דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Summary

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Abstract

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.

The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Introduction

תאי דנדריטים (DCS) הם תאי מציגי אנטיגן המקצועיים החשובים ביותר של מערכת החיסון שלנו. בשלה DCS (iDCs) מתגוררת בעור או ברקמות ריריות ולכן הם בין תאי מערכת החיסון הראשונים אינטראקציה עם פתוגנים פולשים. DCs לייצג את הגשר בין מולד במערכת החיסונית אדפטיבית ^1, שכן הם יכולים להפעיל T- ו- B-cell מהתשובות הבאות זיהוי הפתוגן. יתר על כן, הם תורמים תגובות פרו-דלקתיות חיסוניות בגלל הפרשת כמויות גבוהות של ציטוקינים, כגון IL-1β, IL-6, IL-12. DCs גם להפעיל תאי NK ולמשוך תאי חיסון אחרים לאתר של זיהום על ידי chemotaxis.

DCs ניתן לחלק תאים דנדריטים בשלים (iDCs) ותאים דנדריטיים בוגרים (mDCs) ² מבוסס על מורפולוגיה ותפקודם. לאחר ההכרה של אנטיגנים זרים על ידי אחד הקולטנים זיהוי דפוסים רבים (למשל, קולטנים דמוי אגרה, C-typeלקטינים, או משלימים קולטנים) מבוטא בשפע על פני התא, iDCs עוברים שינויים גדולים מתחילים להבשיל. במהלך תהליך התבגרות זה, קולטנים ללכוד אנטיגן למטה מוסדרים, ואילו מולקולות חיוניות מצגת אנטיגן למעלה מוסדרות ^3. בוגר DCs עד להסדיר את מתחמי histocompatibility הגדולות I ו- II (MHC I ו- II), מולקולות גירוי שיתוף כמו CD80 ו CD86, שחיוניים מצגת אנטיגן והפעלה של לימפוציטים מסוג T. בנוסף, הביטוי של CCR7 הקולטן chemokine על פני התא מושרה, המאפשרת הגירה של DCs מרקמות הפריפריה אל קשרי הלימפה. ההגירה הוא הקל על ידי "גלגול" של DCs יחד ליגנד chemokine 19 (CCL19 / MIP-3B) ו -21 ליגנד chemokine (CCL21 / SLC) שיפוע לבלוטות הלימפה ^4-6.

בעקבות הגירה, mDCs להציג אנטיגן מעובד כדי נאיבי CD4 ⁺ ו- CD8 ⁺ T תאים, ובכך initiating תגובה חיסונית אדפטיבית נגד הפתוגן הפולש ^7. אינטראקציה זו עם תאי T של בלוטות הלימפה קשורה גם עם התפשטות הנגיף ^8. מחקרים אחרים במבחנה גילו כי DCs ביעילות ללכוד ולהעביר HIV לתאי T וכי תוצאות שידור זה זיהום נמרץ ^9-12. ניסויים אלו מדגישים כי DCs מנצל in vivo HIV כמו הסעות מהפריפריה אל קשרי הלימפה. במהלך מצגת אנטיגן, DCS להפריש אינטרלויקנים מפתח המעצבים את ההתמיינות של תאי עוזר מפעיל T, ולכן, התוצאה של התגובה החיסונית כולה נגד החיידק נקבעה אינטראקציה מאוד זה. מלבד סוג 1 (Th1) וסוג 2 (Th2) מפעיל תאי T, תת אחרים של התאים המסייעים CD4 ⁺ T (למשל, סוג 17 (TH17) וסוג 22 (Th22) תאי T) תוארו, ואינדוקציה שלהם פונקציה נחקרה ביסודיות. DCs יתר מעורביםהדור של תאי T רגולטוריים (Tregs) ^13,14. תאים אלה הם אימונוסופרסיבי ויכולים להפסיק או למטה להסדיר אינדוקציה או התפשטות של תאי T מפעיל ועל כן הם חיוניים לפיתוח חסינות וסובלנות.

