אינדוקציה של שבץ איסכמי ו איסכמיה reperfusion בעכברים באמצעות הטכניקה ויזואליזציה ספיגות עורקים התיכונים של אזור האוטם

Summary

We describe a mouse model of stroke induced by the occlusion of the middle cerebral artery using a silicone coated suture. The protocol can be applied to induce permanent occlusion or a temporary ischemia, followed by reperfusion.

Abstract

Cerebrovascular disease is highly prevalent in the global population and encompasses several types of conditions, including stroke. To study the impact of stroke on tissue injury and to evaluate the effectiveness of therapeutic interventions, several experimental models in a variety of species were developed. They include complete global cerebral ischemia, incomplete global ischemia, focal cerebral ischemia, and multifocal cerebral ischemia. The model described in this protocol is based on the middle cerebral artery occlusion (MCAO) and is related to the focal ischemia category. This technique produces consistent focal ischemia in a strictly defined region of the hemisphere and is less invasive than other methods. The procedure described is performed on mice, given the availability of several genetic variants and the high number of tests standardized for mice to aid in the behavioral and neurodeficit evaluation.

Introduction

המחקר של מחלות לב וכלי דם, כגון שבץ, מסתמך על השימוש במודלים in vivo. כדי להבין את המשמעות האפשרית של איסכמיה, הרעלת סמים, ו / או טיפול, יש צורך להשתמש מודל מתאים, סטנדרטי, אמין, לשחזור של המחלה, המאפשרת מחקרים השוואתיים בין קבוצות טיפול. בכתב היד הזה, אנו משתמשים בעכברים, הרי שעל בסיס זמינות של מספר רב של עכברים טרנסגניים ומודלים להערכה סטנדרטיים. לגרף ציונים להעריך גירעונות מנוע והתנהגות לאחר שבץ איסכמי הניסיון ואת ההתאוששות שלהלן פותח ^{1, 2.}

מודלי שבץ איסכמי כמה זמינים, כגון איסכמיה מוחית העולמית מלאה, איסכמיה הגלובלית שלמה, איסכמיה מוחית מולטיפוקליות ו איסכמיה מוחית מוקדים. הקבוצה השנייה היא גם בקטגוריה של שבץ הנפוץ ביותר בחולים. רוב הערבnts מבוצע על ידי ההיווצרות של חסימת תסחיפים או טרומבוטיים ליד או עורק המוח האמצעי (MCA). בהתחשב בפרמטרים אלה, המודל שהוצג יחקה האטיולוגיה מחלת שבץ אדם ועושה תוצאות שהתקבלו ביותר ³ רלוונטיים. עם זאת, התרגום של תגליות מן במודלים של בעלי חיים לטיפול במחלה בבני האדם הוכיח להיות מאתגר. עד כה, רק את השימוש activator plasminogen רקמות thrombolytic אושר לטיפול בשבץ מוחי איסכמי ^4.

בין דגמים של איסכמיה מוחית מוקד עכבר, מודל שבץ מוחה זרימה אחורית ודגם פקק ורידי מוחות הם פולשני מאוד, הולכים ופוחת תחולתן והגבלת מגוון ניתוחים שניתן לבצע. עם זאת, טכניקות אחרות, כגון המודל תסחיפי, מודל photothrombosis, אנדותלין -1 המושרה מודל שבץ, חסימה בעורק המוח האמצעי תפר intraluminal (MCAO) מודל, זמין לשימוש ללא מגבלות כאלה. מודל MCAO הוא טכניקה מתוארת בפרוטוקול זה. הוא מציע שיטה אמינה של גרימת איסכמיה מוחית מוקדים שניתן reperfused בקלות ובצעה באופן תפוקה גבוהה. קיימות שתי גישות מודל זה, כלומר, Zea-Longa ו קואיזומי השיטות. הם נבדלים מעט בדרך תפר החסימה מוכנסת בכלי הדם. בטכניקת Zea-Longa, התפר מוכנס דרך עורק התרדמה החיצוני ^5. הטכניקה המוצגת כאן היא שונה משיטת קואיזומי שבו תפר occluding מוכנס דרך עורק התרדמה המשותף ^6.

מודל MCAO יושם בהצלחה על מנת להעריך אירועים שונים המתרחשים במהלך שבץ איסכמי. בעקבות רה-פרפוזיה, בצקת במוח ניתן לצפות יחד עם פירוט של מחסום הדם-מוח. ומוות עצב שיא בדרך כלל הוא ציין 24 שעות; עם זאת, זה מחדשפונה לרמות הבסיס לאחר 7 ימים ^7. אצל בני אדם, מין וגיל הם משתנים חשובים בקביעת התוצאה שבץ, זה גם הוא ציין עכברים וחולדות ^{8, 9, 10.} מספר פרסומים השתמשו במודל MCAO להפגין יעילות הטיפול ^{11, 12, 13, 14.}

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי האוניברסיטה של ​​טיפול בבעלי חיים מוסדיים מיאמי ועדת שימוש (IACUC) בהתאם המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) הנחיות. השימוש בציוד סטרילי וטכניקות ספטית נדרש.

