ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים

Summary

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

Abstract

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

Introduction

אחד האתגרים העיקריים של שירותי בריאות במאה ה ^-21 הם מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD). טאו הוא חלבון הקשורים-microtubule שמגר microtubule היווצרות (MT). טאו מעורב באותה מידה בכמה הפרעות ניווניות, tauopathies שנקרא, מתוכם את הטוב ביותר הידוע הוא לספירה. בהפרעות אלה, אגרגטים עצמיים טאו בחוטי סליל לזווג (PHFs) והוא נמצא שונה על שאריות רבות על ידי שינויי posttranslational (PTMs) כגון זרחון ^1. זירחון של חלבון טאו הוא מעורב בשני הסדרת תפקודו הפיזיולוגי של ייצוב MT ואובדן פתולוגית של פונקציה המאפיינת נוירונים לספירה.

יתר על כן, חלבון טאו, כאשר משולבים PHFs בנוירונים חולה, ללא יוצא מן הכלל הוא hyperphosphorylated ^2. בניגוד טאו רגיל המכיל 2-3 קבוצות פוספט, את טאו hyperphosphorylated ב PHFs מכיל 5 עד 9 phosphatקבוצות דואר ^3. Hyperphosphorylation של טאו תואמת הן לעלייה של stoichiometry בכמה אתרים כדי זירחון של אתרים נוספים שנקראים אתרי פתולוגית של זירחון. עם זאת, קיימת חפיפה בין AD ודפוסים מבוגרים נורמלים של זירחון, למרות הבדלים כמותיים ברמה ^4. איך פונקצית השפעה ספציפית אירועי זירחון לבין תפקוד לקוי של טאו נותר ברובה לא ידוע. אנו שואפים לפענח תקנת טאו ידי PTMs ברמה המולקולרית.

כדי להעמיק את ההבנה של ההיבטים המולקולריים של טאו, אנחנו צריכים להתמודד עם אתגרים טכניים. ראשית, טאו הוא חלבון סדר מהותי (IDP) כאשר מבודדים בתמיסה. חלבונים כאלה חסרי מבנה תלת ממדי מוגדר היטב גם במצב רגיל וגם דורשים שיטות biophysical בפרט ללמוד תפקידם (ים) ו תכונות מבניות. טאו היא פרדיגמה עבור המעמד ההולך וגדל של עקורים, נמצא לעתים קרובות קשורפתולוגיות כגון מחלות ניווניות, ומכאן גברת העניין כדי להבין את הפרמטרים המולקולריים שבבסיס תפקידיהם. שנית, אפיון של זירחון טאו הוא אתגר אנליטי, עם 80 אתרי זירחון פוטנציאל לאורך הרצף של איזופורם טאו 441 חומצות אמיניות הארוכה. מספר הנוגדנים פותח כנגד אפיטופים פוספורילציה של טאו ומשמש לצורך זיהוי של טאו פתולוגי בנוירונים או רקמת המוח. אירועי זירחון יכולים להתקיים ב -20 אתרים לפחות על כוונת של קינאזות מכוונת פרולין, רובם בסמיכות בתוך אזור פרולין העשיר. טיבה האיכותי (אילו אתרים?) וכמוני (מה ורכב?) אפיון קשה אפילו על ידי טכניקות MS האחרונות ^5.

