לימוד מבנה ותפקוד מיטוכונדריאלי<em&gt; תסיסנית</em&gt; שחלות

Summary

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Abstract

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Introduction

המיטוכונדריה מתואר קלסי כמו תחנת הכח הסלולר, שכן הם המושבים העיקריים של ייצור אנרגיה בתאי בדיל. יתר על כן, המיטוכונדריה לשחק תפקיד קריטי במטבוליזם, דור חום, שינוי שומנים, סידן הומאוסטזיס חיזור, תזמור תהליכי איתות תא, וכו ^'1. המיטוכונדריה גם לשחק תפקיד פעיל האינדוקציה של מוות של תאי ^2, כמו גם מחזור התא תקנה ^3. רב-פונקציונלי כזו מעלה את השאלות העקרוניות הבאות: א) איך המיטוכונדריה אל לבצע את כל הפונקציות האלה בו זמנית ב) האם יש ברכות המיטוכונדריה ספציפיות או subzones כי הם מיוחדים עבור פונקציות נפרדות? בהקשר זה, חשוב לציין כי המיטוכונדריה רב התכליתית הן דינמיות הצורה, הגודל שלהם, ואת המבנה בתוך תאים בודדים וכי הצורה היציבה של המיטוכונדריה יכולה להשתנות בין סוגי תאים. עשרות שנים של מחקר ממעבדה שונהoratories מראה כי השינוי של צורת המיטוכונדריה, גודל ומבנו, דינמיקה המיטוכונדריה פנתה במשותף, הוא חיוני בשמירת פונקציות המיטוכונדריה שונה _^4,5,6. ממצאים אלה מעלים את האפשרות כי המיטוכונדריה יכול להשיג רב הפונקציונלית שלהם מכוח הדינמי המבני שלהם.

מאמצים נרחבים נערכים להבין את הקשר מבנה-תפקוד המיטוכונדריה. הדינמי של מבנה המיטוכונדריה נשמר בעיקר על ידי היכולת שלהם לעבור אירועי ביקוע ואיחוי אחד עם השני. ביקוע של המיטוכונדריה גדול ממיר אותם אלמנטי המיטוכונדריה קטנים, תוך היתוך בין שני המיטוכונדריה קטן ממזג אותם לאלמנט המיטוכונדריה גדול ^7. יתר על כן, היתוך חולף של שתי המיטוכונדריה עלול להתרחש כדי לאפשר הערבוב של תוכנם. אירועי הביקוע ואיחוי של ממברנות המיטוכונדריה הפנימיות וחיצוניות נשלטים בקפידה על ידי המפרטific קובע של חלבונים. מנגנון ביקוע הגרעין מורכב הקשורות dynamin חלבון 1 (Drp1), אשר גייס מן cytosol אל המיטוכונדריה ידי האינטראקציה שלה עם חלבונים המיטוכונדריה בתום לב מסוים (למשל, Fis1 או Mff1), בעוד פונקצית Drp1 יכולה גם להיות מוסדרת על ידי חלבונים אחרים על פני המיטוכונדריה ^4. למרות Drp1 פועלת על הממברנה החיצונית, יכולות הביקוע שלה להשפיע על הקרום הפנימי גם כן. התזמור של הביקוע של ממברנות המיטוכונדריה חיצוניות ופנימיות אינו מובן היטב. מצד השני, פיוז'ן של הקרום הפנימי נשלט על הליבה על ידי הפעילויות של Opa1, בעוד mitofusins השולטים ההיתוך של ^{5-הממברנה} החיצונית. יתרת אירועי הביקוע ואיחוי המנטרל של המיטוכונדריה להכתיב את צורת המיטוכונדריה היציבה בתא. לדוגמה, הדחקה של ביקוע המיטוכונדריה תביא היתוך שלם ללא התנגדות, בעוד יתר פעילות של המיטוכונדריהביקוע l יביא לפיצול של המיטוכונדריה ^3.

