כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו<em&gt; ב Vivo</em&gt; מודלים התפתחותי לימוד Cell ל-תא קומפלקס אינטראקציות רשת איתות

Summary

במאמר זה וידאו מפרט פשוטה במתודולוגיה vivo, שניתן להשתמש בהם כדי בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות מורכבות ורשתות רגולטוריות בעוברים חסרי חוליות רבים.

Abstract

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

Introduction

ג'ין רשתות רגולטוריות (GRNs) ואת מסלולי העברת אותות להקים הביטוי במרחב ובזמן של גנים במהלך ההתפתחות העוברית המשמשים לבניית תוכנית גוף החיה הבוגרת. תא אל תא מסלולי העברת אותות הם מרכיבים חיוניים של רשתות רגולטוריות אלו, מתן הכלי שבאמצעותו תאים מתקשרים. אינטראקציות הסלולר אלה להקים ולשפר את הביטוי של גני רגולטוריים והבחינו ובקרב בשטחים השונים במהלך embryogenesis ^{1, 2.} אינטראקציות בין מאפננים תאיים מופרשים (הליגנדים, אנטגוניסטים), קולטנים, ו-קולטנים שיתוף לשלוט על פעילות מסלולי העברת אותות. מבחר של מולקולות תאיות transduces תשומות אלה וכתוצאה מכך ביטוי גנים שהשתנה, חלוקה, ו / או צורה של תא. בעוד רבים של מולקולות המפתח בשימוש ברמות התאיות ו תאי על המסלולים העיקריים הםידוע, הוא ידע שלם נובע במידה רבה למורכבות של מסלולי איתות בודדים. בנוסף, מסלולי איתות שונים לעתים קרובות אינטראקציה זה עם זה חיובי או שלילי על התאים, תאיים, ורמות תעתיק ^{3, 4, 5, 6.} חשוב לציין, מרכיבי הליבה של מסלולי העברת אותות הם שמורים ביותר בכל המינים מטזואניים, ו, להפליא, רוב מסלולי איתות הגדולים לעתים קרובות לבצע פונקציות התפתחותי דומות במינים רבים כאשר משווים אורגניזמים טווח מערכת קשור קשר הדוק בפרט ^{7, 8, 9, 10, 11.}

המחקר של איתות במהלך ההתפתחות הוא משימה מרתיעה בכל אורגניזם, וישכמה אתגרים משמעותיים ללימוד מסלולי איתות במודלים השניוניים הפה ביותר (בעלי חוליות, המיתרנים חסרי חוליות, hemichordates, ו echinoderms): 1) בקרב בעלי חוליות יש מספר גדול של ליגנד האפשרי ואינטראקציות קולטן / אפנן-שיתוף, מולקולות התמרה תאיות, כמו גם אינטראקציות פוטנציאליות בין נתיבים שונים מאותתים בשל המורכבות של הגנום ^{12, 13, 14;} 2) המורפולוגיה המורכבת ותנועות המוךפו"גנטי שהולכות חוליות לעתים קרובות לעשות את זה יותר קשה לפרש אינטראקציות תפקודיות ובקרב מסלולי העברת אותות; 3) ניתוח ברוב מיני מודל שאינו קווצי עור חסר חוליות שניוניות פה מוגבל על ידי חלון קצר gravidity למעט כמה מיני מיתרני זנב ^{15, 16.}

העובר ים קיפוד יש כמה מן המגבלות הנ"ל ומציע איכויות ייחודיות רבות לביצוע ניתוח מפורט של מסלולי העברת אותות in vivo. אלה כוללים את הבאים: 1) הפשטות היחסית של הגנום קיפוד הים מפחית באופן משמעותי את המספר ליגנד אפשרי, קולטן / שיתוף הקולטן מולקולת התמרה תאית קשרי גומלין ^17; 2) GRNs שליטה במפרט הדפוסים של השכבות הניבטות וגרזנים עובריים עיקריים מבוססות היטב בעוברי קיפוד ים, בסיוע להבנת ההקשר רגולטוריות של התא / טריטורית קבלת האותות ^{18, 19;} 3) מסלולי העברת אותות רבים ניתן ללמוד בין שלבי מחשוף gastrula מוקדם כאשר עוברים מורכבת של האפיתל שכבתית יחידה מורפולוגיה אשר קל יותר לנתח; 4) המולקולות לערבד ב מסלולי איתות של קיפודי הים הם מניפולציה בקלות; 5) קיפודי ים רבים המעוברים במשך 10 עד 11 חודשים בשנה (למשל Strongylocentrotus purpuratus ו Lytechinus variegatus).