DCs קונבנציונאלי האדם (cDCs) המורכבים מכמה תת קבוצות של תאים עם ממוצא מיאלואידית (כלומר, תאים לנגרהנס (LCS) ואת עורי DCs ביניים) או ממוצא הלימפה (כלומר, DCs plasmacytoid (PDC)). בניסויים במבחנה או אסטרטגיות חיסון DC, DCS-derived מונוציטים משמש באופן שגרתי כמודל DCs העור. תאים אלו מראים דמיון בפיזיולוגיה, מורפולוגיה, ותפקוד התאים הדנדריטים מיאלואידית קונבנציונאלי. הם מופקים על ידי תוספת של interleukin 4 (IL-4) ו גרנולוציט-מקרופאג גורם מגרה המושבה (GM-CSF) כדי מונוציטים מבודד מתורמים בריאים ^12,15-18. תאי דנדריטים יכולים גם להיות מבודדים ישירות ביופסיות עורי או ברירית, או יכולים אפילו בדואר התפתח CD34 ⁺ ובתאי hematopoietic המבודדים דגימות דם חבל הטבור השיגו ברחם לשעבר. הנה, אנחנו מדגימים איך מונוציטים מבודדות מגורה מדם אדם אנטי-קרוש לאחר תא דם היקפיים mononuclear (PBMC) והעשרה על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. לאחר הדגירה במשך 5 ימים, מונוציטים אדם בתנאים מסוימים הם מובחן לתוך iDCs והם מוכנים פרוצדורות בסביבה הלא-קלינית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הצהרת אתיקה: נכתבה הסכמה מהדעת התקבלה כל תורמי הדם המשתתפות ידי המכון המרכזי עירוי דם & חיסוני מח', אינסברוק, אוסטריה. שימוש דגימות שאריות אנונימי למטרות מדעיות אושר על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה לרפואה של אינסברוק.

1. עשיית עושר של תאי הדם ההיקפי mononuclear (PBMCs)

1. ריכוז של PBMCs ידי צנטריפוגה.
   1. פתח את חבילת דם לדם פיצול צינורות צנטריפוגות סטרילי 50 מ"ל פי כמות הדם שהתקבלו.
   2. במידת הצורך, להתאים את עוצמת הקול ל -50 מ"ל לכל צינור עם פוספט שנאגרו מלוחים של Dulbecco סטרילי (D-PBS).
   3. מניחים את צינורות לתוך צנטריפוגות ספין אותם ב 400 XG במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ללא הבלם.
   4. צייר את השכבה העליונה המכיל פלזמה וטסיות בעזרת פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל סטרילי, עוזב את boundarשכבת y באין מפריע.
      הערה: אם פלזמה עצמית במקום FCS משמשת כדי להשלים את מדיום התרבות, הפלזמה יש לאסוף חום מומת בשלב זה.
   5. אוספים את התאים mononuclear (שכבות גבול) משני צינורות 50 מ"ל צנטריפוגות ולהעביר אותם לתוך צינור מ"ל אחד סטרילי 50 בעזרת פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל סטרילי.
   6. כוון את עוצמת הקול ל -50 מ"ל לכל צינור באמצעות D-PBS סטרילית.
   7. מניחים את צינורות לתוך צנטריפוגות ספין אותם ב 400 XG במשך 15 דקות ב RT ללא בלם.
   8. צייר את השכבה העליונה המכילה את הפלזמה וטסיות בעזרת פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל סטרילי, עוזב את שכבת הגבול באין מפריע.
   9. אוספים את התאים mononuclear (שכבות גבול) מן הצינורות צנטריפוגות 50 מ"ל ולהעביר אותם לשתי צינורות סטרילי 50 מ"ל אוסף בעזרת פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל סטרילי.
   10. כוון את עוצמת הקול ל -50 מ"ל לכל צינור עם D-PBS סטרילית.
2. הַפרָדָהשל PBMCs על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות (איור 1).
   1. הכן ארבעה צינורות 50 מ"ל ו פיפטה 15 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות לתוך צינור אחד.
   2. קח 25 מ"ל של תאים ונקווה / דם מהצינור אוסף (שלב 1.1.10) ובזהירות כיסוי המדיום שיפוע צפיפות.
   3. מניחים את צינורות לתוך צנטריפוגות ספין אותם ב 700 XG במשך 30 דקות ב RT ללא בלם.
3. איסוף וטיהור של PBMCs.
   1. צייר את השכבה העליונה המכילה את הפלזמה וטסיות בעזרת פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל סטרילי, עוזב את שכבת PBMC באין מפריע.
   2. אסוף את שלבי PBMC מכל צינורות לרכז את התאים שני צינורות סטרילי 50 מ"ל בעזרת פיפטה סרולוגיות 25 מ"ל סטרילי.
   3. כוון את עוצמת הקול ל -50 מ"ל לכל צינור עם D-PBS סטרילית. מניחים את צינורות לתוך צנטריפוגות ספין אותם ב 400 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C עם הבלם.
   4. לשאוב את supernatant מחדש להשעות אתתאי D-PBS סטרילית. פינת התאים משני צינורות ולהתאים את עוצמת הקול עד 50 מ"ל עם D-PBS סטרילית.
   5. מניחים את הצינורות לתוך בצנטריפוגה ספין אותם ב 400 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C עם הבלם.
   6. לשאוב את supernatant מחדש להשעות את התאים D-PBS סטרילית. כוון את עוצמת הקול עד 50 מ"ל עם D-PBS ו פיפטה סטרילית 50 μl כדי צינור 1.5 מ"ל המכיל 450 μl של D-PBS.
   7. וורטקס הצינור 1.5 מ"ל במרץ לספור את התאים בתא נויבאואר או כל מכשיר ספירת תאים אחרים.
   8. מניחים את צינורות 50 מ"ל לתוך בצנטריפוגה ספין אותם ב 400 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C עם הבלם.