ספקטרוסקופיה NMR יכול לשמש כדי לחקור חלבונים סדר כי הם מערכות דינמיות מאוד היוו של הרכבים של conformers. ספקטרוסקופיה NMR ברזולוציה גבוהה הייתה applied לחקור הן המבנה והתפקוד של חלבון טאו. בנוסף, את המורכבות של פרופיל זירחון של טאו הובילו לפיתוח של כלים מולקולריים ושיטות אנליטיות חדשות באמצעות NMR לזיהוי אתרי זירחון ^{6 - 8.} תמ"ג כשיטת אנליטיים מאפשר זיהוי של אתרי זירחון טאו באופן גלובלי, ויזואליזציה של כל השינויים באתר יחיד בניסוי יחיד, וכימות של היקף ההתאגדות פוספט. נקודה זו חיונית שכן למרות שמחקרים זירחון על טאו בשפע בספרות, רובם בוצעו עם נוגדנים, משאיר מידה רבה של אי-ודאות לגבי הפרופיל המלא של זרחון ובכך את ההשפעה האמיתית של אירועי זירחון פרט. קינאזות רקומביננטי כולל PKA, 3β קינאז גליקוגן-synthase (Gsk3β), A 2 / cyclin קינאז Cyclin התלוי (CDK2 / CycA), קינאז תלוי-ציקלין 5 (CDK5) / מעשה p25 חלבון ivator, קינאז התאי מוסדרת-אות 2 (ERK2) ו microtubule-זיקה-ויסות קינאז (MARK), אשר ניכר פעילות זירחון כלפי טאו, ניתן להכין בצורה פעילה. בנוסף, מוטציות טאו המאפשרות יצירת isoforms חלבון טאו ספציפי עם דפוסי זירחון היטב מאופיינים משמשות לפענח את קוד זירחון של טאו. ספקטרוסקופיה NMR מכן נעשה שימוש כדי לאפיין דגימות טאו שונה enzymatically ^{6 - 8.} למרות במבחנה זירחון של טאו הוא יותר מאתגר מאשר-זירחון פסאודו כגון על ידי מוטציה של הנבחרת שירו / Thr לחומצה גלוטמית (Glu) שאריות, גישה זו יש לגופו. ואכן, לא פרמטרי ההשפעה ולא אינטראקציה המבניות של זירחון ניתן חיקה תמיד על ידי חומצות גלוטמית. דוגמה לכך היא המוטיב בתורו נצפה סביב phosphoserine 202 (pSer202) / phosphothreonine 205 (pThr205), אשר אינו משוחזר עם Glu מוטציות ^9.

ss = "jove_content"> כאן, הכנת טאו שכותרתו isotopically לחקירות NMR יתואר ראשון. חלבון טאו פוספורילציה ידי ERK2 הוא שונה באתרים רבים מתוארים באתרי פתולוגית של זירחון, ובכך מייצג מודל מעניין של טאו hyperphosphorylated. פרוטוקול מפורט של טאו בזירחון במבחנה על ידי קינאז ERK2 רקומביננטי מוצג. ERK2 מופעל על ידי זירחון על ידי קינאז חלבון מופעל mitogen / קינאז ERK (MEK) ^{10 - 12.} בנוסף ההכנה שונה, שכותרתו isotopically חלבון טאו, אסטרטגית NMR המשמשת לזיהוי של PTMs מתוארת.

Protocol

1. ייצור של ¹⁵ N, ¹³ C-טאו (איור 1)