המחקר של קשר מבנה פונקצית המיטוכונדריה כרוך בעיקר שתי גישות מחמיאות: א) מנתח של פנוטיפים הסלולר האורגניזם לאחר מניפולציה גנטית של חלבוני היתוך / ביקוע המיטוכונדריה ב) הערכות ישירות של מבנה המיטוכונדריה ותפקוד. ראוי לציין כי אנליזה גנטית לא תמיד לחשוף את הפונקציונליות הישירה של המולקולה בהישג היד (במקרה זה, חלבוני היתוך / ביקוע המיטוכונדריה), כמו פנוטיפים שעלולים להתעורר עקב השפעות משניות. לכן, זה הוא בעל חשיבות עליונה לפתח ולהשתמש בכלים כדי לחקור את המבנה המיטוכונדריה ותפקוד ישירות. כל הערכה של מבנה המיטוכונדריה כרוכה כלים מיקרוסקופיה שונים. שימוש מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאי חיים התקדם המחקרים מאוד של דינמיקה המיטוכונדריה, מאז הדינמיות המיטוכונדריה ניתן לנטר הן מבחינה איכותיות quantitatively באמצעות כלי מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתאימים וטכניקות ^8. כלי מיקרוסקופיה קרינה מבוססות פותחו כדי לחקור את המבנה המיטוכונדריה ותפקוד ברקמות תסיסנית חיות וקבועות, הבהרת המשמעות של הדינמיות המיטוכונדריה vivo ^9. אלה ושיטות החישוב לסקר מתוארים כאן, עם המטרה של לימוד מבנה המיטוכונדריה ותפקוד בשחלה תסיסנית.

השחלה תסיסנית מורכבת שושלות בתאי מין וגם סומטיים, אשר נובעות בתאי גזע בוגרים שלהם שוכני germarium ^10,11. שישה עשר בתאי הנבט סינסיציאלי (GCS) לקבל במארז ידי תאי זקיק סומטי (FCS) כדי ליצור תאי ביצה הפרט העולות מתוך germarium (איור 1). אחת מ -16 GCS לקבל מחויב להיות ביצית, ואת GCS 15 הנותר להתפתח לתאי אחות ששומרים על הגדילה של תא הביציתאת הקלת הבשלת הביצית לפני שהוא הניח. רוב FCS לעבור 9 סיבובים של חטיבות mitotic לפני שהם יציאת מחזור תא mitotic סופנים להתמיין שכבת תא אפיתל בדוגמת המורכבת תאי זקיק קדמי (AFCs), תאי זקיק אחורי (PFCs), ותאי גוף עיקריים (MBCs) . תאי הביצה הרצופים מחוברים באמצעות תאי גבעול, אשר הם מובחנים תאים נגזרים גם FCS בשלב המוקדם של התפתחות. צורת מיטוכונדריאלי מוסדרת על ידי Drp1 חלבון ביקוע המיטוכונדריה מעורב באופן פעיל בתהליך של התמיינות במהלך ההתפתחות הנורמלית של שכבת FC שחלות תסיסנית ^9,12. שיטות שימוש במחקרים אלה כדי לזהות את המעורבות של Drp1 בפיתוח שכבת תאי זקיק תסיסנית מתוארות כאן.

Protocol

1. הכנת תסיסנית (הכלים הנדרשים מתוארים איור 2 א)

1. עבור כל אחד הניסויים שתוארו, לאסוף תסיסנית (נשמר בטמפרטורת החדר, או 25 ºC) בתוך 5 ימים של eclosion ומניחים אותם בתוך צנצנת ובתוכה 5 - 7 מ"ל של תסיסנית מזון (ראה לוח חומרים), עם לא יותר מ 25 זבובים בכל בקבוקון; לשמור על נקבה: יחס זכר 2: 1.
2. מפזר כמות קטנה של שמרים מגורענים כדי לעורר ייצור ביצים תסיסנית. בצע מניפולציה ניסויית בתוך 2 - 4 ימים.