1. הכנת ספיגת התפר

1. השתמש תפר בקוטר 0.21 מ"מ לעכברים בין 20 - 25 גרם ו 0.23 מ"מ לעכברים בין 25 - 35 גרם של משקל גוף. הבחירה של הסוג של תפרים עבור הליך MCAO תלוי במשקל חיה.
2. באמצעות עט כסף, לסמן תפר בשעה 9 מ"מ החל מהקצה מצופה סיליקון. זה ישמש כמדריך אורך כניסה.

2. הכנה לכירורגיה

1. להרדים עכבר עם isoflurane מעורבב עם חמצן, באמצעות מערכת הרדמת מעבדה. השתמש isoflurane בשעה מוגדר 5 ותזרים חמצן 2 על מכונת המסחרי (ראה לוח חומרים). מעבירים את החיה אל surgery השטח ולקיים הרדמה באמצעות חרטומו (isoflurane השתמש בהגדרה 1.5 - 2.5 ו זרימת חמצן 2).
   1. להבטיח שמירה על קצב עכבר הנשימה היא סביב 1 - 2 נשימה לכל שניות בלי להתנשף. בנוסף, להבטיח כי בעל החיים לא להפגין תגובה לגירוי שפם רפלקס דוושה (קמצוץ בוהן). צג הנשימה שיעור ומאמץ במהלך הניתוח, לפחות כל 5 דקות.
2. שים טיפה של חומר סיכה עיניים על כל עין באמצעות ספוגית סטרילית כדי למנוע מהם מהתייבשות במהלך ההליך. לחלופין, להחיל משחת עיניים לעין משפופרת תרופות סטרילי.
3. הפוך את התנין על גבו ועל לגלח את אזור החתך. אחר כך, ביסודיות לחטא את אזור הניתוח באמצעות אתנול 70%, ואחריו כלורהקסידין, ואת הספוגית הסופית עם 70% אתנול. מניח את החיה על משטח כירורגי חם תחת סטראו.

3. דיסקציה של עורק Common הראש הפנימי / External מסעף

1. בעזרת מספריים מלקחיים כירורגיים, לבצע חתך קו האמצע רדוד בצוואר, מלמעלה לעצם החזה כדי מתחת ללסת (כ 3 - 4 ס"מ). יש למקם וילון כירורגי מסביב לאזור הניתוח, כדי למנוע מכשירים מלבוא במגע עם משטחים לא סטריליים. וילון הכירורגים הושמט בסרטון הנוכחי כדי לסייע צילומים.
2. בעזרת מלקחיים, שומן נפרד בזהירות ורקמות חיבור לחשוף את קנה הנשימה. רקמות צריכות בקלות ובאופן טבעי להפריד לשני הצדדים.
3. מניחים כרית (חפץ עגול, כ -0.5 ס"מ קוטר) על החלק האחורי של הצוואר של עכברים כדי להאריך את הצוואר, עוד חשיפת האזור לניתוח.
4. פתח את החתך גם באמצעות מפשק רקמות או ווים.
5. בצד שמאל של החיה של קנה הנשימה, למרוט לגזרים את רקמת החיבור בזהירות כדי לחשוף את העורק הראשי משותף שמאל (CCA). היזהר שלא לפגוע בעצבים וורידים מרכזיים יחד עם המרכז לאמנות עכשווית.
6. המשך חשיפת CCA, נזהר להתנתק הרקמה הבסיסית, ולחשוף את "Y" העליון הסתעפות של עורק המוח הפנימי (רשפ"ת) ו עורק המוח חיצוני (ECA). כדי לסייע ניתוק CCA, הכנס את המלקחיים המעוקלים תחת CCA לנקב את רקמת חיבור ואז לאט לאט לאפשר להם לפתוח.

4. הכנת המרכז לאמנות עכשווית עבור החדרת תפר MCAO

1. הכנס 3 מגזרי ניילון תפר של כ -4 ס"מ באורך תחת CCA. ודא כי CCA אינו מעוות זה יסבך ההחדרה דרסטי של התפר.
2. בנקודה הנמוכה ביותר האפשרית, לסגור את התפר התחתון באמצעות פקעת קבע.
3. לקשור את התפר העליון ממש מתחת ICA / ECA הסתעפות באמצעות קשר להחליק נשלף.
4. לקשור את התפר באמצע באמצעות קשר להחליק נשלף, אבל שמור עליו פתוחה לרווחה. חשוב להשאיר מספיק מקום שלא לעכב החדרת תפר.
5. שימוש sci אביב microdissectionssors, לבצע חתך CCA בין החלק התחתון ותפרים באמצע. בצע את חתך 0.2 המ"מ קרוב התפר התחתון.

