פרוטוקול באמצעות העברת אנרגיה פורסטר תהודה (סריג) חיישנים ביולוגיים -force למדוד כוחות מכניים ברחבי המכלול הגרעיני LINC

Summary

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Abstract

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

Introduction

חיל-רגיש, חיישני סריג מקודדים גנטיים צמחו לאחרונה ככלי חשוב למדידת כוחות מבוסס מתיחה בתאים חיים, ומספקים תובנות איך מכני כוחות מוחלים על פני חלבוני ^{1, 2, 3, 4.} באמצעות כלים אלה, חוקרים יכולים דימוי הלא פולשני כוחות תאיים בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופי פלורסנט קונבנציונליים. חיישנים אלה מורכבים-זוג סריג (פלורסנט תורם acceptor חלבונים, בתדירות הגבוהה ביותר תורם כחול acceptor הצהוב) המופרדים על ידי פפטיד אלסטי ^3. בניגוד C- או N-terminal תיוג, חיישן זה מוכנס לתוך אתר פנימי של חלבון כדי למדוד את הכח המכאני ישודר החלבון, מתנהג כמו מד לחץ מולקולרי. גברת מתח מכאני על פני תוצאות החיישן בעל טווח מוגדל בין-p הסריגאוויר, דבר שגרם לפגיעה סריג ^3. כתוצאה מכך, הסריג הוא ביחס הפכו כוח מתיחה.

חיישנים פלורסנט מבוסס אלו פותחו עבור חלבונים דבקים מוקדים (vinculin ³ ו תלין ^4), חלבוני cytoskeletal (α-actinin ^5), וחלבוני צומת תא-תא (E-cadherin ^{6, 7,} VE-cadherin ^8, ו PECAM ^8). הנפוץ ביותר בשימוש היטב מאופיין ומקשר אלסטי ב חיישנים אלה נקרא TSmod והוא מורכב מרצף חוזר ונשנה של 40 חומצות אמינו, (GPGGA) _8, אשר נגזרו flagelliform חלבון משי עכביש. TSmod הוכח להתנהג כמו היענות ננו-אביב אלסטי ליניארי, עם סריג 1 עד 5 pN בכוח מתיחה ^3. באורכים שונים של flagelliform יכולים לשמש כדי לשנות את r הדינמיתAnge של TSmod סריג כוח רגישות ^9. בנוסף flagelliform, spectrin חוזרת ⁵ ו פפטיד כיסוי ראש villin (המכונה HP35) ⁴ שימשו כמו פפטידים אלסטי בין-זוגות סריג ב חיישנים כוח דומה ^4. לבסוף, דו"ח אחרון הראה כי TSmod יכול לשמש גם כדי לזהות כוחות דחיסה ^10.

אנחנו לאחרונה פיתחה חיישן כוח עבור והמקשר של-שלד התא Nucleo (LINC) חלבון מורכב Nesprin2G באמצעות TSmod מוכנס לתוך חלבון שפותחו בעבר קטועה Nesprin2G המכונה מיני-Nesprin2G (איור 2 ג), אשר מתנהג באופן דומה אנדוגניים Nesprin-2G ^11. קומפלקס LINC מכיל חלבונים מרובים מפנים מבחוץ לחלק הפנימי של הגרעין, המקשר את שלד תא ציטופלסמית אל למינה הגרעיני. Nesprin-2G הוא חלבון מבני מחייב הוא אתcytoskeleton אקטין בציטופלסמה וכדי חלבונים SUN במרחב perinuclear. שימוש biosensor שלנו, הצלחנו להראות כי Nesprin-2G כפוף מתח actomyosin התלוי NIH3T3 פיברובלסטים ^2. זו הייתה הפעם הראשונה בכח כי נמדד ישירות דרך חלבון במתחם LINC גרעיני, וזה עשוי להיות כלי חשוב להבין את התפקיד של כוח על הגרעין ב mechanobiology.