בידוד 2. של מונוציטים ידי אנטי אנושי CD14 מגנטי חלקיקים

1. תיוג של PBMCs עם חלקיקים מגנטיים.
   1. התאם את הריכוז PBMC עד 8 x 10 מ"ל ⁷ תאים / באמצעות חיץ בידוד.
   2. וורטקס חלקיקים מגנטיים אנטי אנושי CD14 thoroughly ולהוסיף 50 μl של חלקיקים עבור כל 1 x 10 ⁷ PBMCs.
   3. מערבבים את ההשעיה-חלקיק תא ביסודיות דגירה אותו ב RT במשך 30 דקות.
2. ההפרדה של שברים חיוביים ושליליים.
   1. התאם את הווליום עד 12 מ"ל באמצעות חיץ בידוד.
   2. הכן שישה צינורות סטרילית מסביב לתחתית פיפטה 2 מיליליטר של השעית תא-חלקיקים לתוך צינור אחד.
   3. מיד למקום את הצינורות על המגנט. דגירה אותם במשך 10 דקות ב RT.
   4. שמור את הצינורות על המגנט ובזהירות לצייר את supernatant. Supernatant מכיל את החלק היחסי שלילית.
   5. הסר את הצינור מתוך המגנט ולהוסיף 2 מ"ל של חיץ בידוד.
   6. בעדינות מחדש להשעות את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
   7. מניחים את הצינורות בחזרה על המגנט. דגירה במשך 5 דקות ב RT.
   8. שמור את הצינורות על המגנט ובזהירות לצייר את supernatant. Supernatant מכיל את החלק היחסי שלילית.
   9. הסר את הצינורות מן מגנט ומוסיפים 2 מ"ל של חיץ בידוד צינור אחד. בעדינות מחדש להשעות את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
   10. העברת חלק חיובי לצינור 50 מ"ל סטרילי ולהתאים את עוצמת הקול ל -50 מ"ל באמצעות D-PBS סטרילית.