2. Dissection של תסיסנית השחלות (הכלים הנדרשים מתוארים איור 2 א)

1. חרק חם לנתח בינוני (ראה לוח חומרים) לטמפרטורת החדר, 25 ° C. מלאו שלוש בארות של המנה לנתח זכוכית שמונה היטב, עם 200 μL של מדיום בכל טוב.
2. להרדים תסיסנית עם CO _{2 על ידי הצבת המחט של אקדח המכה מתחת תקע הבקבוקון. מניחים אותם על משטח זבוב. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, למיין 5 נקבות ומניחים אותם הבאר הראשונה של המנה לנתח. טפל תסיסנית אחד בכל פעם בעת ביצוע מיקרוסקופיה חי.}
3. בעוד אני מסתכל דרך העינית של המיקרוסקופ לנתיחה, לנתק את החזה מהבטן באמצעות שני זוגות מלקחיים. באמצעות המלקחיים, בזהירות להעביר את הבטן אל הבאר השנייה של המנה.
4. השתמש זוג אחד של מלקחיים להחזיק את הבטן בקצה האחורי, ולאט לאט לדחוף את השחלות החוצה (יחד עם תכולת בטן האחרת) עם הזוג האחר של מלקחיים. אם ניסיון זה נכשל, הסר את שלד חיצוני בטן בקפידה על ידי החדרת מלקחיים אל הקצה הקדמי כדי לשחרר את השחלות.
5. באמצעות המלקחיים, להחזיק השחלה בודדת עד הסוף האחורי האטום (כלומר, מלאות חלמון, בשלב מאוחר ביצים) והעבר אותו בזהירות אל הבאר השלישית של המנהעבור מתגרה כדי שיעבדו אותו במיקרוסקופ חי (שלב 3) או לתיקון לבצע immunostaining (שלב 7).
6. בזהירות להקניט את הנדן המגן מרחבי השחלות ידי גורף מחט מתגרה בקלילות מן האחורי אל הקצה הקדמי של כל השחלה כשהוא אוחז בו עד הסוף האחורי עם זוג המלקחיים.
   הערה: כדי למזער את הנזק במהלך מתגרה, לכופף את קצה המחט להתמקד על כל השחלה על ידי הגדלת ההגדלה של המיקרוסקופ (איור 2 א). להקניט צריכה להיות יעיל מספיק כדי לשבור את הנדן, אבל הוא צריך גם להיעשות בזהירות כדי לשמור על השלמות של ovarioles.

3. הכנה למיקרוסקופיה Live-רקמה

הערה: הכלים הנדרשים מתוארים באיור 2A.

1. לפני לנתיחה תסיסנית, להכין תאי polyL ליזין מצופה. לשם כך, הנח שתי טיפות 20 μL של polyL ליזין (0.1 מ"ג / מ"ל) על coverglהתחת (14 מ"מ, מס '0) של צלחת פטרי עם רצפת זכוכית (35 מ"מ) במרחק סביר זה מזה כדי למנוע מיזוג של טיפות. האוויר יבש הצלחות עבור h 1 ב 37 ºC ולסמן את הקצוות של סרט polyL ליזין הלבן על החלק התחתון של הצלחת עם בטוש מחיק.
   הערה: תאי מצופה polyL ליזין יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע. אם באמצעות תא בעבר מצופה, להביא אותו לטמפרטורת החדר לפני תחילת לנתיחה תסיסנית.
2. הגדר את פרמטרי סריקה על המיקרוסקופ confocal לוודא כי המדגם יכול להיות צלם מייד לאחר השלמת הניתוח ואת ההרכבה, כמפורט להלן.
3. מקום אחד גזור והקניט השחלה (לאחר שלב 2 ומוכתמת, במידת הצורך, לאחר שלב 5) על אזור polyL ליזין מצופה מסומן ולהפיץ את השחלה עם המחט מתגרה להפריד את ovarioles. מניחים ירידה של 10 μL של המדיום לנתח חרקים על גבי השחלה, והקפד לכסות tהוא אזור polyL ליזין מצופה כולו. מכסים את צלחת פטרי.
4. מיד לבצע מיקרוסקופיה confocal של המדגם רכוב בטמפרטורת החדר.
   הערה: רק אחד תסיסנית צריך להיות גזור, מעובד, צלם בכל פעם. כמו כן, מיקרוסקופיה לא צריך להיות מבוצעת על 37 מעלות צלזיוס, אשר יהיה לחקות סביבת הלם חומה עבור רקמות תסיסנית.