כאן, אנו מציגים שיטה בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות המציינים וטריטוריות דפוס בעוברי קיפוד ים כדי להמחיש את היתרונות כי מספר מערכות מודל חסרות חוליות להציע בחקר מנגנונים מולקולריים מורכבים.

Protocol

1. עיצוב אסטרטגית Morpholino תפוקה גבוהה

1. לזהות גן (ים) של עניין (גישת הגן המועמד למשל, ניתוח הרגולציה ציס, RNA-seq ו / או מסכי ההפרש proteomic).
2. השתמש גנומית, transcriptomic, ונתוני ביטוי גנים באתרים מתעדכנים בתדירות גבוהה (למשל SpBase http://www.echinobase.org ²⁰ וס purpuratus הגנום http חיפוש: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) כדי לקבוע שפרופיל הביטוי spatiotemporal חופף עם מנגנון התפתחות מדובר. אם אין נתוני ביטוי זמינים, ולאחר מכן ליצור פריימרים qPCR ו / או antisense ב חללית באתרו להעריך את דפוס ביטוי גנים.
3. לאחר קביעת דפוס ביטוי במרחב ובזמן, להשיג את רצף הדנ"א מאתרי האינטרנט הגנומי.
   1. להפקה oligonucleotides morpholino חסימה-תרגום, להשיג רצף of 5 'באזור un-מתורגם (5' UTR) ישירות במעלה הזרם מן קודון ייזום מהתג רצף הביע (EST) מאגרי מידע נגיש SpBase או ס purpuratus הגנום אתרי חיפוש. אם מידע זה אינו זמין עבור הגן של עניין, ולאחר מכן לבצע 5 'RACE.
   2. כדי לעצב morpholino חסימת-אחוי, לחפש את הרצף הגנומי כולל אקסונים אינטרונים שימוש באפשרות פיגום blastn בכלי חיפוש SpBase או ס purpuratus הגנום.
4. השתמש באתר בעיצוב oligonucleotide http://oligodesign.gene-tools.com כדי לעצב את רצף morpholino זוג 25 בסיס הרצוי.
   1. במשך morpholino חסימת-translational, השתמש רצף mRNA מ 5 'ל 3' כמקור רצף היעד translational. כלול את רצף UTR '5 (כ -70 נוקלאוטידים upstream של אתר תחילת השעתוק) בתוספת 25 בסיסים של קידוד באזור (במורד הזרם של האתר התחל) עם תחילת קודון wi ניכרתבסוגריים ה (ATG).
   2. במשך morpholino חסימה-אחוי, בחר אינטרון-אקסון או רצף גבול-אינטרון אקסון וכולל 50 בסיסים (25 בסיסים של רצף אקסון ו -25 בסיסים של רצף אינטרון) סביב אזורי הגבול. סרוק את הגנום עם רצף morpholino כדי לוודא את הרצף ייחודי.