פרוטוקול להלן מספק מתודולוגיה מפורט של אופן השימוש בחיישן כוח Nesprin-2G, כולל את הביטוי של חיישן המתח Nesprin (Nesprin-TS) בתאי יונקים, כמו גם רכישת וניתוח של תמונות סריג של תאים המבטאים Nesprin- TS. באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך מצויד בגלאי ספקטרלי, תיאור של איך למדוד פליטה רגישה סריג באמצעות unmixing רפאי הדמית סריג ratiometric מסופקת. תמונות ratiometric הפלט ניתן להשתמש כדי להפוך קואה יחסיתהשוואות כוח ntitative. בעוד פרוטוקול זה מתמקד בביטוי של Nesprin-TS ב פיברובלסטים, זה ניתנת להתאמה בקלות לתאי יונקים אחרים, כולל שתי שורות תאים תאים ראשוניים. יתר על כן, פרוטוקול זה בכל קשור לרכישת תמונה וניתוח סריג ניתן להתאים בקלות חיישני כוח סריג מבוסס אחרים שפותחו עבור חלבונים אחרים.

Protocol

1. השג Nesprin-2G חיישן דנ"א האחר פלסמיד דנ"א

1. השג Nesprin-2G TS (חיישן המתח), Nesprin-2G HL (ללא ראש) מלאה, mTFP1, ונוס, ו TSmod ממקור מסחרי. הפץ כל פלסמידים DNA ולטהר אותם באמצעות זני חיידק סטנדרטיים, כגון-α DH5, כפי שתואר לעיל ^{12, 13.}

