JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.

Abstract

פיתוח חומרים ביולוגיים גדל באופן משמעותי את פוטנציאל שיגור תרופות למגוון של סוגי תאים ורקמות, כולל β-תאי הלבלב. בנוסף, חלקיקים ביולוגיים, הידרוג, ופיגומים גם מספקים הזדמנות ייחודית לניהול מתמשך, משלוח סמים לשליטה על בטא תאים בתרבית ו במודלי רקמה מושתלות. טכנולוגיות אלו מאפשרות בחקר גורמי התפשטות β-cell המועמד באמצעות איי שלמים ומערכת רלוונטית translationally. יתר על כן, בקביעה האפקטיבית ואת הכדאיות של גורמי מועמד בהמרצת ההתרבות β-cell במערכת תרבות היא קריטית לפני לנוע קדימה מודלי in vivo. בזאת, אנו מתארים שיטת שיתוף תרבות איי עכבר שלמים עם מתחם מתכלה של עניין (COI) פולי -loaded (לקטית-שיתוף גליקולית וחומצה) (PLGA) microspheres לצורך הערכת ההשפעות של שנגרם o שחרור באתרוגורמים mitogenic f על התפשטות β-cell. טכניקה זו מתארת ​​בפירוט כיצד ליצור microspheres PLGA המכיל מטען רצוי באמצעות ריאגנטים זמינים מסחרי. בעוד הטכניקה המתוארת משתמשת גורם הגדילה רקמת החיבור אנושי רקומביננטי (rhCTGF) כדוגמה, מגוון רחב של COI יכול לשמש בקלות. בנוסף, שיטה זו מנצלת 96-גם צלחות כדי למזער את כמות ריאגנטים צורך להעריך התפשטות β-cell. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות כדי להשתמש בביו-חומרים אלטרנטיביים אופייני תא אנדוקריניות אחרות כגון הישרדות תא ומצב בידול.

Introduction

β-תאי לבלב הם התאים היחידים המייצר אינסולין בגוף הם קריטיים לשמור על הומאוסטזיס הגלוקוז בדם. בעוד אנשים בריאים הם בעלי מסת β-cell מספיק ולתפקד להסדיר דם גלוקוז כראוי, אנשים עם סוכרת מתאפיינים המוני β-cell מספיק ו / או פונקציה 1,2. הוצע כי גרימת התפשטות β-cell יכול בסופו של דבר להגדיל β-cell המוני ולשחזר הומאוסטזיס הגלוקוז בחולי סוכרת 3. עם זאת, הערכה ואימות של תרכובות שגשוג פוטנציאל β-תא איי שלמים הכרחי לפני ניתן לפתח טיפולים יעילים. השתלת איי אדם cadaveric לתוך אנשים עם סוכרת משחזר הומאוסטזיס הגלוקוז בדם במשך זמן מה, אבל זמינויות ההצלחה של הליך ניסיוני זה הפריעו מחסור איי אדם זמינים להשתלה ועל ידי מוות בטא תא ומאחור האייםאה השתלת 4. אפילו עם גילוי הגורמים לגרום הכפל של תאים מייצרי אינסולין, אתגר גדול עדיין קיים במתן הגורמים הללו לאתרים רלוונטיים in vivo. אסטרטגיה אחת למסירה מקומית מתמשכת של תרכובות שגשוג β-cell היא פולי (לקטית-שיתוף גליקולית) חומצה (PLGA). יש PLGA היסטוריה של שימוש ב FDA אישר מוצרים משלוח סמים בשל בטיחות גבוהה, פריקות ביולוגית, קינטיקה שחרור המורחבת 5. באופן ספציפי, PLGA הוא קופולימר של lactide ו glycolide הזה מבזה באמצעות הידרוליזה עם מים או in vivo או בתרבות לחומצה לקטית וחומצה גליקולית, אשר מתרחשים מטבוליטים באופן טבעי בגוף. מתחם התרופה הכמוס יכול להשתחרר הסביבה על ידי שתי דיפוזיה ו / או מנגנוני שחרור מבוקר שפלים. Encapsulation של COI מספק הגנה מפני השפלה אנזימטי, שיפור הזמינות הביולוגית של מגיב לעומת unencapsulaטד COI 5. אנו ממליצים microspheres PLGA ניתן להשתמש כדי לנהל תרכובות המועמד איים שלמים בתרבות, ובסופו של דבר in vivo. בדיקת יעילותם של PLGA לנהל mitogens β-cell כדי איי vivo לשעבר היא קריטית לפני פרוטוקולי השתלת נחקרות.