2. Microinjection של Oligonucleotides Morpholino

1. הכן 3 פתרונות מניות מ"מ של oligonucleotides morpholino על ידי הוספת 100 μL מים nuclease חינם לתוך בקבוקון morpholino 300 nmol.
   הערה: אל תשתמש במים DEPC שטופלו מחדש ההשעיה בגלל diethyl pyrocarbonate יכול להזיק morpholino.
2. עבור ספין הכינון מחדש הראשון במורד בקבוקון המכיל את פתרון oligonucleotide המניות למשך 30 שניות במלוא המהירות (14,000 - 16,000 XG), בקצרה מערבולת, חום 65 מעלות צלזיוס במשך 5 עד 10 דקות, מערבולת בקצרה, ולשמור את המניה morpholino ב חדר טמפרטורה לפחות h 1. פתרון המניות Morpholino s מאוחסן מ -20 ° C עד 4+ מעלות צלזיוס.
3. כן פתרון הזרקה המכיל oligonucleotides morpholino בריכוז הרצוי. פתרון זה מכיל בדרך כלל 20% גליצרול או 125 מ"מ KCl כנשא ו -15% FITC-dextran (והעמסת isothiocyanate dextran 10,000 MW 2.5 מ"ג / μL פתרון המניות). FITC-dextran ו conjugates dextran ניאון אחרים משמשים באופן שגרתי כדי לזהות עוברים מוזרק על ידי מיקרוסקופ epifluorescence. פתרונות הזרקת חנות ב -20 מעלות צלזיוס.
4. מחמם את פתרון morpholino ב 65 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום או אמבט מים במשך לפחות 2 - 5 דקות.
5. בקצרה ספין פתרון morpholino למשך 30 שניות במלוא המהירות (14,000 - 16,000 XG), מערבולת דקות 1 ו צנטריפוגות במלוא המהירות (14,000 - 16,000 XG) במשך 10 דקות לפחות.
6. טען את מחטי הזרקה עם פתרון morpholino. לקבלת פרוטוקול microinjection מפורט ראה Stepicheva ושיר 2014 ²¹ ו תרועות Ettensohn 2004"> 22.

קיבוע 3. בפרוטוקול באתרו ב 24 שעות לאחר ההפריה (hpf) ב ס purpuratus עוברים

הערה: פרוטוקול זה שונה מן ארנס-Mena et al. 2000 ²³ ו Sethi et al. 2014 ^24.

1. קיבוע
   1. להוסיף מספר טיפות של מקבע (ראה להלן) כדי בארות המכילות עובר, לערבב בעדינות על ידי pipetting, ולאפשר להם להתיישב. הסר את הפתרון מקבע, ולאחר מכן לערבב עובר עם שתי שטיפות נוספות 180 μL של מקבע.
      הערה: חשוב לערבב את העוברים ביסודיות במהלך הכביסות של עד pipetting עדין ומטה מספר פעמים. אי ביצוע הוראה זו יכולה להוריד את יחס האות לרעש.
   2. השאר את העוברים לתקן בכביסה מקבעת השנייה למשך 50 דקות עד 1 שעות בטמפרטורת חדר (RT) ב paraformaldehyde הכיתה במיקרוסקופ אלקטרוני 4% בהיקף של 10 מ"מ מגבים 7.0 pH, 0.1% Tween-20, ומלאכותי seawater (ASW). הפוך את הפתרון הזה טרי בכל פעם עבור התוצאות הטובות ביותר. בנוסף, עבור עוברי הקלות והמעשיות המתוקנות ב- 96-גם הצלחות.
      1. במשך 20 שימוש מקבע 5 מ"ל paraformaldehyde מ"ל 16%, 15 מ"ל ASW, 200 μL 1 M מגבים pH 7.0, ו -20 μL Tween-20.
   3. לשטוף 5 פעמים ב RT עם 180 μL של מגבים לשטוף חיץ המורכב pH 0.1 M מגבים 7.0, 0.5 M NaCl ו 0.1% Tween-20 במשך 5 דקות או עד העוברים לפחות טיפה לתחתית הבאר. שוב, חשוב לערבב את העוברים ביסודיות לתוך המאגר לשטוף ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה מספר פעמים. חיץ מגבים לשטוף יכול לשמש 2 ימים אם לאחסן 4 מעלות צלזיוס.
      1. במשך 40 מ"ל מגבים לשטוף חיץ שימוש 4 מ"ל 1 M מגבים pH 7.0, 4 מ"ל 5 M NaCl, 32 מ"ל DH ₂ O, ו -40 μL Tween-20.
      2. עוברים קבועים יכולים להיות מאוחסן על 4 ^מעלות צלסיוס למשך 2 ימים.
         הערה: אם אחסון עוברים קבוע יותר, ולאחר מכן להוסיף 0.2% אזיד הנתרן מגבים חיץ לשטוף כדי למנוע התפתחות חיידקים.
2. טרום הכלאה
   1. לשאוב מגבים חיץ לשטוף ולהוסיף 180 μL של 2: יחס 1 של מגבים חיץ לשטוף למאגר הכלאה, לערבב עוברים לתוך התמיסה על ידי מספר פעמים pipetting עדין, דגירה במשך 20 דקות לפחות ב RT. הכלאה חיץ מורכב 70% לפוראמיד, 0.1 M מגבים pH 7.0, 0.5 M NaCl, 1 מ"ג / מ"ל ​​BSA ו -0.1% Tween-20.
      1. במשך 40 מ"ל חיץ הכלאה שימוש 4 מ"ל 1 M מגבים pH 7.0, 4 מ"ל 5 M NaCl, 4 מ"ל DH ₂ O, 0.04 גרם BSA, ו -40 μL Tween-20. מערבבים היטב על ידי vortexing, להוסיף 28 לפוראמיד מ"ל, מערבולת שוב.
   2. הסר את 2: יחס 1 של המגבים לשטוף מאגרי הכלאה ולהוסיף 180 μL של יחס של 1: 2 של מגבי חיץ לשטוף למאגר הכלאה, לערבב עובר לתוך התמיסה, דגירה במשך 20 דקות לפחות ב RT.
   3. לפני הכלאת הבדיקה לערבב עוברת בעדינות לתוך 100 - 150 μL של חיץ הכלאה. דגירה עוברים על 50 מעלות צלזיוס לפחות 1ח.
      הערה: הקבוצה מתחילה עובר לילה מקובל. לפני דוגרים, לאטום את הבארות עם גיליון דבק כדי למנוע אידוי.
3. הַכלָאָה
   1. בתוך צינור נפרד להוסיף 0.1 - 0.3 ng / μL של חללית ו -500 מיקרוגרם / מיליליטר השמרים tRNA למאגר הכלאה, ואז מערבולת בעדינות כדי ליצור פתרון חללי. tRNA שמרים מתווסף פתרון הבדיקה כדי להקטין הלא ספציפי מחייב של החללית אנטי תחושה. מחממים את הפתרון הזה ל -50 מעלות צלזיוס, חיץ הכלאה לשאוב.
   2. מערבב בעוברים בשלב טרום הכלאה לתוך 100 μL של פתרון הבדיקה, חותם עם גיליון דבק, להכליא על 50 מעלות צלזיוס למשך 2 עד 7 ימים, תלוי הבדיקה (חללית foxq2 ניתן וטופחה במשך 2 ימים).
      הערה: פעמים דגירה תשתנה בהתאם את החללית. גנים מסוימים לידי ביטוי ברמות נמוכות דורשים עד דגירת 7 ימים. ניתן להציב 96-גם הצלחות בקופסת לחות כביטוח נגד אידוי אם adhesגיליון ive נכשל לאטום כמו שצריך.
   3. לשטוף 5 פעמים ב 50 מעלות צלזיוס עם 180 μL של מגבים טריים לשטוף חיץ עבור סכום כולל של 3 שעות. לאחר מכן, לשטוף 3 פעמים (15 דקות) עם 180 μL של מגבים לשטוף חיץ ב RT. זכור לערבב עוברים לתוך לשטוף חיץ בכל פעם על ידי pipetting מספר פעמים בעדינות.
4. דגירת נוגדן
   1. לשאוב מגבי חיץ לשטוף ומערבבים עוברים 180 μL של חיץ חסימת מורכב סרום כבשים 10% רגילים ו -5 מ"ג / המ"ל BSA ב מגבי חיץ לשטוף דגירה במשך 45 דקות לפחות ב RT או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   2. הסר חסימת חיץ ואז לערבב העוברים לתוך חסימת מאגר המכיל דילול 1: 1,500 של נוגדן אנטי digoxigenin phosphatase מצומדות אלקליין מדולל חסימת חיץ. דגירת הלילה ב RT צלחת אטומה כדי למנוע אידוי. הערה: אל תשאיר נוגדן על יותר הלילה.
   3. לשטוף עוברים 6 פעמים (5 דקות או עד העוברים טיפה) ב מגבים לשטוף חיץ ב RT. יכול עוברלאחסן לילה בשעה 4 ° C..
5. בפיתוח באתרו
   1. שטפו עוברי 3 פעמים (10 דקות) ב RT עם חיץ pH 9.5 טריים המורכב 0.1 M טריס pH 9.5, 100 מ"מ NaCl, 50 ₂ מ"מ MgCl, 1 מ"מ Levamisole, ו -0.1% Tween-20.
      1. במשך 20 מ"ל pH 9.5 חיץ שימוש 2 מ"ל 1 M טריס pH 9.5, 400 μL 5M NaCl, 1 מ"ל 1 M MgCl _2, 20 μL Tween-20, 16.6 מ"ל DH ₂ O, ו 0.0048 Levamisole גרם.
   2. דגירה עוברים על 37 מעלות צלזיוס במאגר מכתים מוגן מפני אור. חיץ מכתים מורכב מ 10% דימתיל Formamide, 4.5 μL / מ"ל ​​4-Nitro כלוריד כחול tetrazolium (NBT), ו -3.5 μL / מ"ל ​​5-Bromo-4-כלורו-3-indolyl-פוספט (BCIP) במאגר pH 9.5 טריות .
      1. עבור 1 מ"ל של חיץ מכתים להשתמש 100 μL דימתיל Formamide, 4.5 μL NBT, ו -3.5 μL BCIP.
   3. עצור את תגובת phosphatase אלקליין על ידי שטיפת 3 עד 5 פעמים ב מגבה לשטוף חיץ. ה- Wi התגובהה החללית foxq2 בדרך כלל לוקח 30 דקות עד 1 שעה. בדיקות מסוימות עשויות צריכות דגירת הלילה משני RT או 4 מעלות צלזיוס.
   4. מערבבים עוברים לתוך תמיסה של לשטוף 70% מגבים ו -30% גליצרול. גליצרול מספק מקדם השבירה צורך במיקרוסקופ. עוברים ניתן לאחסן את הפתרון הזה במשך כמה שבועות. חותם את הצלחות עם פרפין פלסטיק כדי למנוע אידוי.
6. הכנת שקופיות ולכידת תמונה
   1. כן שקופית ידי סידור שלוש רצועות קטנות של דבק דו צדדי למשולש עם פערים קטנים בין רצועות לשקופית.
   2. מעבירים את העוברים בכביסה 70% מגבים פתרון גליצרול 30% למרכז המשולש ומכסים coverslip.
   3. חותם את coverslip ידי החלת שכבת לק מסביב לקצוות של coverslip.
   4. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ אור מתחם עם מטרת 20X ומצלמה מצורפת.

תוצאות

בעובר הים קיפוד הראינו כי 3 איתות סניפים Wnt שונים (Wnt / β-קטנין, Wnt / JNK, ו Wnt / PKC) ^{4, 25} פועלים יחד כדי ליצור רשת איתות Wnt השולט הקדמי-אחורי דפוסים (AP). אחת התוצאות החשובות ביותר של אירועי איתות אלה היא כי קדמי neuroectoderm רחב הביע הר?...

Discussion

המתודולוגיה המוצגת כאן היא דוגמא שממחישה את הכח של שימוש בעוברים עם מורכבות גנומית וצורניות פחות חוליות להבין את מסלולי העברת איתות GRNs המסדירים מנגנוני התפתחותיים יסוד .. מעבדות רבות משתמשות מבחנים דומים במהלך התפתחות קיפוד הים מוקדם לנתח את מסלולי איתות מעורבים בא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino	Gene Tools LLC	Customized	More information at www.gene-tools.com
Glycerol	Invitrogen	15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)	Invitrogen, Life Technologies	D1821	Make 25 mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
MOPS	Sigma Aldrich	M1254-250G
Tween-20	Sigma Aldrich	23336-0010
Formamide	Sigma Aldrich	47671-1L-F
Yeast tRNA	Invitrogen	15401-029
Normal Goat Serum	Sigma Aldrich	G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody	Roche	11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole)	Sigma Aldrich	L9756-5G
Tris Base UltraPure	Research Products Internationall Corp	56-40-6
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate	Roche	11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)	Roche	11 383 213 001
Dimethyl Formamide	Sigma Aldrich	D4551-500mL
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541-5KG
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761-500G
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	M7506-2KG
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C1016-500G