2. תאי Transfect עם Nesprin-2G ו- DNA פלסמיד אחר

1. לגדל תאי פיברובלסטים NIH 3T3 כדי מפגש 70-90% בצלחת תרבית תאי 6-היטב בתוך חממת תרבית תאים סטנדרטית עם טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס) ו ₂ CO (5%) תקנה. עבור מדיום צמיחת תאים, השתמש בינוני נשר Modified של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום עגל עובר.
2. במנדף תרבית תאים, להסיר את המדיום ולשטוף היטב עם כל כ 1 מ"ל של מדיום התא מופחת-סרום. הוספת 800 μL של המדיום הסלולרי מופחת-סרום היטב כלומקום בתא 6-היטב החממה.
3. פיפטה 700 μL של המדיום הסלולרי מופחת-סרום לתוך צינור 1.5 מ"ל עם 35 μL של פתרון המוביל השומנים כדי ליצור את "lipomix". מערבבים ידי pipetting. סמן הצינור עם "ל"
4. אסוף שישה 1.5 צינורות מ"ל ו לתייג אותם 1 עד 6. פיפטה 100 μL של המדיום הסלולרי מופחת-סרום לתוך צינור אחד.
   1. באמצעות ריכוז פלסמיד דנ"א משלב 1, פיפטה 2 מיקרוגרם של Nesprin 2G-TS לתוך צינורות 1 ו 2. פיפטה 2 מיקרוגרם של Nesprin-HL לתוך צינורות 3 ו 4. פיפטה 1 מיקרוגרם של mTFP לתוך צינור 5. פיפטה 1 מיקרוגרם של mVenus לתוך הצינור 6. אל תשתמש שוב טיפים פיפטה כאשר pipetting סוגים שונים של דנ"א.
5. פיפטה 100 μL של lipomix מהצינור "L" לתוך צינור אחד שכותרתו (1-6) ומערבבים על ידי pipetting חזר. השתמש פיפטה נקייה עבור כל צינור. דגירה של 10-20 דקות.
6. הוספת 200 μL מצינור כל שכותרתו באר בתא 6-היטב עם 70-90% ומחוברותתאים. סמן בראש כל טוב עם DNA המקביל הוסיף. מניח את חדר 6-היטב באינקובטור במשך 4-6 שעות.
7. לשאוב בינונית ומוסיפים 1-2 מ"ל של המדיום הסלולרי מופחת-סרום כדי לשטוף. לשאוב את המדיום הסלולרי-סרום מופחת, להוסיף 2 מ"ל של טריפסין לכל היטב, ומניחים בצלחת 6-היטב החממה (5-15 דקות).
8. בעוד תאים לנתק בחממה, זכוכית התחתונה מעיל 6 לצפייה מנות עם שכבה של פיברונקטין בריכוז של 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​מומס מלוחים פוספט שנאגרו (PBS). אפשר את הכלים כדי מעיל השטח בשכונה תרבית תאים (כ 20 דק ').
9. לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 2 מ"ל של DMEM פעם התאים מנותקים.
10. מעבירים את תכולת כל מהבאר אל צינור צנטריפוגה 15 מ"ל שכותרתו ומסובב ב 90 XG במשך 5 דקות בצנטריפוגה הרוטור מתנדנד. לשאוב supernatant מחדש להשעות כל גלולה תא 1000 μL של DMEM ידי ערבוב פיפטה.
11. לשאוב את תערובת פיברונקטין מןמנות זכוכית פיפטה 1000 μL של כל השעית תא על צלחות הזכוכית.
12. אחרי התאים ליישב לתחתית של מנות זכוכית (~ 15 דקות), להוסיף 1 מ"ל של DMEM + 10% FBS + 1% פן-סטרפ היטב כל מקום בחממה התא. אפשר התאים לצרף ולהביע חיישן לפחות 18-24 h.
    הערה: תאים הם transfected באמצעות ריאגנטים transfection השומנים מסחרי קטיוני (ראו טבלה של חומרים). לחלופין, שורות תאים יציבות ניתן לבחור באמצעות פלסמיד עם גן המקנה עמידות רעלן (פלסמידים pcDNA עבור Nesprin-TS ו -HL זמינים באתר מאגר DNA (ראה טבלה של חומרים) לספק תאים המבטאים התנגדות geneticin ). בנוסף, שיטות זיהום ויראלי (lentivirus, רטרו-וירוס, או אדנו) יכול להיות מנוצל כדי להביע את החיישן בתאים שקשה transfect.
13. בנוסף Nesprin-TS, transfect תאים נוספים עם Nesprin HL אפס עבורמלא CE, כמתואר בשלבי 2.1-2.12; TSmod יכול לשמש גם כשלט אפס כוח צריך להפגין סריג דומה Nesprin-HL.
14. תאים Transfect עם mTFP1 ו ונוס ליצור טביעות אצבעות ספקטרלי (ראה שלב 4).
    הערה: mTFP1 ו ונוס בדרך כלל לבטא ברמות גבוהות יותר מאשר Nesprin-TS, וככזה, כמויות נמוכות של DNA ייתכן שיהיה צורך טרנספקציה להשיג רמות ביטוי דומה.

3. בדוק יעילות transfection

1. בערך 18-24 שעות לאחר השלמת transfection, להשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה כדי לבחון את היעילות של transfection ידי השוואת מספר התאים פלורסנט למספר הכולל של תאים לאור (בדרך כלל 5-30%).
   1. השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד תדר עירור ליד 462 ננומטר (mTFP1) או 525 ננומטר (ונוס) ו מסנן פליטה מרוכז ליד 492 ננומטר (mTFP1) או 525 ננומטר (ונוס).
      הערה: לחלופין, מערכות סינון GFP תהיה ללכוד שילוב של mTFP1 ו veפליטת Nus ותאפשר את האישור של יעילות transfection.
2. תאי תמונת חיה בתוך 48 שעות לאחר transfection.
   1. לחלופין, לתקן תאים paraformaldehyde 4% (ב PBS עם סידן ומגנזיום) עבור 5 דקות, חנות PBS, ולהציג לאחר 48 h ^8.
      הערה: Beyond 48 h, איכות האות וכוח דועך. תיקון התאים משמר המדינה שלהם, כולל סריג לידי ביטוי ^8; עם זאת, תאים צריכים להיות צלמו רק ב- PBS, כמו הרכבה בינונית עשויה להשפיע ¹⁴ סריג. תאים קבועים ניתן להשוות רק לתאים קבועים אחרים, כמו ייתכנו שינוי הביטוי.
      זהירות: Paraformaldehyde רעיל. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE).