5. עורקים תיכונים ספיג מוחות

1. בעזרת מלקחיים, הכנס את תפר MCAO לתוך החתך CCA, המנחה אותו עד לקצה. בצע פעולה זו במהירות לאחר שלב 4.5 כדי למנוע קרישה וסגירה של פתיחת המרכז לאמנות העכשווית. במקרה החדרת תפר חסום, השתמש טיפים של מלקחיים כדי לפתוח מחדש את החתך.
2. בעדינות לכבול תפר באמצע מצד סיליקון תפר MCAO באמצעות קשר להחליק כדי להגביל את זרימת הדם סביבו, אך רופף מספיק כדי לאפשר לו לנוע בחופשיות.
3. בזהירות לבטל תפר העליון, ולוודא כי תפר MCAO לא יחליק החוצה.
4. הכנס את תפר MCAO ב הרשפ"ת על ידי כמה מילימטרים ואז reclose התפר העליון, באותו אופן כפי שמתואר בשלב 5.2.
5. מדריך תפר MCAO לאזור החסימה. חיווי החדרה מוצלחת הואניכר על ידי הכמות הנמוכה של backflow דם מן חתך CCA וכי סימן מ"מ כסף 9 ממוקם בין חתך CCA ואת הסתעפות ICA / ECA. אישור נוסף של חסימה מוצלחת ניתן להשיג באמצעות שיטות ניטור כגון מערכת ניטור זרימת הדם דופלר לייזר ^{15, 16.}
   הערה: ירידה של 90% של זרימת דם לאזור המוח האמצעי בצד באזור המוסתר מציינת חסימה מוצלחת.
6. לאחר חסימה מוצלחת, לכבול תפר הבינוני העליון בחוזקה. אם ביצוע הכניסה דמה, לא reclose התפרים אלא מיד דלג לשלב 7.3.

סגירת חתך 6. שלאחר ניתוח טיפול

1. טאק התפרים לאזור החתך.
2. סור ווים מפשקים או רקמות כרית.
3. אזור תפר נקי באמצעות מי מלח סטרילית מקלון צמר גפן.
4. סגירת החתך באמצעות ניילון תפר / מחט מלקחיים.
5. נהל אנטי דלקתיות (למשל, Carprofen 10 מ"ג / ק"ג, SC) משכך כאבים (למשל, עצירות 0.1 מ"ג / ק"ג SC, פעמיים ביום) תרופות להקלת אי נוחות לאחר הניתוח. מניחים את העכברים בכלוב מונח על משטח לוהט כדי למנוע היפותרמיה ולהנגיש המודעה labium למים ומזון התרכך.
6. לפקח על התאוששות של בעלי חיים (5 - 10 דק ') ואת סימני שבץ. הם יכולים להשתנות משיתוק לרוחב קל והקיפו להתכווצות חמורה של האגף הנגדי מתגלגל. נקודות הערכה כמה מפורטות בדיון. בעלי החיים מוצגים סימני מצוקה נשימתית או התקפים חמורים צריכים להיות מורדמים.
7. בהתאם לפרוטוקול reperfusion איסכמיה, לעזוב את תפר MCAO במקום מ -30 דקות ל -120 דקות או יותר. צמצום חסימת זמן מונע תמותה.
8. עבור חסימה קבועה, לעזוב את תפר MCAO במקום במשך 24 שעות, אולם שיעור התמותה המשמעותי הוא צפוי. לאחר זמן לשגות זה, המשך STEעמ '7.
   1. אם באמצעות מודל חסימה קבועה, לשמור עכברים בכלוב עד לנקודת הסיום. באותו הזמן, להסיר תפר (שלבים 7.1 כדי 7.8). הליך זה יכול להתבצע גם לאחר המתת חסד.

Reperfusion 7.

1. להרדים את החיה שוב (אחרי הוראות 2.1) ולהסיר תפרי סגירת פצע.
2. בעזרת מלקחיים ומפרידי רקמות, לפתוח מחדש את החתך ולחשוף את המרכז לאמנות עכשווית.
3. מוציאים בזהירות את תפר העליון ומשוך בעדינות על תפר MCAO עד החלק מצופה סיליקון ממוקם משכו את הקשר באמצע.
4. בצע שוב את הקשר העליון על התפר כדי למנוע מדם לזרום לעבור התפר (זה לא חייב להיות קשר להחליק).
5. בזהירות להתיר את הקשר באמצע ומשוך התפר על פני הקשר העליון, אבל לשמור את זה בתוך CCA.
6. הבשר ומהדקים את הקשר העליון לחסום את זרימת הדם בעורק.
7. משוך החוצה לחלוטין תפר MCAO ולסגור את הקשר באמצע בחוזקה.
8. תפר MCAO יכול להיותשימוש חוזר מספר פעמים. לאחר כל שימוש, נקו את תפר בקפידה באתנול 70% כדי להסיר מזהמים (למשל, דם או רקמות) באמצעות גזה סטרילי. לאחר מכן, למקם את התפר בתוך כיס מעקר לעקר אותה.
9. חזור על שלבים 6.1 - 6.4 ואת לפקח התאוששות בעלי חיים.