3. גירוי של מונוציטים מבודדים עם IL-4 ו- GM-CSF

1. מניחים את הצינור לתוך צנטריפוגות ומסובב אותו ב 400 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C עם הבלם.
2. לשאוב supernatant מחדש להשעות את התאים 50 מ"ל של D-PBS.
3. פיפטה 50 μl לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל 450 μl של D-PBS. וורטקס הצינור 1.5 מ"ל במרץ לספור את התאים בתא נויבאואר או מכשיר ספירת תאים אחרת.
4. מניחים את הצינור 50 מ"ל לתוך צנטריפוגות ומסובב אותו ב 400 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C עם הבלם.
   הערה: אם חלק שלילי, המכיל לימפוציטים מדם היקפי (PBLs), נדרש גם, לבצע שטיפה ועוד היד נטויה צעדים דומים ל- tצינור של החלק החיובי (שלבי 3.1-3.5).
5. התאם את הריכוז התא 1 x 10 ⁶ / מ"ל עם המדיום תרבות מחומם מראש (בינוני RPMI 1640 בתוספת 10% חום מומת FBS ו 1% פתרון L-גלוטמין) ו פיפטה 3 מ"ל / גם לתוך 6 צלחות היטב.
   הערה: אם אתה משתמש פלזמה עצמית חומה מומת, להחליף את FCS 10% עם 1-5% פלזמה עצמית, על פי ניסיוני ההגדרה.
6. לעורר את מונוציטים עם-4 IL אנושי רקומביננטי (250 U / ml) ו- GM-CSF אנושי רקומביננטי (1,000 U / ml) על ידי pipetting הציטוקינים ישירות לתוך המדיום תרבות. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
7. Re-לגרות את התאים עם IL-4 (250 U / ml) ו- GM-CSF (1000 U / ml) לאחר 48 שעות על ידי pipetting הציטוקינים ישירות לתוך מדיום התרבות.
   הערה: אם קיימים סימני ההחמצה שמוצגים על ידי אינדיקטור pH בטווח הבינוני, להחליף מחצית הבינונית עם מדיום התרבות מחומם מראש.
8. קציר אינו בוגר תאים דנדריטים ביום 5 עבורמטה-זרם ניסויים על ידי pipetting תאים בתרבית מתוך צלחת 6-היטב לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל לאחר pipetting בינוני התרבות למעלה ולמטה כמה פעמים.
9. ספירת התאים להכתים מדגם של מונוציטים מבודד עם נוגדנים אנטי אנושי נגד CD11b, CD11c, ו- DC-כניסה / CD209, יחד עם צבע כדאיות התא. כדי למנוע מחייב נוקבים של נוגדנים במהלך מכתים משטח, השימוש קולטן Fc חוסם ריאגנטים או אלבומין בסרום שור (BSA) מאגרים מומלץ מאוד.
10. לנתח את המדגם באמצעות צבע כדאיות התא, על פי פרוטוקול של היצרן, על ידי ביצוע cytometry זרימה כדי להעריך את טוהר הכדאיות של iDCs שנוצר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

לאחר צנטריפוגה של דם קרוש אנטי באמצעות כרית סוכרוז, תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMCs) מועשרים בתוך שלבים על גבי מדיום שיפוע צפיפות (איור 1). לאחר PBMCs נמשכים לסירוגין, ניתוח FACS מתבצע על מנת לאפיין את אוכלוסיות תאים שונות בתוך PBMCs באמצעות סמנים השושלת ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את הדור של תאים דנדריטים הנגזרות מונוציטים (MDDCs) דרך הבידוד של מונוציטים האדם מדם קרוש אנטי באמצעות assay מבוססי ננו-חלקיקים מגנטיים. בפרוטוקול זה, השלבים צנטריפוגה מבוצעים זרם הליך בידוד תא, מה שמוביל העשרת שבר PBMC. למרות שתאים הם אבדו במהלך צנטריפוג?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19	BD Biosciences	555415
APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e	BD Biosciences	551073
BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles	BD Biosciences	557769
BD Imagnet	BD Biosciences	552311
BSA (Albumin Fraction V)	Carl Roth	EG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Costar	3506
Density gradient media: Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Bio-Sciences	17-5442-03
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Falcon 10 ml Serological Pipet	Corning	357551
Falcon 25 ml Serological Pipet	Corning	357525
Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge Tube	Corning	352070
Falcon Round-Bottom Tubes	Corning	352054
FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a	BD Biosciences	555339
Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent)	Tonbo biosciences	13-0870
GM-CSF	MACS Miltenyi Biotec	130-093-862
Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America)	Gibco	10500-064
Hettich Rotanta 460R	Hettich	---
IL-4 CC	PromoKine	C-61401
Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x)	BD Biosciences	552362
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513
Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin	VWR	211-0015
PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2	BD Biosciences	555398
PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46	BD Biosciences	551265
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R0883
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020