4. הקרינה והפסד Photobleaching (FLIP) Assay להעריך המשכיות מטריקס מיטוכונדריאלי

הערה: משכיות מטריקס מיטוכונדריאלי במבנה המיטוכונדריה התמזג מוקם לאחר ההיתוך המוחלט של ממברנות פנימיים וחיצוניים המיטוכונדריה בעקבות התקדמות דרך שלבי ביניים. ביקוע של המיטוכונדריה עשוי חזרו על אותן הפעולות אך בכיוון ההפוך (איור 3 א). FLIP הוא מיקרוסקופיה מבוססי זמן לשגות השיטה וכמותיות, שניתן להשתמש בהם כדי להעריך המשכיות מטריקס המיטוכונדריההמדינה התמזגו הסופית של vivo לשעבר המיטוכונדריה (שלבים 3 ו -4 ב איור 3 א) בשחלות תסיסנית חי ^9. את assay FLIP מתבצע כאזור קטן של עניין (ROI) של המיטוכונדריה להביע מולקולת ניאון במטריצה המיטוכונדריה כי הוא photobleached במרווחי זמן קבוע (ROI FLIP באיור 3 א). כתוצאה מכך, בכל אזור המיטוכונדריה שמסביב כי היא רציפה עם ROI FLIP (ROI ניסיוני איור 3 א) יאבד אות בשל חילופי מולקולות במטריצה המיטוכונדריה הרציפה. ניסויי FLIP הפגינו כאן מבוצעים על תסיסנית מהונדסת מבטא mitoYFP, אשר מכיל את רצף מיקוד המיטוכונדריה של למקטע השמיני אדם ציטוכרום אוקסידאז מתויג עם YFP למקד אותו המטריצה המיטוכונדריה צורת diffusible בחופשיות. ניסוי דומה יכול גם להתבצע עם transgene מיטו pUASP-מיטו-GFP, כפי שדווח בעבר ^{9. פרוטוקול FLIP דומה ניתן להשתמש עם בדיקה ממוקדת במרחב הבין-הקרום המיטוכונדריה להיות מסוגל לזהות את משכיות נובע ההיתוך של החיצון אך לא את הקרומים המיטוכונדריה הפנימיים (שלב 2 ב איור 3 א).}