1. Transform פלסמיד ביטוי T7 רקומביננטי pET15b-טאו ^13,14 לתוך BL21 (DE3) תאים חיידקיים המוסמכות coli Escherichia ^15.
   הערה: קידוד cDNA עבור איזופורם טאו הארוך (441 שאריות חומצת אמינו) הוא משובטים בין NcoI ו XhoI אתרי הגבלה פלסמיד pET15b.
   1. מערבבים בעדינות 50 μl של BL21 המוסמכת (DE3) תאים, ויצרו 1-5 x 10 ⁷ מושבות לכל מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד, עם 100 ננוגרם של DNA פלסמיד בתוך שפופרת פלסטיק 1.5 מ"ל.
      הערה: קודון-שימוש אופטימיזציה זני חיידקים לביטוי cDNA איקריוטיים אינם חיוניים לייצר טאו אדם.
   2. מניחים את תערובת תאים על קרח למשך 30 דקות ולאחר מכן הלם חום במשך 10 שניות על 42 מעלות צלזיוס. מניחים את הצינור בחזרה על קרח למשך 5 דקות ולהוסיף 1 מ"ל של בטמפרטורת החדר LB (לוריא- Bertani) בינוני. לדגור על השעיית חיידקים על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תחת עדיןתסיסה.
2. מורח באמצעות לולאת חיסון 100 μl של השעית התא באופן שווה על צלחת אגר של מדיום LB המכיל 100 מיקרוגרם / מיליליטר של אנטיביוטיקת אמפיצילין.
3. דגירה את הצלחת הבחירה במשך 15 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
4. שמור את הצלחת הבחירה ב 4 ° C עד שתמשיך לשלב תרבות, לכל היותר 2 שבועות כ.
   הערה: מלאי גליצרול של התרבות חיידקים (50% גליצרול), המאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס, ניתן להכין להתחיל בתרבות בשלב מאוחר יותר.
5. הוסף 1 מ"ל 1 M ₄ MgSO, 1 מ"ל 100 מ"מ CaCl _2, 10 מ"ל 100x השלמה ויטמין MEM, 1 מ"ל 100 מ"ג / אמפיצילין מ"ל עד 1 ליטר של מלחים M9 autoclaved (6 גרם Na _{2 4} HPO, 3 גרם KH ₂ PO ₄ , 0.5 גרם NaCl).
   הערה: משקע לבן יהווה על תוספת של פתרון CaCl ₂ אל מלחי M9 כי מתפוגגים במהירות.
6. Solubilize 300 מ"ג של ¹⁵ N, ¹³ בינוני C-שלם, 1 גרם של ¹⁵NH ₄ Cl ו -2 גרם של ¹³ C ₆ -glucose ב 10 מ"ל של מדיום M9. סנן לעקר את הפתרון איזוטופ באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר, ישירות לתוך המדיום M9.
7. להשעות באמצעות המושבה חיסון לולאה אחת pET15b-טאו טרנספורמציה חיידקים מהצלחת הבחירה ב 20 מ"ל של מדיום LB בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אמפיצילין.
8. דגירה בינוני מחוסן ב 37 מעלות צלזיוס במשך כ -6 שעות.
9. מדוד צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD ₆₀₀₎ ב -1 מ"ל של דילול פי עשרה של התרבות חיידקים קובט ספקטרומטר פלסטיק.
   הערה: עכירות של תרבות החיידקים המתאימה OD ₆₀₀ של 3.0-4.0 עולה כי בשלב צמיחה הרוויה הוא הגיע.
10. הוסף 20 מ"ל של התרבות LB רווי 1 ליטר של מדיום הגידול M9 השלימו עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם / הריכוז הסופי מ"ל), ב 2 בקבוק תרבות L Erlenmeyer פלסטיק מבולבל.
11. מניח את בקבוק תרבות חממה לתכנות מוגדר 10 °C ו -50 סל"ד. לתכנת את החממה כדי לעבור 200 סל"ד ו -37 מעלות צלזיוס בשעות הבוקר המוקדמות של יום המחרת.
12. OD מדוד ₆₀₀ על 1 מ"ל של תרבית החיידקים ב קובט ספקטרומטר פלסטיק. להוסיף 400 μl של 1 M IPTG (איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside) פתרון מניות (כל הזמן ב -20 ° C) כאשר OD ₆₀₀ מגיע לערך של 1.0 עומד להשרות את הביטוי של חלבון טאו רקומביננטי.
13. המשך הדגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופת hr 3 נוספת. אסוף תאים חיידקיים ידי צנטריפוגה ב 5000 XG במשך 20 דקות.
14. להקפיא את גלולת החיידקים ב -20 ° C. שמור קפוא עד שלב הטיהור, במשך תקופה ארוכה במידת צורך.

טיהור 2. של ¹⁵ N, ¹³ C-טאו (איור 2)