4. לכידת ספקטרלי טביעות אצבעותיהם של mTFP1 ו ונוס fluorophores עבור ספקטרלי unmixing

1. במנדף תרבית תאים, להחליף את המדיום הסלולרי עם mediu הדמיהמ '(HEPES שנאגר) השלים עם 10% בסרום שור עובר.
2. מניחים את הכלים הצפייה באופן מבוקר טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס) בשלב מיקרוסקופ confocal.
3. מניח את צלחת הצצה מהזכוכית עם תאים-טרנספקציה mTFP1 מעל המטרה השמנה בהגדלה 60X עם צמצם מספרי של 1.4.
   הערה: שמן משמש על מיקרוסקופ סורק לייזר על המטרה 60X להידמות מקדם השבירה מקרוב של מצע זכוכית. השמן הוא מונח על גבי העדשה האובייקטיבית שבא במגע ישיר עם coverslip הזכוכית.
4. אתר mTFP1 לבטא בתאים עם מקור עירור 458 ננומטר ו מסנן bandpass פליטה המרוכז ב 500 ננומטר.
5. עם תא פלורסנט בתחום הראייה, לבחור את מצב זיהוי ספקטרלי ( "מצב למבדא" בתוכנה המשמשת כאן) ו ללכוד את התמונה ספקטרלי (איור 3-1); כל החדרים כוללים תדרים מעבר 458 ננומטר באמצעות 10 במרווחים ננומטר (איור 3-3). בחר fluoresc בהירבאזור אף אוזן גרון (ROI) על התא (רדיוס 20-פיקסל).
   הערה: צורת הספקטרלית של ROI mTFP1 להביע צריכה להישאר קבועה יחסית על פני התא. אם הצורה משתנית במידה ניכרת, מחדש ולהתאים את הליזר ולהשיג הגדרות כדי לשפר את יחס אות לרעש.
6. מוסיפים את ההחזר על ההשקעה פלורסנט אומר, עוצמת מנורמל למסד הנתונים ספקטרלי על ידי לחיצה על "שמור ספקטרום למסד הנתונים."
7. ייעל את כוח הליזר ולהשיג כזה כי מושגת יחס אות לרעש טוב. הגדרות תשתנינה עבור ציוד שונה. השימוש הלא-ניאון, תאים untransfected כהפניה רקע, להגדיל את הרווח ואת הכוח עד תאים בהירים, אך לא מעבר לטווח הדינמי של גלאי (נקודת הרוויה). תאי רקע לא צריכים קרינה לזיהוי לאחר החישוב ממוצע.
8. חזור על התהליך עבור תאי ונוס-טרנספקציה עם החריגים הבאים:
   1. ודא כי תדירות העירור היא 515 ננומטר וכי מסנן bandpass הוא CEntered ליד 530 ננומטר כאשר איתור תאי-להביע ונוס.
   2. "מצב ספקטרלית," להשתמש בתדירות עירור של 515 ננומטר במקום 458 ננומטר.

5. לכידת תמונות צרופות

1. לעבור את המצב הלכיד "ספקטרלי unmixing."
2. מוסיפים את טביעות האצבעות ספקטרלי של ונוס mTFP1 לתוך ערוצי unmixing (איור 3, חץ-2).
3. הגדר את הלייזר עירור בחזרה למקור ארגון 458 ננומטר.
4. מניחים את צלחת לצפייה Nesprin-TS מעל המטרה שמן 60X.
5. לאחר התמקדות תא פלורסנט עם ביטוי בהיר מספיק, להתאים את הכוח רווח לייזר כדי לייעל את יחס אות לרעש.
   הערה: מאז הסריג היעיל של Nesprin-TS הוא ליד 20%, התמונה ונוס הצרופה צריכה להיות דימר משמעותי יותר מתדמית mTFP1 הצרופה. לאחר הגדרת כוח ורווח מקובל נקבעה באופן איטרטיבי, פרמטרים אלה חייבים להישאר קבועים עבור כל סרן התמונותured.
6. לכידת מינימום של 15-20 תמונות של תאי Nesprin-TS עם בהירות דומה יחסית ולהימנע הרוויה פיקסל מוגזמת (כל פיקסלים הרוויים מוסרים במהלך עיבוד תמונה).
7. חזור על התהליך לכיד תמונה עם תאי Nesprin-HL באמצעות פרמטרי הדמיה זהים.