1. פתח את תוכנת רכישת התמונה על מיקרוסקופ confocal וכן להגדיר את הפרמטרים הסריקה המתאים בכרטיסייה "רכישה" (טבלה 1). בדוק את "סדרות עתיות," "הלבנה", ו "קופסאות אזורים" כדי לפתוח את אחת מהכרטיסיות. מכניס את ערכי פרמטרי רכישה המתאימים בכל כרטיסייה (טבלה 1).
   הערה: החריר יש להשאיר פתוח, בתור ניסוי זה נועד לפקח אות הכוללת מן האוכלוסייה המיטוכונדריה כולו בתאים בודדים.
2. השתמש העיני לאתר את תחומי העניין במהירות ברקמת החיה הרכובה.
   הערה: בחר את ovarioles כי מפוזרים היטב על-bottome זכוכיתהמנה ד, מאז מיקרוסקופיה confocal לא יכול להתבצע על ovarioles צף.
3. לחץ על "לחיות" כדי לרכוש תמונה חיה של השדה הנבחר של עניין. לחץ על "עצור" כדי לעצור את הסריקה בזמן אמת.
4. במידת הצורך, להתאים את הפרמטרים רכישת כך אות ניאון מזוהה הוא מתחת לרמות רוויה (מסומן על ידי בהעדר פיקסלים בצבע אדום כאשר אפשרות "מחוון טווח" מסומנת), עם רקע מוגדר כפי שנקבע על ידי התאמת ערכי לקזז.
5. צייר ROI קטן באמצעות כלי ציור בזייה מהכרטיסייה "האזורים" כדי לתחום את אזור photobleaching על התמונה נרכשה על ידי סריקה בזמן אמת.
   הערה: הגודל של ROI צריך להיות סביב 20 - 50% של האות הכולל פלורסנט המיטוכונדריה בתוך התא.
6. בצע את רכישת תמונה על ידי לחיצה על "התחל ניסוי".
7. לכמת את עוצמת הקרינה באמצעות קניינית או תוכנות קוד פתוח (ראה חומריםטבלה). רשום את האות הממוצעת מן ROI שבו לבן החוזר הוא ממוקדת (FLIP); את ROIs שבו לבן לא שבוצע באותו התא (ניסיוני); ההחזר על ההשקעה מתא מולבן אחר באותו שדה הראייה, להערכת לבנה כוללת במהלך תקופת הניסוי (הלבנה); ואת ההחזר על ההשקעה על אזור הרקע (רקע). הפחת את אות רקע הממוצעת המתקבל האות הממוצעת של ROIs האחר. לנרמל את האות ניאון עם האות מראש אקונומיקה הראשונית עבור התא בהתאמה.
8. מגרש את הנתונים המנורמלים באמצעות כל תוכנה והתוויית סטנדרטית.

5. מכתים חי עם צבעי מיטוכונדריאלי פלורסנט

הערה: מצב יציב מבנה המיטוכונדריה ופוטנציאל ניתן להעריך באמצעות צבעים המשלבים לתוך המיטוכונדריה במיוחד בתאים וברקמות חיים. יכול להיות מוכתם השחלות חיים תסיסנית vivo לשעבר עם המיטוכונדריה פלורסנטכתמים כדי להמחיש את המיטוכונדריה, להעריך מיני חמצן תגובתי המיטוכונדריה (Mito-ROS) ייצור, ועל מנת להעריך את פוטנציאל של המיטוכונדריה לכל המוני יחידה. ניתן להשיג זאת על ידי שיתוף מכתים עם אתיל אסתר tetramethylrhodamine לצבוע פוטנציומטרית המיטוכונדריה (TMRE) וכתם המיטוכונדריה תואם חי המייצג את מסת המיטוכונדריה (ראה לוח חומרים עבור צבעים ספציפיים).

1. לדלל את המניות של כתמי חרקים חמים לנתח בינוני עד ריכוזי העבודה הסופיים: כתם המיטוכונדריה, 250 ננומטר; TMRE, 50 ננומטר; כתם Mito-ROS, 5 מיקרומטר.
2. לאחר דיסקציה ולגרות השחלות לאחר שלב 2, למקם את השחלות לתוך 200 μL של כל פתרון מכתים מסוים באר צלחת לנתיחה. דגירה אותם במשך 10 דקות עם צלחת מכוסה התיבה מתאימה עטופה בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור. שטוף את השחלות מוכתמות על ידי העברת אותם בזהירות עם מלקחיים לתוך 3 בארות רצופות containinבינוני גרם ללא כתם.
3. עבור שיתוף מכתים עם TMRE ואת כתם המיטוכונדריה הכוללת התואם, בצע בפרוטוקול לעיל כדי להכתים ראשון עם TMRE ומייד עם כתם המיטוכונדריה הכולל (ללא כל צעדים לשטוף שביניהם).
4. הר השחלות על צלחת זכוכית עם תחתית מצופה polyL-ליזין, לאחר שלב 3 ולהתכונן מיקרוסקופיה confocal עם הפרמטרים סריקה המתאים (טבלה 1), בעקבות צעדים 4.2-4.4.
   הערה: האות מ הצבעים המשולבים לא החזיקה מעמד כאשר מנסה לעלות על הדגימות מוכתמות הרכבה בינונית.
5. סמן את התיבה חתך-Z כדי לפתוח את הכרטיסייה. סובבו את גלגל המיקוד לכיוון החלק התחתון של המדגם בזמן שהוא חי-סרק ולחץ על "הסט הראשון" כדי להגדיר את Z-סעיף התחתון. לעשות את אותו הדבר תוך כדי תנועת גלגל הפוקוס לקראת בכיוון ההפוך להגדרת הסעיף העליון.
6. בצע את רכישת תמונה על ידי לחיצה על "התחל ניסוי".
7. לכמת את עוצמת פלורסנט תקן רקע מן ROIs עבור אות רקע ואת התאים הבודדים (כמו בשלב 4.7) ואת עלילת הנתונים באמצעות כל תוכנה והתוויית.

