ"מ, 1% 100 ממ חומצות אמינו לא חיוניים, 10 HEPES מ"מ, 55 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, 2 מ"מ L- גלוטמין ו 100 U / ml פניצילין, סטרפטומיצין.
2. הכן חיץ מיון (HBSS-מלא) באמצעות תמיסת מלח מאוזן של 1x האנק (HBSS) השלימו עם 10 HEPES מ"מ, 2.5 מ"ג / מ"ל ​​אלבומין בסרום שור,0.05 מ"מ MgCl ₂ ו 0.2 U / ml I. DNase

2. עכבר Dissection

1. הכינו שתי מנות בקוטר 6 ס"מ המכיל 4 מ"ל C10. מניחים את הכלים על קרח.
2. להרדים את העכבר משאיפת CO _2.
3. קציר את הטחול ולשמור אותו בצלחת עם C10 על הקרח.
   1. הצמד את העכבר למטה עם הבטן כלפי מעלה על הצלחת הניתוח. לעקר את הגוף על ידי ריסוס אתנול 70%.
   2. חותך את העור להפריד את העור מקיר השריר מתחת לאורך קו אמצע הגחון מן מאחת הערווה עד הצוואר.
   3. חותך את העור לאורך הגפיים האחוריים מן החתך הראשון עד הקרסול.
   4. הצמד את העור לאחור בצדדים וחתך את קיר השרירים בצדי מהמקום החתך הראשון ממברנות.
   5. הצמד את קיר שרירי הגב בצד ימין של הראש.
   6. אתר את הטחול בצד הימני של העכבר מתחת המעי הדק ליד הקיבה. תרים קצה אחד של הטחול הדואר ולהפריד אותו מהבטן.
4. חותכים שתי הגפיים האחוריות החוצה, כולל עצם הירך לבין השוקה, ולהסיר את כל השרירים ככל האפשר.
   1. חותך את השרירים לאורך הגפיים האחוריים מהג'וינט האגן / הירך עד הקרסול עם מספריים חדים, מנסה להימנע כלי דם.
   2. הפרד את הגפיים האחוריים בגזירה במפרק האגן / ירך מפרק קרסול / רגל ללא חשיפת תוכן מח עצם.
   3. שרירים הנותרים נקיים על העצמות על ידי גירוד עם סכין גילוח שוב ושוב וחיתוך השרירים בנקודות המשותפות.
5. שמור את עצמות בצלחת 6 ס"מ המכיל 4 C10 מ"ל על הקרח. המשך ביתור העכבר הבא.

3. בידוד Splenocyte

1. Homogenize הטחול בעדינות עם בוכנת מזרק נגד מסננת תא 70 מיקרומטר על גבי הצלחת ובה C10 4 מיליליטר עד שלא חתיכות אדומות נראות.
2. להוסיף C10 נוסף 6 מ"ל לתוך צלחת דרך מסננתnd מכן להעביר את ההשעיה תא הכולל 10 מ"ל צינור חרוטי 15 מ"ל.
3. צנטריפוגה צינור החרוטים ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C.
4. לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 2 מ"ל 1 x תאי דם אדומים (RBC) חיץ תמוגה. לדגור על RT במשך 5 דקות.
5. לאחר דגירה, צנטריפוגות צינור החרוטים ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C.
6. לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 1 C10 מ"ל. לבטל את כל גושים גדולים (תאים מתים) ולשמור את הצינור על קרח למשך מאוחר יותר.
   הערה: אם יש הרבה גושים קטנים, להשתמש מסננת תא 70 מיקרומטר לסנן את ההשעיה תא פעם.
7. לספור את המספר הסלולרי עם trypan הכחול באמצעות דלפק תא אוטומטי.

4. בידוד תא מח עצם

1. מעבירים את העצמות עם 4 מ"ל C10 לתוך מרגמה ולהוסיף 6 C10 מ"ל לעשות נפח של 10 מ"ל C10 בסך הכל.
2. לפצח את העצמות בעדינות המרגמה באמצעות apestle.
3. מערבבים בעדינות עם העלי כדי לשחרר את מח העצם לתוך C10.
4. מעבירים את C10 10 מ"ל המכיל מח עצם לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל על הקרח דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. להוסיף C10 10 מ"ל טריים אל תוך המדוכה עדיין המכיל את העצמות.
   הערה: פיפטה הפתרון המכיל עד עצם מח ומטה מספר פעמים לפני שהם מעבירים דרך מסננים אם גושים אדומים גלויים.
5. חזור על שלבי 4.2 עד 4.4 פעמים. לאחר לשטוף האחרון, העצמות אמורות להופיע לבן.
6. צנטריפוגה צינור חרוטי 50 מ"ל ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C. בינתיים מכינים 5 מ"ל מוכן לשימוש בינוני שיפוע צפיפות בתוך שפופרת צנטריפוגות חרוטי 15 מ"ל ב RT.
7. לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 10 C10 מ"ל.
8. לאט שכבת השעית התא 10 מיליליטר על גבי מדיום שיפוע צפיפות 5 מיליליטר, שמירת ממשק ברור בין שני השלבים. ואז צנטריפוגות צינור חרוטי 15 מ"ל ב 1,363 גרם במשך 30 דקות בRT (20 מעלות צלזיוס) עם סט אץ כמו 9 האטה להגדיר כמו 0 (או הבלם OFF).
9. לאחר צנטריפוגה, להסיר את הפתרון העליון 8 מ"ל בזהירות ולאסוף את המעיל 2 מ"ל באפי על הממשק (שכבה של תאים mononuclear) לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל חדש.
10. להוסיף 12 C10 מ"ל קרח קר עד 15 מ"ל צינור חרוטי המכיל תאים mononuclear מח עצם, כובע ו להפוך כמה פעמים כדי לערבב היטב, אז צנטריפוגות צינור ב 800 XG במשך 10 דקות, 4 ° C.