נכון לעכשיו, אין טכניקה למדוד התפשטות β-cell בבעלי חיים. ניסויים להעריך את האפקטיביות של תרכובות שגשוג פוטנציאל in vivo ולכן יש לתת לכלב של תרכובות אלה לחיות חיים, עם דיסקציה עוקבות ועיבוד של pancreata עבור immunolabeling. פרוטוקולים כאלה הם יקרים ומייגעים, ודורשים המתחם להיות מערכתיים, ללא כל ערובה לכך שהם יגיעו האי. לעומת זאת, כמה הנציח קווי β-cell זמינים לחקר תאים מייצרי אינסולין בתרבות, אבל שורות תאים אלה חסרים את הארכיטקטורה איון environment נמצא אורגניזמים חיים 6. קווי β-cell הונצח גם מאופיינים כבעלי מידה רבה יותר של שכפול מ β-תאי אנדוגני in vivo, ובכך סיבכה ניתוח של תרכובות המשרים התפשטות. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול המשתמשת איים שלמים מבודדים עכברים בוגרים. בניגוד קווי β-cell, איים שלמים שומרים על ארכיטקטורת איון נורמלית. כמו כן, בניגוד הניסויים שנערכו in vivo, מתן תרכובות שגשוג ישירות איים שלמים תרבותיים מפחית באופן משמעותי את כמות ריאגנטים כי יש צורך למדוד במדויק התפשטות β-cell.

המחקר הנוכחי מנצל PLGA כדי לנהל COI, בדוגמה זו, גורם הגדילה רקמת חיבור אנושי רקומביננטי (rhCTGF). השיטה המתוארת כאן מקנה יתרון משמעותי על פני הממשל של מתחם גלם האי בתרבית שכן היא מאפשרת שחרור מתמשך של מתחם לתוך התקשורת דואר. יש לציין, assay זה יכול להיות שונה כדי לנהל מגוון רחב של חלבונים ונוגדנים מעניינים איים שלמים. השפעות על סוגי תאים אנדוקריניות אחרות, כולל תאי α, ניתן לנתח גם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים אושרו ובוצעו בהתאם הטיפול בבעלי החיים המוסדי ונדרבילט ועדת השימוש.

1. תיוג COI עם Fluorophore (אופציונלי)

  1. בחר צבע פלואורסצנטי כי יגיב עם אמין ראשוני חינם (למשל, על חלבון), כגון אסטרים succinimidyl או נגזר והעמסה, לדמיין מטען microsphere. ממיסים עודף 8x טוחנת (יחסית שומות של COI) של fluorophore לתוך 200 μl של sulfoxide דימתיל (DMSO).
  2. Resuspend 50 מ"ג של COI עד לנפח סופי של 800 μl בתמיסת רכב (ריכוז סופי של 62.5 ng / μl). פתרון הרכב ישתנה בהתאם למקור של יוקר המחיה.
    הערה: פתרונות הרכב אופייניים כוללים בופר פוספט (PBS) או DMSO.
  3. להוסיף את כל הפתרון fluorophore / DMSO משלב 1.1 ו resuspend COI. וורטקס לילה ב 4 מעלות צלזיוס. לחלופין, מערבולת תערובת התגובה בטמפרטורת חדר(RT) עבור 4 שעות.
  4. בעקבות תגובת התיוג, להסיר fluorophore העודף באמצעות טור desalting.
    1. מסננים למאגר אחסון מעמודה desalting ולשטוף עם 16 מ"ל של מים ללא יונים. מחק את כל הזרימה דרך.
    2. מוסיפים את COI שכותרתו fluorescently לעמודה desalting. Elute עם 1.2 מ"ל מים ללא יונים לאסוף את הזרימה דרך.
    3. צעד elution לחזור על ארבע פעמים נוספות, ובכל פעם הוספת 1.2 מ"ל של מים ללא יונים ואיסוף את הזרימה דרך כמדגם נפרד.
    4. להקפיא את כל הזרימה שנאספה באמצעות דגימות ב -80 מעלות צלזיוס, Lyophilize פי הוראות היצרן למשך 24 שעות.