6. עיבוד תמונה וניתוח תמונה רציו

1. שימוש בתוכנות קוד פתוח ImageJ (פיג'י) (http://fiji.sc/), תמונות בפורמט טבעיות פתוחות באמצעות קורא BioFormats.
2. בתהליך קדם התמונות ולחשב את התמונות יחס באמצעות פרוטוקולים הוקמו בעבר ^15.

תוצאות

בעקבות בפרוטוקול לעיל, פלסמיד דנ"א נרכשה מהמאגר דנ"א להפוך לתאי חיידק. E. coli להביע הדנ"א חיישן נבחרו מתוך LB / צלחות אמפיצילין ו מוגבר במרק LB נוזלי. בעקבות ההגברה של הווקטורים, פלסמידים DNA היו מטוהרים לתוך חיץ טריס-EDTA באמצעות תקן, ערכת ב?...

Discussion

שיטה והדגמה של הדמיה תא חי של מתח מכני על פני Nesprin-2G, חלבון במתחם LINC גרעיני, היה שתוארו לעיל. לפני עבודה זו, טכניקות שונות, כגון שאיפת micropipette, מגנט חרוז cytometry, ליזר-אבלציה מיקרוסקופי, שמשו ליישם עומס על גרעין התא כדי למדוד תכונות החומר בתפזורת שלה ^16,

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nesprin-TS DNA	Addgene	68127	Retrieve from https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNA	Addgene	68128	Retrieve from https://www.addgene.org/68128/
mTFP1 DNA	Addgene	54613	Retrieve from https://www.addgene.org/54613/
mVenus DNA	Addgene	27793	Retrieve from https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNA	Addgene	26021	Retrieve from https://www.addgene.org/26021/
Competent Cells	Bioline	BIO-85026
Liquid LB Media	ThermoFisher	10855001	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
Solid LB Bacterial Culture Plates	Sigma-Aldrich	L5667	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US
Ampicillin	Sigma	A9518
Spectrophotometer	Biorad	273 BR 07335	SmartSpec Plus
quartz cuvette	Biorad	1702504	Cuvette for SmartSpec Plus
DNA isolation kit	Macherey-Nagel	740412.5	NucleoBond Xtra Midi Plus
6-well cell culture dish	Falcon-Corning	353046	Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish
Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media	Gibco	11995-065	DMEM(1x)
Bovine Serum	Life Technologies	16170-078
reduced serum cell media	Gibco	31985-070	Reduced Serum Medium, "optimem"
Lipid Carrier Solution	invitrogen	11668-019	Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000"
1.5 mL sterile plastic tube	Denville	c2170
Trypsin	Gibco	25200-056	0.25% Trypsin-EDTA (1x)
glass-bottom microscope viewing dish	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N	35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass
Fibronectin	ThermoFisher	33016015	fibronectin human protein, plasma
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
15 mL sterile centrifuge tube	Greiner bio-one	188261
swinging rotor centrifuge	Thermo electron	Centra CL2	Swinging rotor thermo electron 236
cell culture biosafety hood	Forma Scientific	1284
climate controlled cell culture incubator	ThermoFisher	3596
inverted LED widefield fluorescent microscope	Life technologies	EVOS FL
Clear HEPES buffered imaging media	Molecular Probes	A14291DJ
Fetal bovine Serum	Life technologies	10437-028
Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources	Zeiss	LSM 710-w/spectral META detector
Outgrowth Media	Newengland Biolabs	B9020s
NIH 3T3 Fibroblasts	ATCC	CRL-1658