דור 6. Drp1 Null פסיפסים

הערה: האסטרטגיה המשובטים משמש כאן מציגה חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שיבוטים -שלילית Drp1 null ברקע של רקע GFP חיובי, phenotypically wild-type כי הוא הטרוזיגוטיים genotypically עבור המוטציה Drp1 null ^9. הלם-חום הנגרמת היעד הכרה flippase-flippase (FLP-FRT) רקומבינציה mitotic אתר ספציפי בתיווך יוצר שיבוטים הומוזיגוטים של אלל drpKG03815 null מבחינה תפקודית. הגנוטיפ של תסיסנית נושאת מוטצית Drp1 הוא drpKG03815 FRT40A / ארגון נוער קתולי, ואילו גנוטיפ נושאה את חום הלם-induced FLP (hsFLP) סמן משובט UbiGFP הוא hsflp; NLS-GFP היוביקוויטין (UbiGFP) 40A FRT / ארגון הנוער הקתולי. הגנוטיפ של seצאצאי lected של ההכלאה בין גנוטיפים לעיל הוא hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.

1. סנכרן את תסיסנית לאיסוף בתולה ידי העברת לתוך צלוחיות חדשות של מזון טרי כל 2 עד 3 ימים. צג צלוחיות pupariating יומי כדי לאסוף נקבות בתולה מתעוררות.
2. אסוף נקבות בתולה אדומות עיניים, מתולתל-אגף לבין גנוטיפ מוטצית Drp1 כל יום, פעם בבוקר ופעם בערב, ולהכניס אותם לתוך בקבוקון נפרד. במקביל, לאסוף זכר תסיסנית בעיניים אדומות כהות וכנפיים ישר נושאת hsflp ו UbiGFP בתוך 5 ימים של eclosion.
3. הגדרת צלב על ידי הוספת הזכרים והנקבות בתולה עם נקבה: יחס זכר 2: 1.
4. מפזר כמות קטנה של שמרים מגורענים כדי לעורר ייצור ביצים.
   הערה: בזהירות להזיז את תסיסנית בקבוקון טרי של תקשורת כל 2 עד 3 ימים כדי להגדיל את כמות צאצאים וכדי להקטין צפיפות בקבוקון.
5. esthetize, למיין, ולאסוף ישר כנפיים, צאצאי נקבה אדומים עיניים בתוך 5 ימים של eclosion.
6. עבור הלם החום, למקם את תסיסנית שנאספה לתוך צלוחיות ריקות עם כמות קטנה של שמרים מגולענים קטנה, רך לנגב (לספוג את הלחות במהלך הלם החום). מניחים את הצנצנת עם תסיסנית באמבט מים ב 38 ºC עבור H 1, כדי ליצור שיבוטים תא זקיק בעיקר, ו ב 37 ºC עבור h 1 פעמיים ביום (המאפשר h 5 לפחות בין 2 הזעזועים חום) עבור 2 ימים רצופים , כדי ליצור בתאי מין וגם שיבוטים תא זקיק שניהם.
   הערה: ודא כי הבקבוקון הוא שקוע לחלוטין בתוך המים עד לרמה של התקע.
7. ההלם החום עלול להפוך את נייח תסיסנית. אפשר תסיסנית חום בהלם להתאושש במשך 1 שעות בטמפרטורת החדר כאשר הם הופכים ניידים שוב.
8. מוסיף את הזכרים חזרה הנקבות באותו היחס כמו הצלב, ולהעביר אותם בקבוקונים טריים עם mediuמ זרוע כמות קטנה של שמרים מגורענים. שמירה על תסיסנית במשך 5 ימים לפחות.
9. לנתח את השחלות לפי צורך עבור ניסוי חי או קבוע.
   הערה: השחלות מבודדות UbiGFP תסיסנית להביע וההורים נדרשות לשמש שולטים שלילי כדי לאשר את האינדוקציה היעילה של שיבוטי GFP שלילי על ידי הלם החום.

