חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Summary

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Abstract

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Introduction

Chloroplasts are dynamic organelles in plant cells responsible for photosynthesis and a host of other metabolic processes. Signaling pathways from the chloroplast also exert significant influence on plant physiology and development, coordinating plant responses to environmental stress, pathogens, and even leaf shape^1-6. Recently, biologists have gained interest in a poorly understood aspect of chloroplast structure: stromules, very thin stroma-filled tubules that extend from the surface of the chloroplast⁷.

The biological functions of stromules remain unknown, although stromule frequency is known to vary in response to environmental stimuli^7-9, and stromules may be capable of transmitting signaling molecules between organelles⁶. All types of plastids (not only the green, photosynthetic chloroplasts, but also clear leucoplasts, starch-filled amyloplasts, and pigmented chromoplasts, to name a few types of plastids) make stromules, and stromules are found in all land plant species that have been examined to date. Stromules can extend and retract dynamically, appearing or disappearing within seconds, or they can remain relatively stationary for long times. One of the major hurdles facing stromule biologists is that stromules are often studied using dramatically different methods, tissues, and species, making comparisons across the stromule biology literature difficult. Going forward, standard practices and thorough descriptions of the experimental systems used to study stromules will be critical to discovering the function of these ubiquitous features of chloroplast morphology.

Here we describe methods for visualizing stromule formation in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana leaves. In the mesophyll, chloroplasts are densely packed into large, three-dimensional cells, which makes it difficult to accurately and rapidly visualize stromules by confocal microscopy. By contrast, epidermal cells are relatively flat, contain fewer chloroplasts, and are at the surface of the leaf, allowing for easy and rapid visualization of stromules. N. benthamiana is an ideal model system for these experiments because, unlike many plant species, all cells in the epidermis of N. benthamiana make chloroplasts¹⁰. In the epidermis of most plants, including Arabidopsis thaliana, only the stomatal guard cells have chloroplasts, while other epidermal cells have "leucoplasts", plastids that are clear, relatively amorphous, and nonphotosynthetic^9,11,12. Thus, whereas a single field of view of an A. thaliana epidermis might show only a handful of chloroplasts in a pair of guard cells, a field of view of an N. benthamiana epidermis will include dozens or even hundreds of chloroplasts. All of the methods described here, however, can be modified to investigate other questions in stromule biology; for example, we have used the same approach to study leucoplast stromules of A. thaliana⁹.

Protocol

הערה: עבור פרוטוקול זה, התמקדנו מנסה לאמוד תדירות stromule באפידרמיס של נ benthamiana משאיר. כמה שורות מהונדסות יציבות נוצרו, שניתן להשתמש בם למטרה זו, כולל 35S _PRO: FNRtp: EGFP ¹³ ו NRIP1: ⁶ Cerulean. שתי שורות אלה מראים ביטוי חזק של fluorophores ב stroma הכלורופלסט של עלים גדלו תחת מגוון רחב של מצבים. לחלופין, fluorophores במיקוד הכלורופלסט עשוי לבוא לידי ביטוי זמני ב נ benthamiana באמצעות Agrobacterium טרנספורמציות ^13. זהו פחות אידילי הקווים המהונדסים, מאז חדירות Agrobacterium להשרות כמה תגובות הגנה בסיסיות ב נ benthamiana ואינטראקציות עם Agrobacterium יכול לשנות תדר stromule ב עלה ^14, פוטנציאל סיבוך הפרשנות של התוצאות. לבסוף, כדי לחזות היווצרות stromule במבחנה,כלורופלסטים עשוי להיות מופק כל מיני צמחים, באף אחת fluorophores מקודד גנטית או פלורסנט לצבוע, כמפורט בסעיף 5 להלן. ^9,15

הערה:. שיטות מפורטות לגידול צמחים תוארו בעבר ¹⁶ בקצרה, לגדול נ benthamiana צמחי 4 "סירים מלאים כל תערובת אדמה מקצועית המספקת ניקוז טוב. מכסים שתילים עם כיפת פלסטיק שקופה עבור 10-14 הימים הראשונים לספק סביבה לחה עבור נביטה. להוסיף שום תערובת דשן סטנדרטית הבאים בהוראות היצרן לגבי 14- צמחים בני יומם. לגדל צמחים תחת אור לבן, באמצעות ~ 100 μmol פוטונים מ ^-2 שניות ^-1 עוצמת האור. צמחי מים באופן קבוע.

1. דוגמאות ליף הכנות לקראת ויזואליזציה

הערה: דינמיקת Stromule מושפעת ופצע ^8, כך הכנת רקמה צריכה להתנהל באופן מיידי לפני חזותי stromuleים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. באופן אידיאלי, מדגם צריך להיות מדמיין עם 15 דקות לאחר הסרה מהמפעל.

1. גזור קטע קטן של העלה באמצעות סכין גילוח חד מאוד. השתמש תמיד באותו אזור של העלה לעקביות, ולהיות בטוח לדמיין אותו משטח (adaxial או abaxial) בכל הניסויים.
2. מייד לאחר חיתוך החלק עלה, להטביע את הסעיף עלה ב מזרק מחטי 5 מיליליטר מלא מים, להסיר אוויר מן המזרק, ולהחיל ואקום על ידי כיסוי פתח המזרק עם אצבע ומושך את הבוכנה.
   1. שחרר את הבוכנה בעדינות כדי למנוע נזק בסעיף עלה. חזור על שתיים או שלוש פעמים, או עד שרוב באוויר הוסר ואת העלה שנראה ירוק עמוק.
      הערה: צעד זה מסיר האוויר עלה כי יכול להפריע הדמיה מדויקת של stromules.
3. הוסף טיפה של מים לשקופית ומקום הסעיף עלה על ירידה זו. לאחר מכן, להוסיף עוד drאופ של מים לחלק העליון של העלה, במקום להחליק כיסוי על העלה. אם יש בועות אוויר, לטפוח בעדינות להחליק את המכסה עד שהם יוסרו. השקופית מוכנה כעת מיקרוסקופיה, וצריכה להיות מדמיין מייד.

2. חזותי Stromules עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי Confocal

1. עם אור מסור, להתמקד שדה הראייה סמוך למרכז בסעיף עלה (מן התאים שנפגעו סכין גילוח). השתמש אובייקטיבי 20X כך כלורופלסטים רבים ניתן דמיינו בו זמנית. שמירת תמונה עם האור המועבר כך סוגי תאים ניתן להבחין לאחר מכן, במידת הצורך.
2. החלף את מקור התאורה כדי ליזר עם מסנני עירור ופליטה מתאימים להיות השתמש fluorophore. לדוגמה, לרגש GFP עם לייזר 488 ננומטר ולאסוף פליטת בין 500 ננומטר ו 525 ננומטר.
   1. שימוש של תוכנת מיקרוסקופ, בחרו בערוץ GFP ולחץ להתאים את הצמצם חריר עד 1 Aiיחידת ר"י. בחר סריקת לייזר, להתחיל לדמיין את המדגם, ולאחר מכן לחץ על ערוץ ה- GFP כדי להתאים את עוצמת הלייזר ואת רווח גלאי כדי למזער את כוח לייזר תוך ביטוי חזותי stromules בבירור. לאחר הגדרות אלה נקבעו, לשמור אותם עקביים ככל האפשר לאורך כל הניסויים.
3. כן ניסוי z -stack כי יאסוף סדרה של תמונות דרך האפידרמיס עלה ב שדה הראייה.
   1. עבור z -stack, לכלול את כל כלורופלסטים אפידרמיס בתחום במטרה למנוע הטיה (למשל, אם כלורופלסטים קרובים לפני השטח עלה יש יותר stromules בתנאים הנבדקים).
   2. צלמו תמונות על מקסימום מרווח אפשרי שיכלול את כל stromules אבל למזער את הזמן הנדרש עבור -stack z. לדוגמא, אם 1 היחידה אוורירית שווה קטע confocal פוקוס כי הוא 2 מיקרומטר עמוק, לוקח תמונה כל 2 מיקרומטר הוא אידיאלי סביר.
      הערה: עלה epidermiהים הוא משטח אחיד, כך לעומק הכולל של z -stack ישתנה בהתאם המדגם; z ביותר -stacks ידרוש 10-20 תמונות, אך עשוי לכלול יותר.
   3. התאם את מהירות סריקה רזולוציית התמונה לפי הצורך כדי לוודא כי -stack z נאסף במהירות (בדרך כלל תוך 5-10 דקות, אם אפשר). שמור את z -stack לצורך ניתוח מאוחר יותר.

עיבוד תמונה 3.

1. לקבוע תדירות stromule באמצעות כל תוכנת ניתוח תמונה. עבור פרוטוקול זה, אנו ממליצים להשתמש ImageJ, אשר זמין בפומבי מן המכונים הלאומיים לבריאות (http://imagej.nih.gov/ij/), או שדרוג הפופולרי של ImageJ, פיג'י (http://fiji.sc / פיג'י).
2. מזג את z -stack לתוך תמונה אחת באמצעות הקרנת העוצמה המרבית בתוכנה.
3. לזהות באופן ידני לספור את כל כלורופלסטים בתמונה.
4. עבור כל הכלורופלסט, ויזואלית לקבוע אם stromules אחד או יותרנראים המשתרעת הכלורופלסט בתמונה -stack z הממוזגת. לדוגמאות, ראה איור 1.
   הערה: מאז התפקודים הביולוגיים של stromules אינם ידועים, כל דקה, מלא stroma, רחבת צינורי מן הכלורופלסט יכולה להיחשב "stromule", ללא קשר לאורך. ככלל, סיומת מלא stroma מן הכלורופלסט הוא stromule אם הוא פחות מ כ 1 מיקרומטר קוטר לאורך רוב אורכו ^7. ודא כי אדם אחד מנתח את כל התמונות כדי לשלוט על ההבדלים סובייקטיבית בקביעה האם או לא הכלורופלסט יש stromule. חוקר שני צריך לאמת את תדרי stromule עצמאי לצמצם הטיות סובייקטיביות נוספת.

4. עיצוב ניסיוני דגימה

הערה: תדירות Stromule הוא משתנה מאוד בין העלים, אבל כמה דיווחים מראים כי יש וריאציה מעט בתדירות stromule בתוך indivi^9,17 עלו כפולים.

1. חשב את התדירות עלה stromule של שדה יחיד מבט של עלה אחד. מחק את העלה, ולשקול את זה מדגם עצמאי. אל תחשבו שדות נפרדים של נוף נשקף עלה אחד כמו דגימות עצמאיות.
   הערה: אין הסכמה מוצקה לגבי כיצד שינויי המדד הטובים ביותר בפעילות stromule, ועד הפונקציה של stromules מוגדר בצורה ברורה יותר, חוקרים צריכים להמשיך להיות יצירתיים בכימות דינמיקת stromule. לשם השוואה על פני הספרות, לעומת זאת, סטנדרטים משותפים של דיווח אמורים לשמש בנוסף גישות יצירתיות יותר. לכל הפחות, תמיד לדווח על תדירות כלורופלסטים שיש אחד או יותר stromules.
2. מהי התדירות של כלורופלסטים שיש stromules בתוך שדה הראייה. השתמש ImageJ לזהות כל כלורופלסטים בתוך שדה הראייה. לאחר מכן, עבור כל הכלורופלסט, לקבוע אם הכלורופלסט יצר לפחות stromule אחד. דווח תדירות stromule כמו percentaGE של כלורופלסטים עם stromule.
   הערה: יש חוקרים להפוך האחוז, למשל עם שינוי arcsine, לפני דיווח תדרי stromule; בזמן הזה הוא אופציה לניתוח סטטיסטי, הארק-סינוס של תדר stromule אינו ערך אינטואיטיבי, ואינו צריך להיות מדווח בטקסט או הדמויות המרכזיות של המחקר.
   1. כגישה חלופית, לספור את המספר הכולל של stromules, ומחלקים אותו במספר הכולל של כלורופלסטים.
      הערה: ברוב המקרים, זו תניב תוצאות דומות להתקרב 4.2; זה יכול להעריך את תדירות stromule, אולם אם היה הכלורופלסט יחיד יצר רבי stromules. בדוגמה המוצגת תחת תוצאות נציג, למשל, כמה יש כלורופלסטים שניים או יותר stromules, העלאת מספר stromules לכל הכלורופלסט כדי 40/87 (לעומת תדר stromule של 33/87).
   2. לחלופין, לקבוע את אורך stromule במקום תדירות stromule. אורך ניתן למדודב ImageJ ידי התחקות stromule עם כלי שורת ביד חופשית.
      הערה: מאז התפקיד הביולוגי של stromules נותר עלום, לא ברור כי אורך stromule משפיע על התפקוד שלהם. דווח הבדלים משמעותיים באורך stromule אם הם נצפו, אלא גם לדווח על תדרי stromule (כמתואר 4.2).
      הערה: תדירות Stromule יכולה להיות משתנה מאוד בין עלים שונים באותם התנאים לצמיחה. לכן, על אף קביעת תדירות stromule יכול להימשך זמן רב, ניסויים צריכים להיות מתוכננים בקפידה על מנת לכלול מדגמים גדולים. באמצעות מערכי נתונים מהמעבדה שלנו, קבענו כי גודל מדגם של 16 צמחים לפחות עבור כל טיפול הוא בדרך כלל חזק מספיק כדי לקבוע אם קיים הבדל מובהק סטטיסטי של לפחות שינוי פי 1.5 בתדירויות stromule בין שני תנאים (עם תקן α = 0.05 ו β = 0.80).
3. ניתוח סטטיסטי של תוצאות.
   1. כדי להשוות את ליתדרי stromule של שני טיפולים, להשתמש במבחן t של וולש (הידוע גם בשם מבחן t בדיקה או לא heteroscedastic בהנחה שונה שוויוני).
      הערה: בדיקה זו אינה חזקה כמו מבחן t של הסטודנט הקונבנציונלי, אבל מבחן t של וולש יש יתרון משום שהוא אינו מניח ששונות חלוקת תדר stromule דומות בין טיפולים.
      הערה: מאז תדירות stromule היא "פרופורציה", חלוקת הדגימה שלו צפויה להיות הבינומי ולא נורמלי, אשר יכולים באופן תיאורטי ניתוח סטטיסטי מלוכסן אם מדגמים נמוכים מאוד או אם תדירות stromule היא נמוכה מאוד (קרובה ל 0%) או מאוד גבוה (קרוב ל -100%). כמה דיווחים השתמשו טרנספורמציות arcsine לפני ניתוח סטטיסטי, אשר נועד להפוך התפלגות הבינומית על התפלגות נורמלית, ובכך לספק את דרישות תקן של מבחן t של סטודנט או ANOVA. בפועל, עם זאת,יש טרנספורמציות rcsine מעט או אין השפעה על ניתוח סטטיסטי, ולכן אינם מומלצים. במקום זאת, לחזור על ניסויים כדי להגדיל את גודל המדגם, אשר יגדיל כוח סטטיסטי ולהפחית טעויות בפרשנות של נתונים.
   2. לא משנה מה משמש גישה סטטיסטית, הקפד לדווח על אסטרטגית הדגימה בזהירות, גודל מדגם, בדיקה סטטיסטית, וערך p עבור כל ניסוי.
      הערה: כמו עם שדות אחרים של ביולוגיה, ערך p פחות מ 0.05 עשוי להיחשב "מובהק סטטיסטי", אם כי חוקרים בהחלט צריכים לדווח על ערך p המדויק שהושג. אם p הוא מעט מעל 0.05, הגדלת גודל המדגם עם ניסויים שניים או שלושה יכול לעזור לברר אם או לא ההבדל שנצפה ניתן לשחזור ומובהק.

5. מחלץ כלורופלסטים Intact לדמיין Stromule Dynamics

הערה: מספר שיטותשמש לבודד כלורופלסטים מעלים, כולל פרוטוקול שונה במקצת במחקר שנערך לאחרונה על היווצרות stromule במבחנה ^15. הפרוטוקול כמפורט להלן משתמש בשיטה פשוטה יחסית שאינו להניב דגימות הכלורופלסט טהורות מבחינה ביוכימית, אך במקום לבודד כמות גדולה של שלמים, כלורופלסטים בריאים ^9,18.

1. הכן חיץ מיצוי קר: 50 מ"מ Hepes NaOH, 330 סורביטול מ"מ, 2 מ"מ EDTA, 1.0 מ"מ MgCl ₂ ו -1.0 מ"מ MnCl _2. התאם את ה- pH 6.9 עם NaOH ו HCl, ושומרים במקרר לפני השימוש.
   הערה: אמנם לא הכרחי, באמצעות מאגרים קר ושמירה על דגימות קרח במידת האפשר תניב שיעור גבוה יותר של כלורופלסטים ללא פגע.
2. הכן חיץ בידוד: 50 מ"מ Hepes NaOH, 330 סורביטול מ"מ, 2 מ"מ EDTA, 1.0 מ"מ MnCl _2, 1.0 מ"מ MgCl _2, 10 mM KCl, ו 1.0 מ"מ NaCl. התאם את ה- pH ל -7.6 עם NaOH ו HCl ושומרים במקרר לפני השימוש.
3. אם העלים אינםהבעת fluorophore סטרומה מקודדים גנטית, להכין diacetate carboxyfluorescein פתרון (CFDA): 50 מניות פתרון מ"מ CFDA ב sulfoxide דימתיל (DMSO) (CFDA 2.3 מ"ג 1.0 מ"ל DMSO).
   הערה: הריכוז המדויק אינו קריטי. שמור מניות CFDA בחושך בכל העת. אחסן aliquots קטן של 50 מ"מ CFDA ב -20 ° C.
4. כדי לבודד כלורופלסטים, להסיר ~ 5-10 עלים גרם מכמה צמחים ולשטוף בקצרה במים קרים. מיד להעביר 50 מ"ל מיצוי חיץ קר. עלים טוחנים באמצעות בלנדר עם כמה פולסים קצרים. סינון דרך שתיים או שלוש שכבות של גזה כדי להסיר שאריות עלים, לחלק את כלורופלסטים חילוץ לשתי צינורות 50 מ"ל צנטריפוגות, צנטריפוגות דקות 1 ב g x 750.
5. בטל supernatant ו resuspend כלורופלסטים ירוק חיץ בידוד 10 מ"ל. צנטריפוגה שוב 1 דקות ב 750 XG, להשליך supernatant, כלורופלסטים resuspend במאגר בידוד להביא נפח סופי 5 מ"ל.
6. העברת 201; l של כלורופלסטים לשקופית, ומכסים coverslip, ולהתחיל מיקרוסקופיה.
   הערה: כלורופלסטים מצמחים מהונדסים המבטא חלבוני ניאון במיקוד פלסטידה מוכנים כעת להדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal.
7. כתם כלורופלסטים מצמחים שאינם להביע חלבוני ניאון במיקוד פלסטידה לדמיין stromules.
   1. הוסף 5 μl של 50 המניות מ"מ CFDA אל 5 מ"ל-מושעה כלורופלסטים חיץ בידוד. תביא את הריכוז הסופי 50 מיקרומטר.
   2. אפשר כלורופלסטים כדי לדגור במשך 5 דקות, ולאחר מכן להעביר aliquot קטן (~ 50 μl) לשקופית, ומכסים coverslip, ולהתחיל מיקרוסקופיה.
   3. להשתמש במערך מסנן FITC או GFP. השתמש אובייקטיבי 20X לדמיין כלורופלסטים רבים בעת ובעונה אחת, או מטרה גבוהה יותר לדמיין הכלורופלסט יחיד מבודד.
      הערה: CFDA יהיה לזרוח בתוך stroma של כלורופלסטים ללא פגע.
   4. אם יש קרינת רקע חזקה, לשטוף את Chloroplasts שוב ב 10 חיץ מ"ל בידוד לאחר הדגירה 5 דקות עם CFDA, צנטריפוגות במשך 1 דקות ב 750 XG, להשליך supernatant, ו resuspend במאגר בידוד 5 מ"ל.

תוצאות

פרוטוקול זה שימש כדי להמחיש תדירות stromule ביום ובלילה של cotyledons של נ צעירים שתילי benthamiana. פרוסות מתוך ערימת z- מוזגו לתוך תמונה אחת (איור 1 א). למטרות חזותיות, הדימוי הזה היה אז desaturated ונהפך, כך stroma מופיע שחור (איור 1B). כלורופ...

Discussion

כאשר חוקרים stromules, שלושה גורמים חשובים חייבים להיחשב לכל אורכו: (i) מניפולציה של רקמות הצמח חייב להישמר עד למינימום הכרחי, (ii) מערכת הניסוי חייבת להישמר עקבית, וכן (iii) אסטרטגיות דגימה חייבות להיות מתוכננות בקפידה כדי להבטיח חזק, מנותחי נתונים לשחזור.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
Laser Scanning Confocal Microscope	Carl Zeiss Inc	Model: LSM710
Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	EMD	MX1458-6
Waring blender	Waring	Model: 31BL92
Fiji	fiji.sc		Open-source software for analyzing biological images