הדמיה של שינוי צורה של התא ותנועתו ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; Gastrulation שימוש Reporter DE-cadherin זבובים טרנסגניים

Summary

Herein we describe a procedure to capture live images of Drosophila gastrulation. This has enabled us to better understand the apical constriction involved in early development and further analyze mechanisms governing cellular movements during tissue structure modification.

Abstract

Gastrulation הוא הסט הראשון של אירועים דינמיים מורפולוגית המתרחשים במהלך ההתפתחות העוברית של בעלי חיים רבים-תאיים כגון תסיסנית. שינוי מורפולוגי זו מוכרת גם בשם אפיתל המעבר mesenchymal (EMT). חוסר ויסות של EMT קשורה סיסטיק ו גרורות סרטניות. יש ראיות המתעוררים כי EMT נשלטת על ידי מספר מנגנונים מולקולריים. כמו גנים מפתח כגון, רבים השולטים התכווצות הפסגה גם ידועים להיות מרכיב חשוב EMT ציין בהתפשטות גרורות סרטניות. כמו EMT במהלך gastrulation תסיסנית, תאי אפיתל יכולים להיגרם לשנות את צורתם ואת לתכנת מחדש להפנות תא גורל כלפי סוגי תאים שונים אחרים. כאן אנו מספקים שיטת הדמיה חזקה של gastrulation תסיסנית כדי assay את החניכה של תנועות הסלולר המוךפו"גנטי שהולכות וזיהוי תאי גורל בשלב זה של התפתחות עוברית. באמצעות שיטה זו, אנו מזהים גell התארגנות בזמן gastrulation ולהפגין את החשיבות של התכווצות הפסגה במהלך gastrulation באמצעות GFP שכותרתו DE-cadherin.

Introduction

Gastrulation הוא הסט הראשון של אירועים דינמי מורפולוגית המתרחשים במהלך ההתפתחות העוברית של בעלי חיים רב-תאיים כגון תסיסנית ^1,2. מעניין, המתעוררים הראיות עולה כי תהליך זה מוסדר באמצעות משחק הגומלין בין מנגנונים מכניים ומולקולרית ^3. יתר על כן, אפיתל המעבר mesenchymal (EMT), שהוא תהליך מכריע gastrulation, הוא מעורב גם בתהליכי מחלות אנושיות כגון גרורות סרטן ^4-8. כמו גנים כאלה, רבים השולטים התכווצות פסגה גם ידועים כגורמי מפתח EMT שנצפתה בסרטן גרור ^9. לפיכך, מועקה הפסגה בעת gastrulation הוא מודל מצוין לחקור את מנגנוני ויסות הנ"ל כדי לשפר את ההבנה שלנו של גרורות סרטניות. היתרון של שיטה זו הוא כי אנו יכולים לצפות תנועת התא בעת gastrulation בזמן אמת ולכן, אנחנו נהיהמסוגל להקרין גנים המעורבים gastrulation וכן גרורות סרטניות.

למרות יחסית ידוע, תא אל התא הדבק הוא חשב לשחק תפקיד מרכזי התכווצות פסגת ^1. גנטיקת תסיסנית מתאימה גם לחקירות ברמת התא בודדות לחקור מנגנונים מולקולריים רגולטוריות. מודל זה יאפשר לנו לחשוף את החשיבות של התכווצות הפסגה במהלך gastrulation. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש מסך גנים המעורבים בהתפשטות גרורות סרטניות. תמונות חיות לכידות של gastrulation תסיסנית נוספת אפשרו לנו להבין ביתר פירוט את המנגנונים המולקולריים השולטים התארגנות רקמות. בזאת, אנו מספקים תיאור מקיף של שיטה פשוטה כדי להשיג זאת.

Protocol

הערה: הזבובים המהונדסים נעשו שימוש במחקר זה כולל את הפעולות הבאות: DE-CAD :: GFP ^10.

1. הכנת הצלחת האפלה

1. הכינו תערובת של אגר 12.5 גרם, 125 מ"ל 100% מיץ תפוחים זמינים מסחרית, 12.5 גלוקוז g, ו- 375 מ"ל H ₂ O. מחממים את התערובת במיקרוגל ויוצקים אותו לתוך צלחת תרבית תאים 3 ס"מ. אחסן את התערובת על 4 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
2. לאחר הכנת צלחת התפוח, להוסיף שכבה דקה של ממרח שמרים לש ​​על גבי זה כדי לאפשר הזבובים להטיל ביצים.