2. COI טעון הכנת Microsphere באמצעות מים ב-שמן-ב-המים אמולסיה מרככים אידוי השיטה

  1. הוסף 1 מ"ג של שכותרתו fluorescently COI 100 μl של מים ללא יונים כדי ליצור את שלב המים הראשון (W1).
  2. ממיסים 65 מ"ג של פולי (לקטית-שיתוף גליקולית ACIד) (50:50 lactide: glycolide, משקל מולקולרי 54,000 - 69,000) ב 750 μl של dichloromethane בתוך שפופרת microcentrifuge. Ultrasonicate במשך 10 - 30 שניות (160 W) כדי לפזר את PLGA לחלוטין. זו יוצרת את שלב הנפט (O).
  3. הוסף את כל שלב W1 שנוצר בשלב 2.1 לשלב O באופן טיפה חכמה. ת חלב באמצעות homogenizer כף יד ב -20,000 סל"ד למשך 30 שניות כדי ליצור את שלב W1 / O.
  4. הוסיפו את כל השלב W1 / O באופן טיפה חכם עד 15 מ"ל של פתרון 1% (משקל / נפח) פולי מימית (ויניל אלכוהול) (PVA) ו ת חלב באמצעות homogenizer כף יד ב -20,000 סל"ד למשך 30 שניות .
  5. להעביר את כל התחליב שנוצר בשלב 2.4 ל -200 מ"ל בבקבוק מסביב לתחתית ובכפוף ואקום 635 מ"מ כספית באמצעות המאייד רוטרי 1 hr להסיר את הממס וליצור את השלב מימית.
  6. Aliquot 1 מיליליטר של השלב המימי שנוצר בשלב 2.5 עד ארבעה עשרה צינורות microcentrifuge. צנטריפוגה הפתרון המימי בתוך צינורות microcentrifuge ב 7500XG במשך 8 דקות.
    הערה: בשלב זה, את microspheres נמצאים בתמיסה מימית הנותרים מרוכזים לתחתית הצינור microcentrifuge.
  7. מוציאים בזהירות 900 μl של בתמיסה מימית מן הצינורות microcentrifuge עם micropipette, pipetting כדי לא להפריע את microspheres על החלק התחתון של הצינור microcentrifuge.
    1. שטפו את microspheres של עודף PVA ידי הוספת 1 מ"ל deionized על צינור אחד microcentrifuge. צנטריפוגה ב 7500 XG במשך 8 דקות, ושוב להסיר בזהירות 900 μl של בתמיסה מימית מן הצינורות microcentrifuge עם micropipette, pipetting כדי לא להפריע את microspheres על החלק התחתון של הצינור microcentrifuge.
      הערה: בתמיסה מימית 100 μl הנותרים מכיל את microspheres שנוצר.
  8. להקפיא את פתרון microsphere המימי שנוצר בשלב 2.7 ב -80 מעלות צלזיוס.
  9. microspheres Lyophilize באמצעות lyophilizer פי יצרןהוראות ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
    הערה: התייעלות הטעינה של COI ידי המסת לחלוטין microspheres PLGA וקביעת ביחס חלבון ריכוז כדי עקומת סטנדרט של החלבון חינם 7.
  10. כביקורת שלילית, ליצור קבוצה של microspheres "ריק" (להלן המכונה microspheres שליטה).
    הערה: הדור של microspheres שליטה זהה לדור של microspheres COI טעון הידרופילי, ללא תוספת COI 800 μl של פתרון הרכב בשלב 1.2. חלקיקים שליטה התאמה בריכוז מסה יחסית PLGA כדי microspheres PLGA טעון COI עבור assay mitogen β-cell.