7. Co-immunostaining עבור Cyclin E ו המיטוכונדריה

הערה: כדי לזהות תסיסנית Cyclin E (dCyclinE), השתמשנו נוגדן מסחרי השיג שאותן עורר נגד dCyclinE ⁹ (ראה חומרי טבלה). כסמן המיטוכונדריה, השתמשנו נוגדן כנגד ATP-B (למקטע של המתחם synthase ATP במיטוכונדריה) ^9.

1. paraformaldehyde 4% חם (PFA) לטמפרטורת החדר, 25 ° C. זְהִירוּת! Paraformaldehyde רעיל.
   הערה: לאחר פתיחהאת האמפולה, יש לאחסן PFA ב 4 ° C בשימוש בתוך 7 ימים. הסיבה לכך היא אחסון של PFA עשוי לאפשר חמצון מתנול, אשר תשנה ממברנות המיטוכונדריה דרמטי במהלך קיבעון, גם אם נוכח כמויות זעירות.
2. מייד לאחר דיסקציה, לתקן את השחלות הגזורות על ידי הציב 200 μL של PFA הטרי באר צלחת לנתח זכוכית (ללא התגרות). שמור את המנה במנדף במשך 15 דקות. שטוף את ההשחלות הקבועות על ידי הזזה אותם בזהירות עם המלקחיים לתוך 3 בארות רצופות, שכל אחת מהן מכיל 200 μL של בופר פוספט 1x (PBS).
   הערה: הניסוי ניתן לעצור פה הדגימות ניתן שמאלה 4 ºC עבור 1 יום.
3. להקניט את השחלות באופן יסודי יותר ב PBS (בדומה לשלב 2.6) כדי להסיר את הנדן סיבי המגן בזהירות שעשויה לעכב גישת אנטיגן על ידי הנוגדן.
4. Permeabilize השחלות הקניטו ידי הצבת בתוך שפופרת microfuge עם 500 μL של טריות 0.5% PBS-טריטון-X100 (PBS-טק) ו דגירה אותו במשך 30 דקות תוך נדנדה ב 25 סל"ד.
   הערה: במהלך הנדנדה, ומקום הצינורות מקבילים לתנועת הנדנדה; הצבתי בניצב עשוי לאפשר לרקמות להיצמד הכובע של הצינורות, ובכך וכתוצאה מכך אובדן רקמות.
5. כדי להסיר את PBS-TX, והמקום צינורות microfuge לתוך מעמד לוודא לאפשר לרקמות להתיישב בחלק התחתון של החצוצרות. בדוק אותם באופן חזותי והקש על הצינורות, במידת צורך, כדי להביא את כל רקמות צפו עד לתחתית. לשאוב את הפתרון בזהירות מלמעלה, ולוודא כי הרקמות בחלק התחתון של הצינורות נשארות באין מפריע.
6. חסום את השחלות על ידי הוספת 200 μL של אלבומין 2% שור (BSA) מומס 0.5% PBS-TX, דגירה אותו על הנדנדה בטמפרטורת החדר 1 ח. הסר את סוכן החסימה ידי ביצוע צעד 7.5.
7. הוספת נוגדנים ראשוניים ב 200 μL של סוכן חסימה טרי: נוגדן נגד ארנב dCyclinE (1: 100) ו נוגדן אנטי עכבר ATP-B(1: 100). דגירת הרקמות על הנדנדה עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר.
8. שטפו את השחלות עם PBS-TX 3 פעמים במשך 15 דקות כל אחד, לאחר שלב 7.5.
9. הוספת 200 μL של נוגדנים משני המתאימים-TX PBS הטרי: CY3 אנטי עכבר (1: 1,000) ו-Cy5 נגד הארנב (1: 500). דגירה על הנדנדה 1 שעות בטמפרטורת החדר.
10. שטפו את השחלות עם PBS-TX 3 פעמים במשך 15 דקות כל אחד, לאחר שלב 7.5.
11. כדי להכתים את ה- DNA, להוסיף Hoechst (1: 1,000 דילול) כדי לשטוף PBS-TX הסופי.
12. לבסוף, להשאיר את הרקמה 500 μL של 1x PBS.
13. שימוש micropipette 1 מ"ל, להסיר את השחלות immunostained מהצינור microfuge לבאר טריים של צלחת לנתח זכוכית המכיל 200 μL של PBS.
14. הוסף טיפה אחת של הרכבה בינונית מבוסס גליצרול לשקופית זכוכית ומוסיף את אחד שחלות immunostained אחרות זה לפני ההרכבה הבינונית.
    הערה: ודא כי השחלות אכן מועברות ההרכבה הבינונית. משנכשל לעשות so יוביל לאובדן רקמות.
15. בעוד אני מסתכל מבעד למיקרוסקופ לנתיחה, בעדינות לקטוף את ovarioles השקוף (שלבים צעירים) מתאי הביצית בשלה האטומים באמצעות המחט המתגרה כשהוא אוחז את החלק האטום של השחלה עם המלקחיים. הסר את תאי ביצית בשלה מן המדיום גובר.
16. מניח coverglass (22 מ"מ, מס '1) בשקופית ולחץ קל על מנת להבטיח כי ההרכבה בינונית משתרע מתחת אחיד.
    הערה: לחיצה על coverglass גם מבטיחה את היישור הנכון של הרקמות לאורך coverglass. אם לא תעשה זאת בצורה אופטימלית עשוי לאפשר בשלבים קטנים לצוף הרכבה בינונית, מניעת מיקרוסקופיה אופטימלית של רקמות אלה.
17. אוויר יבש דגימות במשך 15 דקות וסוגרים את הקצוות של coverglass בזהירות עם לק.
18. בצע מיקרוסקופיה confocal לפי הצורך הניסוי (טבלה 1).

תוצאות

השיטות שתוארו ניתן להשתמש כדי לחקור את המבנה המיטוכונדריה ותפקוד שחלות תסיסנית חיות וקבועות (איור 2 ב). בתנאים כמה דוגמאות של תוצאות חזויות שהושגו עם השיטות שתוארו.

דיסקציה של ה?...

Discussion

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

Photobleaching: מניעת photobleaching מופרזת של דגימות ניאון הוא הכרחי כדי ביצוע מיקרוסקופיה confocal יעיל. לכן, הזמן שלוקח לאתר דגימות דרך העינית או להגדיר פרמטרים רכישת התמונה דרך במצב סריקה בזמן אמת צריך לה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain)	Life Technologies	m7514	Reconstitute and Aliquot
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate	Sigma Aldrich	87917-25MG	Reconstitute and Aliquot
MitoSox (Mito-Ros stain)	Life Technologies	m36008	Reconstitute and Aliquot
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Conicals	Fisher Scientific	AS-355
Fly Vial Flugs	Fisher Scientific	AS273
Fly Conical Flugs	Fisher Scientific	AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300)	Santa Cruz	sc- 33748
ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker	AbCam	ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-175-144
Hoechst	Fisher Scientific	H3570
VectaShield	Fisher Scientific	H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Active Dried Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Confocal Microscope	Carl Zeiss	LSM 700
Dumont #5 Forceps	Fine Science Technologies	11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Dissecting Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000
Analyses software	Carl Zeiss	Zen
Analyses software	Open source	Image J
Research Macro Zoom Microscope	Olympus	MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono	QImaging	QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1	QImaging