2. הכנת עובר ופרוטוקול הדמיה חיה

1. מניחים כ 50 זבובים (25 זכרים ו -25 נקבות) בבקבוק להזדווג ובהמשך להטיל ביצים לילה על צלחת תפוח מכוסה שמרים לשה. הגדר את צלחת מיץ תפוחים בפתחו של הבקבוק. שמור את הבקבוק באינקובטור. עוטפים את בקבוקי פלסטיק תסיסנית המניות ברדיד אלומיניום כדי להנחות הדואר טס להטיל יותר ביצים.
2. למחרת בבוקר, להחליף את צלחת מיץ תפוחים הישן בחדש.
3. בואו הזבובים להטיל ביצים במשך 3 עד 4 שעות על ידי לפפה את הבקבוק בנייר אלומיניום.
4. שלוש עד ארבע שעות מאוחר יותר, לאסוף את העוברים בתוך מסננת העובר מהצלחת מיץ תפוחים באמצעות רע מברשת או כותנה ולשטוף אותם עם PBS. לשטוף את העוברים 2 עד 3 פעמים יותר עם PBS במנות תרבות 12 גם.
5. Dechorionate את העוברים עם אקונומיקה 50% במשך 5 דקות במנות תרבות 12 גם.
6. בעקבות תהליך dechorionation, לשטוף את העוברים 2 עד 3 פעמים יותר עם PBS.
7. מעבירים את העוברים על צלחת תרבית תאים 3 ס"מ המכיל הבמה PBS ובחר 5 עוברים תחת המיקרוסקופ מבוסס על רמת שקיפות גבולותיהן. פיפטה עובר המבוים באמצעות קצה פיפטה 200 μL.
8. בשלב הבא, במקום שני עוברים שנבחרו על coverslip זכוכית, ולהסיר PBS העודף בנייר טישו מעוות דק. אוריינט עובר בצד הגבה עלאת coverslip באמצעות נייר טישו מעוות דק. לאחר מכן, לצרף את עוברי coverslip הזכוכית עם גריז סיליקון באמצעות מחט דקה ונייר דק מעווה.
9. הוסף טיפה קטנה של שמן halocarbon 700 על העוברים ומניחים את coverslip המכיל את העוברים במהופך בשקופית מסוכסך, משאיר קצת מקום בתחתית המגלשה.
10. בדוק את העוברים באמצעות מערכת הדמיה confocal, לייזר ארגון / 488, אובייקטיבי טבילה-שמן (63X).
    הערה: זיהוי העובר בשלב ההתפתחותי המתאים חשובה ללכוד תמונות של אירוע gastrulation. בתנאים אלה, יש למלא אחר כמעט כל העוברים להתפתח בצורה תקינה עד לשלב לפחות 14. העובר נתח יכול להיות מתורבת להמשיך לפתח כמבוגר.

תוצאות

כאן, אנו מציגים את אירועי gastrulation של עובר תסיסנית סקירה כללית של הליך הכנת עובר (איור 1). קרום התא מסומנים באמצעות DE-cadherin :: GFP ו הדמיה חיה של תנועות תא מתבצע בעת gastrulation תסיסנית (איור 2). מאז זבובי DE-cadherin GFP מאפשרים לנו לדמיין צמתים דב...

Discussion

Although we have previously reported a similar procedure to capture live images of the gastrulation process in Drosophilla¹, the method we describe here is detailed and easy to trace endogenous cadherin expression and thus is quite useful for genetic screening of key factors involved in gastrulation. To maximize success with this imaging procedure, it is essential to use an indented slide. Mechanical pressure sometimes causes embryonic death. Therefore, it is also important to handle the embryos as ge...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halocarbon oil 700	Sigma	MKBH 5726
Vacuum grease Silicone	Beckman	335148
Glass coverslip	Matsunami glass	Thickness No1	24 - 36 mm
Embryo stariner	Corning	Corning3477
Plastic Drosophilla Stock Bottles	Hitec	MKC-100
DE-Cadherin knock-in flies			REF (10)