5. מכתים פני התא עבור FACS

1. מכתים לדוגמא
   1. כן פתרון נוגדן אנטי עכבר CD16 / 32 (1 דילול 100 HBSS-מלא, 5 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי).
   2. לאחר צנטריפוגה בשלב 4.10, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 100 פתרון נוגדנים μl אנטי עכבר CD16 / 32 לחסום קולטני Fc על תאים mononuclear. דגירה על קרח למשך 10 דקות.
   3. הכן תערובת נוגדנים הקרינה מצומדות (נמלהi-עכבר CD11c-PE 01:40 דילול, אנטי עכבר CD11b-APC-Cy7 1:80 דילול, אנטי עכבר PDCA-1-FITC 1:40 דילול אנטי עכבר B220-V500 01:40 דילול HBSS- מלא כפי המומלץ על ידי היצרן ב 100 נפח סופי μl לדגימה).
      הערה: חשוב לכייל נוגדנים לפני השימוש.
   4. לאחר 10 דקות הדגירה בשלב 5.1.2, להוסיף 4 מ"ל קרח קר HBSS מלא צנטריפוגות ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C כדי להסיר מאוגד אנטי עכבר CD16 / 32.
   5. לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 100 תערובת נוגדנים μl הקרינה מצומדות. דגירה על קרח למשך 15 דקות בחושך.
   6. לאחר 15 דקות דגירה, להוסיף 4 מיליליטר קרח קר HBSS מלא צנטריפוגות ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C כדי להסיר נוגדני קרינת מצומדות מאוגדים.
   7. כן פתרון טעינת FACS (500 ng / ml DAPI ב HBSS-מלא).
   8. לאחר צנטריפוגה בשלב 5.1.6, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 500 μ; L FACS פתרון הטעינה. מעביר את השעית התא לתוך (צינור FACS) צינור תחתי עגול 12 x 75 מ"מ ולשמור את הצינור על קרח בחושך עד מיון בתוך השעה 1.
2. מכתים לפיצוי
   1. צינורות לייבל 6 FACS PE, APC-Cy7, FITC, V500, DAPI או בלא כתם. Splenocytes Aliquot ב 1 x 10 ⁶ תאים / צינור לתוך צינורות FACS, ולשטוף עם 4 מ"ל HBSS מלא ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C..
      הערה: השתמש DNA מחייבת הקרינה לצבוע, DAPI, להבחין בין תאים חיים מן התאים המתים. DAPI יכולים לעבור דרך קרום התא של תאים מתים (אבל לא של תאים חיים) ו- DNA כרומוזום לאגד.
   2. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 100 μl HBSS-מלא.
   3. בכל צינור FACS המתאים, להוסיף אחד נוגדנים הבאים: אנטי עכבר CD19-PE 01:40 דילול, אנטי עכבר CD11b-APC-Cy7 1:80 דילול, אנטי עכבר PDCA-1-FITC 1:40 דילול או B220-V500 01:40 דילול אנטי עכבר כפי שהומלץ על ידי manufacturer. השאירו את ^ה -5 (DAPI) ו ^-6 (בלא כתם) FACS צינורות כפי שהם. מערבבים היטב על ידי רועדת דגירה כל צינורות FACS על הקרח בחושך במשך 15 דקות.
   4. לאחר דגירה, להוסיף 4 מ"ל קרח קר HBSS מלא לתוך צינור כל צנטריפוגות צינורות FACS ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C.
   5. לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 500 קרח μl HBSS קר-מלא למעט גלולה בצינור שכותרתו DAPI, אשר resuspended ב 500 μl FACS פתרון הטעינה. שמירה על כל 6 צינורות על הקרח בחושך עד מיון.

