JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הקמנו שיטה לטיהור של חלבונים אינטראקציה coregulatory באמצעות מערכת LC-MS / MS.

Abstract

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.

Introduction

אינטראקציות בין חלבונים ממלאים תפקיד חשוב תפקודים ביולוגיים רבים. ככזה, אינטראקציות אלה היו מעורבים הולכים אותות; תחבורה חלבון על פני קרום התא; חילוף חומרים בתא; וכמה תהליכים גרעיניים, כולל שכפול הדנ"א, לתקן נזקים ב- DNA, רקומבינציה, והתעתיק 1, 2, 3, 4. זיהוי חלבונים מעורבים באינטראקציות אלה היא אפוא קריטי לקידום הבנתנו תהליכים תאיים אלה.

Immunoprecipitation (IP) היא טכניקה תוקף להשתמש כדי לנתח אינטראקציות בין חלבונים. על מנת להקל על זיהוי של חלבונים-immunoprecipitated שיתוף, ספקטרומטריית מסה הוא מנוצל לעיתים קרובות 5, 6, 7, 8,9. על ידי מיקוד חבר ידוע של קומפלקס חלבון עם נוגדן, אפשר לבודד את החלבון מורכב ובהמשך לזהות מרכיביה הידועים באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסה. ARIP4 (אינטראקצית קולטן האנדרוגן חלבון 4), coregulator תעתיק, אינטראקציה עם חלבונים רצפטור גרעיניים כדי להפעיל או לדכא יזמי היעד שלה באופן תלוי קשר 9, 10. כדי להבין טוב יותר את מנגנוני ויסות תעתיק מסדירי גורמים גרעיניים אלה, אנו מתארים שיטה מקיפה לטהר לזהות חלבוני אינטראקצית ARIP4 באמצעות מערכת LC-MS / MS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. Transfection

  1. זרעים HEK293 תאים צלחות תרבות 100 מ"מ (2 x 10 6 תאים / תבשיל). תרבות התאים במדיום של הנשר השונה של Dulbecco בתוספת 10% בסרום עוברי עגל, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו -100 יחידות / מיליליטר פניצילין. דגירה התאים בתוך חממה humidified ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס.
  2. למחרת, transfect את התאים עם 10 מיקרוגרם של פלסמיד ARIP4 מתויג FLAG באמצעות 40 μl של מגיב transfection פי הנחיות היצרן 11.

2. הפקת חלבון

  1. כ 36 שעות שלאחר transfection, לשטוף את התאים עם PBS קר כקרח ו לקצור את התאים באמצעות מגרד. העברת התאים לתוך 1.5 mltube צנטריפוגות זה ב 8000 XG במשך 2 דקות ב 4 °. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 5x נפח גלולה של חיץ 0.4 M KCl (חיץ מלח גבוהה: 20 מ"מ טריס- HCl (pH 8.0), 0.4 KCl M, 5 מ"מ MgCl 2, 10% גליצרול, 0.1% NP-40, 10 מ"מ ב-mercaptethanol, קוקטייל מעכב פרוטאז 1x). סובב את התערובת במשך 20 דקות ב 4 °.
  2. צנטריפוגה הצינור ב 17,700 XG במשך 10 דקות ב 4 °.
  3. מעבירים את supernatant (תמצית כל תא) לצינור 2 מ"ל חדשה ולהוסיף 3x נפח הראשונית של 0 חיץ M KCl (דילול חיץ: 20 מ"מ טריס- HCl (pH 8.0), 5 2 מ"מ MgCl, 10% גליצרול, 0.1% NP-40, 10 מ"מ β-mercaptoethanol, מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x).
  4. בצע צנטריפוגה אחרת (17,700 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C) ולהעביר את supernatant (תמצית התא כולו) לצינור 2 מ"ל חדש.