1. מאגרי טיהור קטיון חילופי חיטוי (CEX) ב 121 מעלות צלזיוס מתחת לגיל 15 psi במשך 20 דקות. מאגרי חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
2. ההפשרה גלולה תא החיידק ו resuspend ביסודיות 45 מ"לממוצא CEX חיץ (50 מ"מ NaPi חיץ pH 6.5, 1 mM EDTA) השלימו טרי עם 1x קוקטייל מעכבי פרוטאז (1 טאבלטים) DNAseI (2,000 יחידות).
3. לשבש תאים חיידקיים באמצעות homogenizer בלחץ גבוה ב -20,000 psi. 3-4 עובר נחוצים. צנטריפוגה ב 20,000 XG במשך 40 דקות כדי להסיר חומר מסיס.
4. מחמם את תמצית תא החיידק במשך 15 דקות ב 75 מעלות צלזיוס באמצעות אמבט מים.
   הערה: משקע לבן הוא ציין לאחר כמה דקות.
5. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 20 דקות ולשמור את supernatant המכיל את חלבון טאו חום יציב.
6. חנות ב -20 ° C עד שלב הטיהור הבא, במידת צורך.
7. בצע כרומטוגרפיה קטיון החליפין על שרף CEX חזק ארוז כגיס 5 מ"ל המיטה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר (FPLC) מערכת (איור 3).
   1. קצב הזרימה נקבע ל -2.5 מ"ל / דקה.
   2. לאזן את העמודה CEX חיץ
   3. טען את heated- 60-70 מ"ללחלץ המכיל טאו באמצעות משאבת מדגם, או לחילופין לשאוב A, בהתאם למערכת. אסוף את הזרימה דרך לניתוח על מנת לוודא כי חלבון טאו מחייב ביעילות השרף (ראה 2.8).
   4. לשטוף את השרף עם CEX חיץ עד ספיגה ב 280 ננומטר הוא חוזר לערך בסיס.
   5. Elute טאו מהעמודה באמצעות שיפוע NaCl שלושה שלבים מתקבל על ידי עלייה הדרגתית של חיץ B CEX (CEX חיץ עם 1 M NaCl). תכנת את FPLC כדלקמן: השלב הראשון של שיפוע עד 25% CEX B חיץ 10 כרכים עמודה (CV) להגיע 250 מ"מ NaCl, הצעד השני ל -50% CEX B חיץ 5 קורות חיים כדי להגיע ל -500 מ"מ NaCl, ואת השלב השלישי עד 100% CEX B חיץ 2 CV להגיע 1 M NaCl. אסוף 1.5 מיליליטר שבר במהלך שלבי elution.
8. לנתח 10 μl של שברים שנאספו במהלך השלב elution ידי SDS-PAGE (12% ג'ל SDS-acrylamide) ו Coomassie מכתים (איור 3 א) ^16. בדוק את שלב הטעינה על הטור, כמו גם על ידי analyזיע 10 μl של דרך-זרימה.
9. בחר שברים המכיל טאו ובריכת שברים אלה לשלב הבא.
10. בצע חילוף חיץ על טאו המכיל שברים ונקוו (איור 3 ב ').
    1. לאזן טור desalting מהמיטה ארז שרף 53 מ"ל G25 (26 x 10 ס"מ) אמוניום ביקרבונט 50 מ"מ (חיץ נדיפים) באמצעות מערכת FPLC.
    2. קצב הזרימה סט 5 מ"ל / דקה. להזריק את מדגם טאו על עמודה באמצעות לולאה הזרקת 5 מ"ל. אסוף שברים המתאים שיא ספיגת ב 280 ננומטר.
    3. חזור על הזריקה 3-4 פעמים, תלוי בנפח של ברכת CEX הראשונית.
11. לחשב את כמות החלבון טאו מטוהרים באמצעות אזור השיא של chromatogram ב 280 ננומטר (1 מ"ג של טאו תואמת 140 מאו * מ"ל).
    הערה: מקדם ההכחדה של חלבון טאו ב 280 ננומטר היא 7,550 M ^-1 cm ^-1. טאו אינו מכיל שאריות TRP.
12. הברכה כל שברי טאו.
13. Aliquot המדגם לתוך צינורות המכילים את המקבילה של 1 עד 5 מ"ג של טאו. בחר צינורות אלה, כך היקף הפתרון הוא קטן בהשוואה להיקף הצינור (למשל 5 מ"ל של תמיסת בתוך שפופרת 50 מ"ל).
14. פונץ 'חורי כמוסות הצינור באמצעות מחט. להקפיא דגימות טאו ב -80 מעלות צלזיוס.
15. Lyophilize דגימות טאו. חלבון Lyophilized טאו יכול להישמר ב -20 מעלות צלזיוס במשך פרקי זמן ארוכים.