מדיה 3. הכנת איילט תרבות מדיה טרום assay

  1. הכן 200 מ"ל התקשורת לתרבות של איים עכבר ללא פגע: RPMI 1640 מדיה בתוספת 11 גלוקוז מ"מ, סרום סוס 10%, 100 U / G פניצילין מ"ל ו 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין (להלן המכונה הואנתן תקשורת ותרבות).
    הערה 1: בניגוד בסרום שור העובר (FBS), סרום סוס חסר השליה לקטוגן, גידול inducer של התפשטות β-cell, אשר מקעקעת ניתוח ב assay שגשוג.
    הערה 2: ככל microspheres PLGA אינו מעוקר לפני השימוש, התוספת של אנטיביוטיקה לתקשורת התרבות היא חיונית כדי למנוע זיהום מיקרוביולוגית.
  2. הסר 25 מ"ל של התקשורת בתרבות איון עם פיפטור ומקום אלקטרוניים צינור חרוטי 50 מ"ל. להשלים את 25 מ"ל של התקשורת בתרבות איון בצינור חרוטי 50 מ"ל עם ריכוז סופי של 0.2 מ"מ EGTA כדי ליצור את התקשורת מראש assay.
    הערה: התוספת של EGTA המעטה משחררת קשר תאי תאים בתוך האיים מבלי לשנות אדריכלות איון. החשבון זה יבטיח COI יכול להגיע התאים הפנימיים של האיון ומסייע למנוע נימק של האיון המרכזי.

4. Culturing של איי עכבר Intact

  1. לבודד איים שלמים מן זן שנבחר מראש, מין, agE, גנוטיפ של עכברים לאחר עיכול collagenase שגרתית של 8,9 הלבלב. ברכה יחד איים מן כמו דגימות.
  2. Aliquot 40 איים לתוך אחד טוב של צלחת בתרבית רקמה 96-היטב 200 μl של התקשורת בתרבות איון. איים בגודל התאמה ויזואלית לכל טוב (הערכה מדויקת של שקילות איון (IEQ) בין הדגימות אין צורך). מלאו בארות ריקות מייד בסמוך לבארות עם איים עם 200 מי μl סטרילי לספק חיץ אידוי. תרבות האי בתקשורת הלילה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת אווירה של אוויר 95% ו 5% CO 2.

5. מחדש השעיית COI טעון ובקרה PLGA מיקרוסכמות

  1. לאחר התאוששות איון לילה, microspheres גלולה ידי הוספת מדיה מראש assay כדי aliquot אחד microspheres PLGA COI טעון lyophilized כך הריכוז הסופי של COI בצינור microcentrifuge הוא 10 ng / μl (הסכום של ההווה COI ב כמות נתונה של micros שנוצרpheres נקבע שלב 2.9). Sonicate microspheres COI טעון resuspended באמבט מי קרח למשך 10 דקות ב 160 W עם 10 פעימות שניות ארוכות ב 4 ° C..
  2. microspheres מלא PLGA גלול ידי הוספת הנפח הזהה של תקשורת מראש assay אל מסה שווה של microspheres PLGA מלא lyophilized. Sonicate microspheres PLGA המלא המושעה באמבט מי קרח למשך 10 דקות ב 160 W עם 10 פעימות שניות ארוכות ב 4 ° C..
  3. ראייה לאשר microspheres מפוזרים על ידי pipetting 2 μl של microspheres resuspended בין שני coverslips זכוכית. דמיינו microspheres באמצעות המטרה 40X על מיקרוסקופ epifluorescence או brightfield.
  4. אם צבירה משמעותית של microspheres עדיין גלויה, sonicate באמבט מי קרח למשך 10 דקות נוספות ב 160 W עם 10 פעימות שניות ארוכות על 4 מעלות צלזיוס וחזור להדמיה של microspheres המושעה.