6. מיון על הסדרן הנייד

הערה: מבצע של מיון הליך על cytometer והתוכנה טופל עם הדרכה מפורטת המסופקת על ידי החברה. בקצרה, אנו משתמשים 100 זרבובית מיקרון ב 20 psi, ריכוז תא היעד שנקבע בין 5 - 10 מיליון דולר מ"ל, ולהתאים יעילות עד 70% ומעלה (כלומר, סכסוכים הזמן תחת 30%).

1. הכן צינורות אוסף FACS עם 500 μl FBS / צינור המכיל 100 U / ml פניצילין, סטרפטומיצין.
2. להתאים את הפרמטרים פיצוי של סדרן התא באמצעות צינורות פיצוי חד כתם משלב 5.2.
   1. קלט 10,000 תאי צינור בלא כתם להגדיר שער שלילי עבור כל עוצמת פלורסנט.
   2. קלט 10,000 תאי צינורות פיצוי חד כתם אחרים כדי להגדיר שער חיובי עבור כל עוצמת פלורסנט.
      הערה: התוכנה מחשבת את הפרמטרים פיצוי אוטומטי.
3. השתמש מדגם אחד משלב 5.1 כדי להגדיר את השערים של אוכלוסיות תאים ממוינות על ידי הקלטת 3,000 תאים. באמצעות עוצמת פלורסנט כפרמטרים של X ו- גרף ציר Y, ​​אוכלוסיית תאי יעד השער באופן ידני כקבוצה של נקודות כנראה מופרדות נקודות אחרות.
   הערה: סט gating זהו גמיש שרירותי המבוסס על הדרישות של חוקרים. אם החוקרים מצפים טוהר גבוה יותר על בסיס סמנים אחד או יותר, להזיז את השערגבוה יותר על בסיס עוצמת ניאון המקביל.
4. טען צינור איסוף ולהתחיל למיין את אוכלוסיית תא המטרה.
5. שמור את צינור איסוף על הקרח לאחר מיון עד שכל דוגמיות נעשים.
6. להוסיף C10 קר קרח על צינור איסוף עד 4 מ"ל, כובע להפוך לערבב.
7. צנטריפוגה צינור האיסוף ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C, ולאחר מכן לשאוב supernatant, יוצא בסביבות 200 μl עם תא גלול ללא פגע.
8. להוסיף C10 קר קרח 1 מ"ל ל resuspend התא גלולה ולהעביר את כל השעיה התא לתוך צינור 1.5 מ"ל צנטריפוגות.
9. צנטריפוגה צינור 1.5 מ"ל ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C ו לשאוב supernatant, עוזב 100 μl עם תא גלולה ללא פגע.
10. אחסן את אוכלוסיות תאים ממוינים על הקרח עד לשימוש.

תוצאות

החוקרים בקשו להעשיר מח עצם PDC עם טוהר גבוה, וללא השפעת סוגי תאים אחרים, מן MRL / LPR נוטה זאבת עכברי שניהם בגיל צעיר ומבוגרים ללמוד את השינויים התפקודיים של PDC באשר ליכולתם לייצר IFNα. אסטרטגית הטיהור הראשונה השתמשה הייתה MCS, אשר, כפי שמראה איור 1, ה?...

Discussion

The protocol described in this manuscript is for high purity enrichment of live pDC that retain the ability to produce IFNα. The applications of this protocol include, but are not limited to, purification of pDC and/or any other mononuclear cells from the bone marrow of MRL/lpr and any other mouse strains for studies of cellular and molecular functions. Several critical steps in this protocol are to ensure high viability and purity of the sorted pDC. The first key step is the release of bone marrow from bones. To mi...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco by life technologies	11875-093
Fetal bovine serum	HyClone	SH30396.03
Sodium pyruvate	gibco by life technologies	11360-070
MEM non-essential amino acids	gibco by life technologies	11140-050
HEPES	gibco by life technologies	15630-080
2-mercaptoethanol	gibco by life technologies	21985-023
L-glutamine	gibco by life technologies	25030-164
Penicillin-Streptomycin	gibco by life technologies	15140-122
1x Hank’s Balanced Salt Solution	gibco by life technologies	14175-079
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376
MgCl2	SIGMA	M8266
DNase I	SIGMA	D4527
Red blood cell (RBC) lysis buffer	eBioscience	00-4300-54
Density gradient medium	GE Healthcare	17-1440-02	Ficoll-Paque Plus
anti-mouse CD19-PE	BD Pharmingen	553786
anti-mouse CD11c-PE	eBioscience	12-0114-82
anti-mouse CD11b-APC-CY7	BD Pharmingen	557657
anti-mouse PDCA-1-FITC	eBioscience	11-3172-81
anti-mouse B220-V500	BD Pharmingen	561226
DAPI	invitrogen	D3571
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec	130-092-786
BD FACSAria I flow cytometer	BD Biosciences	643178
BD FACS Diva version 6	BD Biosciences