3. Immunoprecipitation

  1. במהלך צנטריפוגה (2.4), לשטוף 50 μl של חרוזים אנטי FLAG עם PBS, 0.1 מ 'גליצין-הידרוכלוריד, ולאחר מכן 1 M טריס-הידרוכלוריד, ואחריו כביסה פעמיים עם 0.1M KCl חיץ (חיץ מלח נמוכה: 20 מ"מ כמה עצוב HCl (pH 8.0), 0.1 מ 'KCl, 5 מ"מ MgCl2, 10% גליצרול, 0.1% NP-40, 10 מ'M ב-mercaptoethanol, מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x). צנטריפוגה עבור תהליך כביסה זה מבוצעת XG ב 2000 דקות 1 ב 4 ° C.
  2. מערבבים 50 μl של חרוזים FLAG עם תמציות כל תא בעדינות לסובב את התערובת במשך 4 שעות ב 2-4 מעלות צלזיוס (1% של תמצית כל תא משלב 2.4 צריך גם להישמר ב -80 ° C לשימוש עתידי כקלט).
  3. מעבירים את המדגם לעמודה ספין מיקרו (ירידה של כדור הארץ). שמור את הזרימה דרך צינור 1.5 מ"ל, להקפיא אותו באמצעות חנקן נוזלי, ולאחסן אותו ב -80 ° C (לבדוק את רמות החלבון של שני קלט זרימה דרך באמצעות ניתוח כתם המערבי).
  4. הוסף 1 מ"ל של 0.1 חיץ M KCl (חיץ מלח נמוכה) כדי לשטוף את החרוזים FLAG (ירידה של כדור הארץ).
  5. חזור על שלב 3.4 לפחות יותר ארבע פעמים (עבור סכום כולל של חמישה שוטף).

4. Elution

  1. מניחים את הטור לתוך צינור 1.5 מ"ל ו צנטריפוגות זה XG ב 2000 דקות 1; החרוזים יתייבשו.
  2. כיסוי או בתחתית הטור.
  3. הוסף 50 μl (שווה לנפח של חרוזים FLAG) של 0.1 מ 'גליצין-HCl (pH 2.5).
  4. נער בעדינות את התערובת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. מניחים את הטור לתוך צינור 1.5 מ"ל חדש צנטריפוגות זה XG ב 2000 דקות 1.
  6. פתרון eluted מנוטרל עם 10 μl של 1 M טריס- HCl (pH 8.0); ומערבבים היטב על ידי pipetting או באמצעות מכונה מערבולת.

5. אלקילציה ו trypsinization

  1. הוסף 50 μl של 100 מ"מ NH 4 HCO 3, 10 μl של CH 3 CN, ו -2 μl של dithiothreitol לתערובת (112 הנפח הכולל μl).
  2. דגירה המדגם במשך 30 דקות ב 56 מעלות צלזיוס.
  3. מניחים את המדגם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  4. הוסף 10 μl של 333 מ"מ iodoacetamide המדגם ו דגירה אותו בחושך במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. הוסף 10 μl של טריפסין (33 ng / μl) לתערובת ו דגירה אותו לילה בשעה 37 ° C.

ילדה = "jove_title"> 6. LC-MS / MS ניתוח

  1. בעקבות trypsinization לילה, להעביר את המוצר הסופי למתקן LC-MS / MS או למעבדה ספקטרומטריית מסה של צד שלישי עבור ניתוח 12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

זיהינו אות ARIP4 חזקה סביב 160 kDa, כמו גם אלה של פקד מדגם מדומה וכמה חלבונים ידועים אחרים (איור 1). LC-MS ניתוח / MS זיהו שני פפטידים מורכבים ARIP4 ואת קו-פקטורים פפטיד הפוטנציאל בתוך שבריר של חרוזים FLAG (טבלה 1). p62 (Sequestosome1), גורם-שותף ARIP4 ידוע

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

transfection יעיל הוא חיוני כדי להשיג תוצאה מוצלחת עם פרוטוקול זה. בהתאם לכך, אנו ממליצים להשתמש ניתוח כתם המערבי כדי לקבוע את רמות החלבון FLAG-מתויג immunoprecipitated. שלב זה מאפשר למשתמשים לוודא חלבון העניין שלהם מבוטא ביתר כראוי, ויתר מזאת, כי ה- IP בוצע בהצלחה. רמות החלבון מתויג FLAG ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was supported by the Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders (HT), the Takeda Science Foundation (HT), and by a Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Young Scientists (B) to HT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Fisher Scientific11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x)nacalai tesque03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichA2220
Micro Bio-Spin ColumnsBIO-RAD732-6204

References

  1. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).
  2. Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).
  3. MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).
  4. Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).
  5. Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).
  6. Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).
  7. Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).
  8. Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), 61430(2013).
  9. ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide. Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).
  10. Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).
  11. Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498(2015).
  12. Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).
  13. Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).
  14. Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).
  15. Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

119LC MS MSimmunoprecipitation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved