ואלקטרופורזיס פשוט עבור כימות של שחרור מלכודת לכלבים נויטרופילים תאיים

Summary

מלכודות תאי נויטרופילים (נטס) הן רשתות של DNA, ההיסטונים וחלבונים נויטרופילים. למרות מרכיב של התגובה החיסונית המולדת, רשתות מעורבות אוטואימוניות פקק. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד נויטרופילים כלבי וכימות של רשתות באמצעות assay קרינת microplate.

Abstract

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Introduction

ישנם מעל 70 מיליון כלבים בארה"ב בלבד ^1. כמו בני משפחה מוערך, החיות האלה זוכים לעיתים קרובות חיתוך טיפול רפואי קצה. פחות בגלל שהם חולקים הסביבה שלנו, כלבים יכולים לספק תובנות בפתוגנזה וטיפול של מחלות אנושיות ^1. עם זאת, אם תרגום תגליות ברפואה אנושית לתוך טיפולים וטרינריים או להיפך, חשוב לאפיין ביסודיות מיני וריאציות אפילו במערכות שמורות ביותר כמו התגובה החיסונית המולדת. דוגמאות של הבדלים בין הכלבים לבין מערכת חיסון מולדת אנושית כוללות ביטוי גבוה CD4 על נויטרופילים כלב ^2; בהעדר homolog תפקודית של IPAF חיישן flagellin ציטופלסמית בכלבים ³ ואת הביטוי של הכלאה caspase 1/4 ב טורפים ^4.

מלכודות תאי נויטרופילים (רשתות) הם מרכיבים גילה יחסית לאחרונה של חסינות מולדת ^5. הנטס הוא רשתהים של דנ"א, חלבונים גרעיניים ופרטניים פרסמו בתגובת מגוון רחב של גירויים דלקתיים או זיהומיות ^6. NET מבנים דמויי הודגמו פני מינים רבים, כולל תרנגולות ^7, דגים ^8, רכיכות ⁹ ו acoelomates ^10, אבל יש וריאציות מינים. לדוגמה, נויטרופילים murine להגיב לאט יותר לגירויים NETosis מ נויטרופילים אדם, ויוצרים פחות מפוזר ¹¹ נטס. ישנו גוף גדול של עדויות מינים רבים כי רשתות ללכוד חיידקים, ועוד שנויות במחלוקת עשויה להיות מעורבות ישירות להרוג פתוגנים ^12,13. עם זאת, רכיבים NET גם לשפר נזק לרקמות, לקדם פקקת ולפעול עצמיים ^14,15. האיזון בין ההשפעות החיוביות המזיקות של רשתות עשוי להשתנות בין מחלות שונות ומינים שונים, דבר המצביע חשוב לחקור רשתות הן המין ומצבו של עניין.

הנה אנחנומתאר פרוטוקול פשוט גרימה ומדידת שחרור נטס על ידי נויטרופילים כלבים. שיטה זו דומה לאלה המשמשים לבודד נויטרופילים ¹⁶ ולגרום NETosis במינים אחרים, אך התנאים כגון ריכוז אגוניסט וזמן הדגירה ממוטבים עבור נויטרופילים כלבים. Assay לשחרור DNA כימות NET דומה אף תואר במינים אחרים אבל השיטה המוצגת כאן גם מותאמת במיוחד עבור כלבים ^8,17,18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים בוצעו עם רשות הרמה האתית טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת איווה סטייט ועדת שימוש.

איסוף דם 1.

1. צייר 9 מ"ל של דם מתוך saphenous, וריד כאפאליך או הצוואר ישירות לתוך קרישה (למשל, חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 1.8 מ"ג K ₂ EDTA / מ"ל דם) vacutainers, או לתוך מזרק עם העברה מיידית צינורות דם המכיל EDTA. בעדינות לגלגל או להפוך את צינורות הדם כדי להבטיח ערבוב הנאות של דם קרישה אנטי.

2. בידוד נויטרופילים

1. בתוך צינור חרוטי 50 מ"ל, לערבב דם עם נפח שווה של dextran-500 טמפרטורה 3% בחדר סטרילי (מורכב מלוחים סטרילי 0.9%) על ידי היפוך עדין. השאירו עומד זקוף עבור 18-20 דקות בטמפרטורת החדר. מעביר את השכבה העליונה בצבע הקש לצינור טרי עד שהוא כבר לא יכול להיות שנאסף ללא זיהום על ידי שכבת האדום התחתונה. אריתרוציטים ב היכול להיות מושלך דואר צינור מקורי.
2. צנטריפוגה supernatant XG ב 500 במשך 10 דקות ב 4 °. צייר ותשאיר supernatant. באופן ידני מחדש להשעות את התא גלולה ב בופר פוספט סטרילי בטמפרטורה 10 מ"ל חדר (PBS). שים לב vortexing לא אמור לשמש מחדש להשעות נויטרופילים בכל שלב של פרוטוקול זה. ידני ציור off, ולא ניגר supernatants מומלץ גם ברחבי הפרוטוקול כדי למקסם תשואת תא.
3. הוסף 10 מ"ל של פתרון ההפרדה תא בטמפרטורת החדר polysucrose ונתרן diatrizoate (למשל, Histopaque 1077) כדי צינור חרוטי 50 מ"ל. בזהירות שכבת פתרון התא המכיל מעל פתרון הפרדת תא. שים לב פתרון הפרדת תא באמצעות אשר לא equilibrated לטמפרטורת חדר עשוי להפחית תשואת תא.
4. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלם משם.
5. כפי נויטרופילים הם בשכבה הנמוכה ביותר של שיפוע, לצייר את וזורקים upper 3 שכבות, מורכב שכבה עליונה של פלזמה וטסיות, סרט לבן דק של תאי mononuclear ושכבה ברורה של מדיום שיפוע צפיפות.
6. כדי lyse כל אריתרוציטים הנותרים, מחדש להשעות את הגלולה נויטרופילים 10 מ"ל מים בטמפרטורת החדר.
7. לאחר 30 שניות, לשחזר טוניות על ידי הוספת 10 מ"ל של נתרן כלורי 1.8% טמפרטורה סטרילי בחדר ומערבבים על ידי היפוך עדין.
8. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. צייר את supernatant וזורקים.
9. אם הגלולה היא עדיין אדומה, לחזור על שלב תמוגה. אם הגלולה היא לבנה (או אם תמוגה היום כבר פעמים), בעדינות מחדש להשעות תאים 10 מיליליטר של PBS סטרילית.
10. ספירת תאים באמצעות מונה אוטומטי או hemocytometer. תשואות אופייניות הן לפחות 10 ⁶ תאים לכל מיליליטר של דם.
11. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. צייר את supernatant וזורקים.
12. מחדש להשעות תאים לריכוז הרצוי ב PBS בטמפרטורת חדר סטרילי. For את assay לשחרור DNA כמתואר בסעיף 2, resuspend ב 5 x 10 ⁶ תאים לכל מיליליטר.
13. אם תרצה, להעביר נפח קטן של תאים ישירות או באמצעות cytocentrifuge לשקופית זכוכית. אפשר תאים להתייבש כתם באמצעות ערכת קיבעון והכתים מהירה פי מייצר 'הוראות. אם בידוד נויטרופילים הצליח, כאשר בחן במיקרוסקופ לפחות 95% של תאי בעלי גרעין צריכים להיות גרנולוציטים (נויטרופילים, בזופילים, אאוזינופילים) עם זיהום כדורי מינימאלי.

3. DNA שחרור Assay

1. הגדרת assay לשחרור DNA מיד לאחר בידוד נויטרופילים.
2. אם clumping התא נמצא בבדיקה של פתרון המניות על ידי מיקרוסקופ אור, להעביר את ההשעיה תא דרך פילטר סטרילי 70 מיקרומטר סטרילי מיד לפני הגדרת assay.
3. זה טוב במבחן צלחת גם 96 סטרילי, להוסיף 5 x 10 ⁴ תאים / טוב; אגוניסט ו תזכיר פארק רוזוולריאל מכון-1640 (RPMI) בינוני ללא פנול אדום בתוספת 0.5% חום מומת העובר עגל בסרום לנפח סופי של 100-200 μl. לכלול לפחות שתי בארות ריקות לכל אגוניסט כשהפתרון המניות נויטרופילים מוחלף נפח שווה של PBS. שים לב להגדרת בארות ריקות עבור כל אגוניסט חשוב פוסלי זיהום הדנ"א של אגוניסט או הפרעה באמצעות אגוניסט עם assay הקרינה.
4. לדגור על 39 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בתוך פחמן דו חמצני חממה (4%).
5. הוספת אגוניסטים בריכוזים רצויים לבין צבע חומצות גרעין תא חדיר. הערת הריכוז האופטימלי של צבע התא חדיר ינוע בין צבעי חומצות גרעין שונים. שולטת ללא מגורה שבו אגוניסטים מוחלפים נפח שווה של התקשורת צריכה להיכלל בכל ניסוי.
   הערה: רצוי לדלל אגוניסטים בנפחים דומים של מדיום התרבות כדי לשמור על תנאים עקביים בין בארות. כרכים היטב סופי של 200 &# 181; l שמש בהצלחה ואם זה משתנה, גם הכרכים צריכים להישאר זהים לכל התנאים. Phorbol-12-myristate-13-אצטט (PMA) (הריכוז הסופי ≥0.1 מיקרומטר) או גורם הפעלת טסיות (PAF) (הריכוז הסופי ≥31 מיקרומטר) יכול לשמש שולטת חיובית. אגוניסטים יש למדוד לפחות בשני עותקים.
6. לדגור על C ° 39. מדוד הקרינה באמצעות קורא microplate לאחר 2 שעות או במרווחים הרצויים. שים לב מרווחי זמן אופטימלי ישתנו בהתאם אגוניסטים בשימוש.
   הערה: אורך הגל יהיה תלוי לצבוע מועסקים.
7. פחת קרינה ריקה לפני חישוב קרינה ממוצעת.
8. כדי לאפשר השוואה בין פרט לפרט ובין צלחות, לחשב שינוי לקפל קרינה על ידי חלוקת הקרינה הממוצעת של בארות מגורות על ידי הקרינה הממוצעת של בארות שאינן מגורה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

שימוש בפרוטוקול זה, לא אמור להיות שינוי לקפל חזק קרינה לאחר הגירוי נויטרופילים עם הבקרות החיוביות, PMA ו PAF. כמו באיור 1B, גירוי של נויטרופילים כלבים עם 31 מיקרומטר PAF עבור 1 תוצאות hr לעלייה 4.0 פי ממוצע הקרינה לעומת תאים שאינם מגורה (טווח 2.0-5.8, n = 5 כ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

את assay לשחרור DNA שהוצג הוא assay לכימות בקלות עבור DNA התאי. השיטה הותאמה מן בטכניקות דומות המשמשות להערכת היווצרות NET במינים אחרים, אך במהירויות צנטריפוגה, ריכוזי אגוניסט ושעות דגירה שונו כדי לייעל את השיטה לשימוש עם נויטרופילים כלבי ^8,17,18. התאמות דומות יכולות להיעש?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA	BD	367835
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Dextran-500	Accurate chemical and scientific corp.	AN228410
Phosphate buffered saline	ThermoFisher scientific	20012043
Fetal bovine calf serum, heat inactivated	ThermoFisher scientific	10100139
RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine	ThermoFisher scientific	32404-014	Should be free from phenol red
96 well flat bottomed sterile polystyrene plate	Falcon	353072
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P1585
Platelet activating factor	Sigma-Aldrich	P4904
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	ThermoFisher scientific	S7020
Synergy 2 Multi-Mode Reader	BioTek	NA