3. במבחנה זירחון של ¹⁵ N-טאו

1. ממיסים 5 מ"ג טאו lyophilized במאגר 500 זירחון μl (50 מ"מ Hepes · KOH, pH 8.0, 12.5 מ"מ MgCl _2, 1 mM EDTA, 50 מ"מ NaCl).
2. להוסיף 2.5 מ"מ ATP (25 μl של 100 מ"מ מניות פתרון והמשיך ב -20 מעלות צלזיוס), 1 מ"מ DTT (1 μl של 1 M פתרון מניות והמשיך ב -20 ° C), 1 מ"מ EGTA (2 μl של המניה 0.5 M פתרון), מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x (25 μl של המניה 40x מתקבל על ידי המסת 1 לוח במאגר 1 מ"ל זירחון) ו -181; M המופעל ERK2 שלו (250 μl חיץ שימור 10 מ"מ Hepes, pH 7.3, 1 מ"מ DTT, 5 מ"מ MgCl _2, 100 מ"מ NaCl ו -10% גליצרול, לאחסן ב -80 ° C) בהיקף המדגם של 1 מ"ל.
   הערה: המופעל ERK2 שלו יכול להיות מוכן בתוך הבית ^5,8 ידי זרחון עם קינאז MEK.
3. דגירה 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
4. מחממים את המדגם ב 75 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להשבית קינאז ERK.
5. צנטריפוגה ב 20,000 XG במשך 15 דקות. לאסוף ולשמור את supernatant.
6. Desalt המדגם חלבון לתוך אמוניום ביקרבונט 50 מ"מ באמצעות טור מהמיטה ארז שרף 3.45 מ"ל G25 (1.3 x 2.6 ס"מ), אשר מתאים מדגם 1 מ"ל.
7. הפעל 12% SDS-PAGE ¹⁶ עם 2.5 μl של מדגם החלבון לבדוק הן שלמותה זירחון ביותר (איור 4).
8. Lyophilize מדגם טאו פוספורילציה. אחסן את האבקה ב -20 ° C.

4. רכישת NMR ספקטרה (אלחוטיאיור 5)