בדיקת רקמות 8.

1. כדי לפקח נפח פעימה, לנתח את המוח.
   1. להרדים את העכבר באמצעות תהליך בן שני שלבים. ראשית, לחשוף את בעל החיים ממנת יתר של isoflurane עד נושם עצירות. עבור מכתים TTC, לערוף את העכבר באופן מיידי והמשך מיצוי המוח. עבור המוח חתך (למשל, עבור immunostaining מנתח), לבצע זלוף באמצעות לנקב לב לפני עריפת ראש.
   2. Cut-off ראש בבסיס הגולגולת לחתוך את הקרקפת משני צידי הצוואר כדי העליון של הגולגולת עד בין העיניים. עם חשפה את הגולגולת, לחתוך את העצם לאורך שני הצדדים החל מפתיחת בסיס הגולגולתעד ארובת העין. הפוך זה לחתוך לאורך החלק הרחב של הגולגולת. היזהר שלא להגיע עמוק מדי עם מספריים כדי למנוע נזק למוח.
   3. לאחר מכן, לחתוך את העצם בין שתי ארובות העיניים.
2. בעזרת מלקחיים, להרים את החלק העליון של הגולגולת כדי לחשוף את המוח. לא צריך להיות רק התנגדות קטנה. אם זה לא להרים בקלות, חתכים בגולגולת עשויים להיות חלקיים. שחרר את המוח בעדינות בעזרת מלקחיים מעוקלים בוטים. המוח עדיין מוצמד על ידי מספר עצבים. להתקדם לאט, אפשרות להסיר קבצים מצורפים לאורך הדרך.
3. מניח את המוח הטרי במטריצת מוח 1 מ"מ, להוסיף כמה טיפות של PBS, ופורס לאורך מטריקס באמצעות סכין גילוח או סכין cryostat.
4. מעבירים את המוח על צלחת 100 מ"מ ולהוסיף פתרון מכתים (2% כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazolium [TTC] מומס PBS) כדי לכסות את החלק התחתון של המנה. השימוש בשני מלקחיים, נפרד כל פרוסות המוח (מול פונה כלפי מטה) ומניחות אותם על מנת בתחתית המנה.
   הערה: מכתים יהפוך קיימא רקמות אדומות, עם לא-ישימות רקמה נותרת לבנה. התחממות פתרון 37 ° C תאיץ מכתים. סימנים של אזור מוחי (לבן) ניתן לראות מהר ככל שבץ שלאחר 90 דקות נשארים גלויים במשך יותר מ -7 ימים. הדמיה צריכה להיעשות יחד עם סרגל כדי לאפשר חישוב של נפח פעימה.
5. תהליך גזור מוחות עבור חתך, מכתים חיסוני, בידוד חלבון, או מגוון של הליכים אחרים ^{17, 18, 19.}

תוצאות

מסלול הכניסה עבור תפר החסימה מודגם באיור 1. תפר MCAO הוא להיות מוכרע לאזור החסימה, מתפצל ב הרשפ"ת. חסימה מוצלחת של MCA תוביל פגיעה ברקמות, גלויה על ידי מכתים TTC. איור 2 מציג תמונות של מכתים מן החי מטופלים דמה (איור 2 א) ו מבעל חיי...

Discussion

הניצול המוצלח של שיטת MCAO תארה תלוי מאוד על הבנת האנטומיה זרימת דם במוח. מאז המיקום הנכון של התפר קשה להבחין בשל חוסר רמזים חזותיים ישירים, לחזור על התרגילים חשובים להשתלט על ההליך לפני השימוש בו ללימודי חקירה. נפח פעימה יש לנתח על מנת להבטיח תוצאות עקביות. התוספת של מע...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCAO suture 0.23 mm	Doccol	702345PK5Re
MCAO suture 0.21 mm	Doccol	702145PK5Re
Silver pen	staples	503205
Anesthesia machine	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine science tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine science tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine science tool	00109-11
Spring scissors	Fine science tool	15000-08
Nylon suture	Braintree scintific	SUT-S 104
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherSci	50-121-8005
Brain block	Braintree scintific	BS-A 5000C
Cryostat blade	VWR	89202-606
Optional:
Periflux Laser doppler system	Perimed	Periflux 5000
Monitoring unit	Perimed	PF 5010 - LDPM