6. טיפול איי עם טעון COI או מיקרוסכמות בקרה PLGA

  1. עבור כל טוב להיות מטופלים עם microspheres הטעון COI, להכין תקשורת assay על ידי דילול 10 ng / μl של microspheres COI מושעה עם תקשורת מראש assay לנפח סופי של 100 μl וריכוז שנקבע מראש סופי.
    הערה: הריכוז הסופי האופטימלי של החלבון תשתנה עבור כל COI המשמש assay זה. באופן אידיאלי, מגוון של ריכוזי סופי נבדק.
  2. עבור כל טוב כדי לשמש כביקורת, להכין תקשורת assay מלאה על ידי דילול microspheres PLGA המלא המושעה שנוצר בשלב 5.2 עם אותו נפח הדילול נהג לדלל את microspheres הטעון COI בשלב 6.1.
    הערה: איים שטופלו תקשורת assay המלא ישמשו כביקורת שלילית כדי לאפשר זיהוי של מיעוט השפעתה של microspheres הריק אולי על תוצאות הניסוי.
  3. מוציאים בזהירות 100 μl של התקשורת בתרבות איון מכל טוב עם micropipette כזה שאף איים הם וחילצה מהבארות. בעדינות להוסיף 100 μl של תקשורת assay או 100 μl של תקשורת assay המלא כל טוב.
  4. דגירת איים ב 37 מעלות צלזיוס מתחת אווירה של CO באוויר 95% ו -5% 2 במשך שלושה ימים.

7. פיזור איי שלמים על שקופיות מיקרוסקופ

  1. אחרי שלושה ימים, להשתמש micropipette להסיר בזהירות וזורקים התקשורת assay מכל הבארות כדי שלא לעקור איים. בעדינות להוסיף 200 μl PBS כדי איים לשטוף אותם התקשורת assay. מוציאים בזהירות וזורקים PBS עם micropipette ולשטוף בעדינות איים שוב עם PBS 200 μl נוספים.
  2. הסר וזורקים PBS עם micropipette ולהוסיף 100 μl של טריפסין 0.025%, 2 פתרון EDTA מ"מ. לדגור על RT במשך 3 דקות. Pipet איים בפתרון טריפסין-EDTA למעלה ולמטה כל 2 דקות עד איים יאושרו חזותית להיות מפוזר לתוך תאים בודדים (שים לב שחלק גושים קטנים של תאים עשויים עדיין להיות נוכח) באמצעות מיקרוסקופ אור. מעביר את כל הנפח של כל טוב פרטly לתוך צינורות microcentrifuge labeled-.
  3. להוסיף 400 μl של התקשורת בתרבות איון על צינור אחד microcentrifuge לעצור את תא דיסוציאציה בתיווך טריפסין.
  4. צנטריפוגה דגימות במשך 5 דקות ב 100 XG ב 4 ° C. גלולות תאי איון לתחתית צינורות microcentrifuge.
  5. הוצא בעדינות supernatant באמצעות micropipette, ו resuspend גלולה ב 200 תקשורת טריה μl תרבות איון.
  6. באמצעות צנטריפוגות ציטומגלווירוס, צנטריפוגות ניתקה אי ב 140 XG במשך 3 דקות על גבי שקופיות מיקרוסקופ טעונות.
  7. שקופיות האוויר יבשות ב RT במשך 10 דקות, ולאחר מכן לצייר תיבה מסביב האי ניתק עם עט סימון הידרופובי.
  8. תקן תאים עם 75 μl paraformaldehyde% 4 (PFA) ב RT במשך 10 דקות. הסר PFA 4% לשטוף בעדינות תאים 75 μl PBS פעמיים. לאחר הכביסה, permeabilize תאים עם 75 μl 0.2% Triton X-100 ב PBS במשך 10 דקות. לאחר מכן, לשטוף תאים עם 75 μl PBS.
    זהירות: PFA ידוע להיות אלרגני, מסרטנים, ורעיל.

8. תיוג Immunofluorescence של האיים ניתקו עבור אינסולין ותא הפצת המרקר, Ki67

  1. הכן תא לח על ידי נחת שתי מגבות נייר רטובות בתחתית תיבת שקופיות מיקרוסקופ קיבולת 100 שקופיות.
  2. מקום מחליק שטוחים למטה (תאים הפונים כלפי מעלה) בתא לח. הכן דגימות עבור תיוג ידי aspirating את PBS לשטוף את השלב הקודם באמצעות micropipette והוסיף 75 μl של פתרון לחסימה (5% רגילים דונקי סרום (NDS) ב PBS) כל שקופית לחסום הלא ספציפי מחייב של נוגדני הדגימות. דגירת שקופיות בחסימת פתרון עבור שעה 1 ב RT.
  3. לשאוב בעדינות חסימת פתרון באמצעות micropipette ולהוסיף 75 μl של פתרון נוגדן ראשוני המכיל נוגדנים נגד אינסולין ארנב שפן ניסיונות אנטי Ki67, מדולל 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב 5% NDS ב PBS. לדגור על RT במשך שעה 1.
    הערה: סמנים אלטרנטיביים של התפשטות תאים כוללת מתרבים אנטיגן גרעין תא (PCNA) ו phosphohistone H3 (PH3),
  4. לשאוב בעדינות פתרון נוגדן ראשוני באמצעות micropipette ולשטוף את התאים עם 75 μl PBS. לשאוב PBS באמצעות micropipette ולשטוף תאים פעמיים נוספות, בכל פעם עם 75 μL PBS. דגירה כל דגימה עם 75 μl נוגדנים משני אנטי-גינאה חזיר Cy5 ו נוגדנים משני Cy3 נגד ארנב מדולל ל 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​חסימת פתרון עבור שעה 1 ב RT.
    הערה: אין להשתמש נוגדנים משני שכותרתו עם fluorophore זהה או חופפים ספקטרלית ששימש כבר לתייג את microspheres.
  5. פתרון נוגדנים משני לשאוב באמצעות micropipette דגירה 75 μl של 300 ננומטר DAPI ב PBS 3 דקות ב RT. לשאוב DAPI באמצעות micropipette ולשטוף במים deionized במשך 5 דקות.
  6. לשאוב בעדינות מים ממדגמים באמצעות micropipette. ספוט ירידה (בערך 100 μl) של פתרון גובר המתייבשים במהירות המכיל antifade מגיב על coverslip זכוכית. הפוך בצד מדגם שקופיות מיקרוסקופ למטה, on כדי הפתרון הגובר. לחץ בעדינות את coverslip נגד שקופיות באמצעות קצה pipet כדי להסיר בועות וימחה נוזל עודף עם רקמות לניקוי רהיטים רכים. אפשר coverslips לייבוש למשך הלילה ב RT.