1. Solubilize 4 מ"ג lyophilized ¹⁵ N, ¹³ C ERK-פוספורילציה-טאו חיץ 400 μl תמ"ג (50 מ"מ NaPi או 50 מ"מ deuterated כמה עצוב D11 .cl, pH 6.5, 30 mM NaCl, 2.5 mM EDTA ו 1 מ"מ DTT).
2. הוסף 5% D ₂ O עבור נעילה בתחום ספקטרומטר תמ"ג ו -1 מ"מ TMSP (3- (trimethylsilyl) מלח נתרן propionic-2,2,3,3-ד ₄ חומצה)) כנקודת התייחסות אות תמ"ג פנימי. הוסף 10 μl של פתרון 40x מלאה של מעכבי פרוטאז קוקטייל שלם.
3. מעביר את המדגם בתוך שפופרת NMR 5 מ"מ באמצעות מזרק אלקטרוני עם מחט ארוכה או פיפטה פסטר. סגור את צינור NMR באמצעות הבוכנה. הסר את כל בועות אוויר שנלכדו בין הבוכנה ונוזל ידי תנועות הבוכנה.
4. מניח את צינור תמ"ג הצנטריפוגה. התאם במצב האנכי שלה טווה עם המד המתאים ראש חללית NMR בשימוש, באופן שמרבית הפתרון המדגם יהיה בתוך סליל NMR.
5. הפעל את זרימת האוויר: לחץ אני מריםn חלון מערכת בקרת מגנט. בזהירות במקום טווה עם הצינורית את זרימת האוויר בחלק העליון של קנה המגנט. עצור את זרימת האוויר (לחץ מעלית) ולתת הצינור לרדת למקומו בתוך ראש בדיקת המגנט.
6. טמפרטורה מוגדרת 25 ° C (298 K).
7. בצע חצי אוטומטי כוונון והתאמה של ראש החללית כדי לייעל העברת כוח. הקלד atmm על שורת הפקודה.
8. נעל את תדירות ספקטרומטר באמצעות האות D ₂ O של המדגם נרשם בערוץ דאוטריום. לחץ מנעול בחלון מערכת בקרת מגנט.
9. להתחיל את הליך shimming כדי לייעל ההומוגניות של השדה המגנטי בעמדה של המדגם. הקלד topshim GUI בשורת הפקודה כדי לפתוח את חלון שים. לחץ להתחיל בחלון שים. בדוק את ערך הגירסה הסטנדרטית שיורית B0 כדי לוודא shims הם אופטימליים (פחות מ -2 הרץ הוא טוב).
10. כייל את הפרמטר p1 (אורך של פרוטוןדופק גלי רדיו ב μsec), אשר יש צורך לקבל 90 ° סיבוב של ספיני פרוטון. כוון את הדופק 360 ° באמצעות ספקטרום 1D הפרוטונים מים (איור 6).
11. התאם את התדירות בקיזוז קביעת פרמטר O1 (ב רץ) לתדר מי פרוטון בספקטרום 1D (איור 6).
12. התחל רכישת ספקטרום פרוטון 1D (רצף דופק עם רצף ווטרגייט לדיכוי אות מים, למשל zggpw5) לאמת אותות מן המדגם (איור 7). התאם את מספר סריקות על ריכוז החלבון יחסית. הקלד ZG על שורת הפקודה כדי להפעיל את הרכישה.
13. הגדרת פרמטרים נוספים לרכישת 2 ד ^[1 H, ¹⁵ N] ספקטרום HSQC (הדופק רצף hsqcetfpf3gpsi, תרשימים 8-9).
    1. במשך ¹⁵ N, ¹³ C שכותרתו מדגם, לנתק ¹³ צלזיוס במהלך ¹⁵ האבולוציה העקיפה N.
    2. הגדר את מספר נקודות ואת רוחב ספקטרלי (ppm) ¹ H (F2) ו ^-15 N ממדים (F1).
       הערה: התאם את מספר נקודות הנתונים הרכישה לשדה ספקטרומטר לשמור על מספר דומה של הרץ לכל נקודה ולהגביל decoupling פעמים: להשתמש 3,072 נקודות ב -900 מגה-הרץ ו -2,048 נקודות ב 600 MHz, בממד ¹ H.
    3. מטב פרמטרים נוספים של הרצפים הדופקים, מתאים עיכובים, אורכי דופק, לקזז תדרים, רמות כוח. סוג ased על שורת הפקודה כדי להציג את כל הפרמטרים הרלוונטיים לניסוי.
14. פרמטרים שנקבעו לרכישת מגהרץ 3D ^[1 H, ¹⁵ N, ¹³ C] HNCACB ספקטרום (הדופק רצף hncacbgpwg3d, איור 10A) ב 600.
15. פרמטרים שנקבעו עבור 3D ^[1 H, ¹⁵ N, ¹⁵ N] ניסוי HNCANNH (hncannhgpwg3d רצף דופק) ב 600 MHz. הגדר את מספר נקודות 2048 ב H ¹ ו, 64ו -128 נקודות בשנתיים ¹⁵ N ממדים. הגדר את רוחב ספקטרלי כמו 14, 25, 25 חלקים למיליון (ppm) התרכזו 4.7, 119, 119 עמודים לדקה ב ¹ H, ¹⁵ N ו- ¹⁵ N ממדים. משך הרכישה עם 16 סריקות הוא יום 1 ו -22 שעות.

5. זיהוי של אתרי זירחון

1. ספקטרה תהליך באמצעות תוכנת רכישה והעיבוד NMR.
   1. בצע טרנספורמציה פורייה של הנתונים (איור 7). סוג רגל עבור ספקטרום 1D, xfb עבור ספקטרום 2D או ft3d עבור ספקטרום 3D, על שורת הפקודה.
   2. שלב והתייחסות כל ספקטרום (7C איור) באמצעות חלונות אינטראקטיביים.
2. זיהוי תהודות של עניין 2D HSQC המקביל פוטנציאל למשקעים שירו ו Thr פוספורילציה (איור 9, תיבה אדומה).
3. מטוסי חלץ (כלומר 2D ¹ H- ¹³ ספקטרה צלזיוס)ספקטרום 3D ¹ H- ¹⁵ N- ¹³ C באמצעות ¹⁵ N המשמרות הכימיות של תהודות של עניין 2D. השתמש הסמן של מימד 2 (W2) כדי לבחור את תדירות ¹⁵ N המקביל למישור (W1-W3) להיות דמיינו (איור 10 ב).
4. פיק תדרי התהודה של Ca '' ו 'CB' ¹³ גרעיני C של 'אני' ו 'אני-1 "שאריות (סט החלשות אותות בהשוואה לאלו של שאריות i) עבור כל ^[1 H, ¹⁵ N] תהודה עניין בספקטרום 3D HNCACB ידי לחיצה על התהודה, בתפריט מצב המצביע למצוא / להוסיף שיא, להוסיף את ערך המשמרת הכימי בקובץ רשימת שיא.
   1. זהה את סוג שאריות i, pSer או pThr, על ידי השוואת המשמרות הכימיות ברשימת השיא לערכים הידועים של CA משמרות כימיות CB של pSer ו pThr ^17.
   2. זיהוי נוכחות של שאריות פרו בבית i + 1 עמדה על ידי o שינוי מאפיין נוסף +2 עמודים לדקהf ערך המשמרת הכימי CA ^18.
   3. השווה את הערכים המשמרים הכימית של תהודות CA ו- CB מתאימות שאריות i-1 שולחן של משמרות כימיות ניבאו שאריות חומצת אמינו טאו ¹⁹ לזהות את אופי השאריות במיקום i-1.
5. פיק תדרי התהודה של ¹⁵ N גרעינים של 'אני' ו 'אני-1 "שאריות לכל ^[1 H, ¹⁵ N] תהודה של עניין ספקטרום HNCANNH.
6. השווה את הערכים המשמרים כימי ¹⁵ N אל משימת המשמרת הכימית של חלבון טאו ^{20 - 23.}
7. השווה את dipeptides המזוהה עם רצף טאו להגדיר את משימת רצף מסוימת.

תוצאות

איור 3 א מציג שיא ספיג גדול ב 280 ננומטר שנצפו במהלך שיפוע elution. שיא זה מתאים חלבון טאו מטוהרים כפי שניתן לראות על ג'ל acrylamide מעל הכרומתוגרמה. איור 3 ב מציג לשיא ספיגה מופרד היטב ב 280 ננומטר שיא של מוליכות, להבטיח כי desalting של החלבון הוא יעיל. איור 4 מראה ג'ל...

Discussion

השתמשנו ספקטרוסקופיה NMR לאפיין דגימות טאו שונות enzymatically. ביטוי רקומביננטי והטיהור המתוארת כאן עבור חלבון טאו אדם באורך מלא יכולים לשמש באופן דומה כדי לייצר מוטצית טאו או תחומי טאו. Isotopically חלבון מועשר נדרשת ספקטרוסקופיה NMR, דבר המחייב ביטוי רקומביננטי. זיהוי של אתרי ז?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET15B recombinant T7 expression plasmid	Novagen	69257	Keep at -20 °C
BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria	New England Biolabs	C2527I	Keep at -80 °C
Autoclaved LB Broth, Lennox	DIFCO	240210	Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100x	Sigma	58970C	Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder	Sigma	608297	Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl	Sigma	299251	Isotope
13C6-Glucose	Sigma	389374	Isotope
Protease inhibitor tablets	Roche	5056489001	Keep at 4 °C
1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C
DNaseI	EUROMEDEX	1307	Keep at -20 °C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3)	AVESTIN		Lysis is realized at 4 °C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker	Pierce	266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged	Sigma	M8822	Keep at -80 °C
AKTÄ Pure chromatography system	GE Healthcare		FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column)	GE Healthcare	17-5156-01	Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting	GE Healthcare	17-5087-01	Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25	GE Healthcare	28-9180-08	Protein Desalting column
Tris D11, 97% D	Cortecnet	CD4035P5	Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe)	Euriso-top	BMS-005B	NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit	Cortecnet	2910000	Pipetting
Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead	Bruker		NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead	Bruker		NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1	Bruker		Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114	UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller)		NMR data Analysis software