9. רכישת תמונה וניתוח

  1. שימוש במיקרוסקופ epifluorescence עם מצלמה מחוברת לרכישת התמונה. עבור כל fluorophore, לקבוע את זמן החשיפה האופטימלית (בדרך כלל 20 msec עבור DAPI, 40 - 80 msec עבור אינסולין, ו -250 msec עבור Ki67). ודא פרמטרי רכישת תמונה שווים עבור כל הדגימות.
  2. עבור כל דגימה, לספור ידנית 3,000 תאים חיובי אינסולין מאותם לספור כמה הם גם Ki67 חיובי. רק לספור תאי אינסולין חיובי שיש להם מוגדר היטב וברור גרעין גלוי. חישוב אחוזי מתרבים β-תאים עבור כל דגימה על ידי חלוקת מספר Ki67 חיובי / תאים חיובי אינסולין על ידי המספר הכולל של תאים מייצרי אינסולין חיובי הכפלה 100.
  3. לאחר דetermining האחוז מתרבה β-תאים עבור כל דגימה, ולקבוע אם הבדל מובהק סטטיסטי בהתרבות β-cell קיים בין מלא דגימות ניסוי על ידי ניתוח תוצאות עם ANOVA חד-כיווני באמצעות תוכנה סטטיסטית זמינה מסחרי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

איור 1 הוא ייצוג חזותי של microspheres שנוצר באמצעות פרוטוקול לעיל. הפרוטוקול המתואר כאן תשואות microspheres הטעון rhCTGF בגדלים שונים. השבר הגדול של microspheres יהיה בין 1 ל -10 מיקרומטר קוטר, אם כי microspheres מסוים עשוי להיות גדול יותר (איור 2). אם ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

המחקר של התפשטות β-cell בתרבות נפגע בדרך כלל על ידי מספר קשיים. ראשית, קווי β-cell הנציח מאופיינים לתארים גבוהים של התפשטות ממה נמצא β-תאי אנדוגני איים חי. בנוסף, שורות התאים הנציחו אלה חסרות את הארכיטקטורה הנורמלית חיונית לתפקוד β-תא נורמלי. שתי עובדות אלו מקשות על מנת לקב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomerThermoFisher ScientificO6149For labeling COI with fluorophore
DMSO Dimethyl SulfoxideFisher BioReagentsBP231-1For dissolving fluorophore in step 1
Disposable PD-10 Desalting ColumnsGE Healthcare17-0851-01Desalting column used in step 1
Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000Sigma-Aldrich739960Used in generation of microspheres in step 2
Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000Sigma-Aldrich341584Used in generation of microspheres in step 2
RPMI 1640Thermo Scientific11879-020For culturing islets
Dextrose AnhydrousFisher BioReagents200-075-1Supplement for islet media
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333Antibiotics for islet media
Normal horse serumJackson ImmunoResearch008-000-121Supplement for islet media
96-well tissue culture plateCorning3603For culturing islets
Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acidSigma-AldrichE4378Supplement for pre-assay islet media
Cytospin 4 CytocentrifugeThermo ScientificA78300003For spinning cells onto microscope slides
EZ Single CytofunnelThermo ScientificA78710020For spinning cells onto microscope slides
Ethylenediaminetetraacetic acidFisher BioReagentsBP118-500Used in dissociating islets
paraformaldehydeSigma-AldrichP6148For fixing cells
Triton  X-100Fisher BioReagentsBP151For permeabilizing cells
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch017-000-121Blocking reagents for immunofluorescence
Anti-Ki67 antibodyabcamab15580For Ki67 immunofluorescence
Polyclonal Guinea Pig Anti-InsulinDakoA0564For insulin immunofluorescence
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-RabbitJackson ImmunoResearch711-165-152For Ki67 immunofluorescence
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea PigJackson ImmunoResearch706-175-148For insulin immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)ThermoFisher ScientificD1306For nuclei visualization in immunofluorescence
Aqua-MountLerner Laboratories13800Fast drying mounting media
FreeZone -105 °C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry SystemLabconco7382020For lyophilization of microspheres

References

  1. Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
  2. Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).
  3. Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
  4. McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823(2012).
  5. Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).
  6. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
  7. Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
  8. Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
  9. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255(2007).
  10. Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).
  11. Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).
  12. Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).
  13. Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).
  14. Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).
  15. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
  16. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
  17. Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).
  18. Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
  19. Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).
  20. Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).
  21. Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).
  22. Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
  23. Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).
  24. Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Bioengineering117cell

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved