הכנה והערכה של<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc שכותרתו Tridentate chelates לחינוך קדם-מיקוד שימוש Bioorthogonal לכימיה

Summary

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate ^99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Abstract

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing ^99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with ^99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the ^99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Introduction

^99m Tc נשאר רדיואיזוטופיים הדומיננטי בשימוש ברפואה גרעינית אבחון, עם למעלה מ -50 מיליון הליכי הדמיה שנערכו בשנת ברחבי עולם ^{1, 2, 3.} רוב סוכני ^99m Tc בשימוש קליני הם רדיואקטיביות סוג זלוף. ישנם מספר מצומצם של תרכובות ממוקדות פעיל אשר ^99m Tc מופנה לאגד סמן ביולוגי ספציפי באמצעות קשירה לבנות מיקוד. יצירת רדיואקטיביות ^99m Tc הממוקד מתעכבת לעתים קרובות על ידי השפעתו של ^99m Tc-ליגנד מתחמים על היכולת של מולקולת המיקוד להיקשר הסמן הביולוגי של עניין, או איזוטופים מחצית החיים אינם ארוך מספיק לשימוש עם ביומולקולות משקל מולקולרי גבוה כמו נוגדנים. זה האחרון בדרך כלל דורש כמה ימים לפני תמונות נרכשות על מנת biomolecule כדי לנקות מן היעד הלא Tiss UES. מיקוד טרום מציע גישה חלופית כדי להתגבר על האתגרים אלה.

טרום מיקוד בשילוב עם כימית bioorthogonal הוכח להיות דרך יעילה לפתח בדיקות הדמיה מולקולריות חדשות לשני קרינת רדיו-הדמיה ^{4, 5, 6, 7, 8.} הביקוש אלקטרונים הפוך- אלמון דילס (IEDDA) התגובה בין 1,2,4,5-tetrazine (טז) ו -cyclooctene טרנס (TCO) נגזרים, כפי שמוצג באיור 1, הוכח להיות יעיל במיוחד ^6. התגובה IEDDA עם רכיבים אלה יכולים להפגין קינטיקה מהירה ב PBS (k ₂ ≈ 6,000 M ^-1 s ^-1) סלקטיביות גבוהה, מה שהופך אותו אידיאלי עבור in vivo מראש מיקוד יישומים ^{9, 10.}

e_content "> הגישה הנפוצה ביותר בשימוש כרוך בניהול וקטור מיקוד TCO הנגזר לאחר תקופת עיכוב מספיק, tetrazine radiolabeled מנוהל. tetrazines radiolabeled מבוסס על ¹¹ C, ¹⁸ F, ⁶⁴ Cu, ⁸⁹ ZR, ו ^-111 ב כבר ^{11 דיווחו, 12, 13, 14, 15.} לעומת זאת, יש רק אחד הדיווחים של ^99m Tc שכותרתו טז, אשר הוכן באמצעות ליגנד סוג HYNIC המחייב שימוש-הליגנדים שיתוף למנוע התקשרות חלבונים והשפלה in vivo ^16. כחלופה, אנו מדווחים כאן את הסינתזה של ^99m Tc (I) שכותרתו tetrazines באמצעות משפחה של הליגנדים המהווים מתחמי tridentate יציבה עם ^[99m Tc (CO) _3] ⁺ הליבה.

גיל = "1">
איור 1: תגובת IEDDA bioorthogonal בין tetrazine ו -cyclooctene טרנס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בני משפחתו של הליגנדים מוכן לכלול chelates tridentate שמשתנות הקוטביות ואת לאופי הקבוצה מקשר בין אזור מתכת מחייב ואת טז (איור 2). המטרה היתה לזהות ^99m Tc-Tetrazine לבנות שיכול למקם ביעילות ומגיבים עם אתרים שכותרתו TCO in vivo וברור במהירות כאשר לא מחויב, על מנת להניב גבוהה היעד ל-יעד שאינו יחסי. כדי לבדוק את הליגנדים, TCO-נגזרת של ביספוספונטים (TCO-BP) שימש ^17. הראינו בעבר כי TCO-BP localizes לאזורים של מטבוליזם העצם פעיל ויכול להגיב עםtetrazines radiolabeled in vivo ^18. זהו מגיב נוח לבדוק tetrazines חדש, כי זה יכול להיות מוכן בשלב אחד וניסויים יכול להתבצע בעכברים נורמליים שבו לוקליזציה מתרחשת בעיקר במפרקים (ברכיים וכתפיים).

Protocol

מחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי מועצת האתיקה בעלי חיים למחקר באוניברסיטת מקמאסטר בהתאם המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים (CCAC) הנחיות.

1. Radiolabeling של הליגנדים TZ-tridentate עם ^99m Tc

זהירות: ההליכים הבאים מחייבים את השימוש של תרכובות רדיואקטיבי. העבודה צריכה להיעשות רק במעבדה מורשה עם דבקות תקנות הבטיחות וסילוק. תגובות מיקרוגל צריכות להתבצע במיקרוגל שתוכנן במיוחד עבור סינתזה כימית.

1. סינתזה של ^[99m Tc (CO) ₃ (H ₂ O) _3] ^{+ 19, 20}
   1. בבקבוקון מיקרוגל, לשלב 8 מ"ג K ₂ [BH ₃ CO _2], 15 מ"ג Na ₂ CO _3, 20 מ"ג Na ₂ B ₄ O ₇ · 10H ₂ O, ו -25 מ"ג קוקו [CH (OH)]₂ COONa · 4H ₂ O. טהר הבקבוקון במשך 10 דקות עם גז ארגון.
   2. הוסף 4 מ"ל של ^99m TCO ₄ ^- (~ 1,100 MBq, ~ 30 MCI) סליין 0.9% ל הבקבוקון.
   3. מחמם את התגובה במיקרוגל במשך 3.5 דקות ב 110 מעלות צלזיוס לאחר 10 שניות של ערבוב כדי להבטיח ערבוב יסודי של חומרים כימיים.
   4. התאם את ה- pH של הפתרון 3.5-4 באמצעות ~ 400 μL של 1 M HCl. אמת באמצעות נייר pH.
2. Radiolabeling של Tetrazine הליגנדים 1-5
   1. ממיסים 2 מ"ג של כל ליגנד (תרכובות 1-5) ב 250 μL MeOH ^21.
   2. הוסף 250 μL של ^[99m Tc (CO) ₃ (H ₂ O) _3] ⁺ (~ 74 MBq, ~ 2 MCI) כל פתרון.
   3. מחממים את תערובת התגובה באמצעות במיקרוגל למשך 20 דקות ב 60 מעלות צלזיוס.
      הערה: שלב זה היה זהה עבור כל 5 tetrazines.
   4. עבור תרכובות 2- 5, להתאדות הממס מחדש dissolve המוצרים וכתוצאה מכך 1 מ"ל של 1: 1 v / v DCM: TFA.
   5. מחממים את תוצרי התגובה מומס (2-5) ב 60 ° C במיקרוגל במשך 6 דקות (2-4) או 10 דקות (5).
   6. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, להתאדות ממס באמצעות המאייד (36 מעלות צלזיוס, 8 mbar, 3 דקות, 6,000 סל"ד) ו לפזר את המתחם מיובש 1: 1 ACN: H ₂ O או 1: 1 MeOH: H ₂ O, לפני טיהור HPLC.
   7. לטהר את תרכובות Tc שכותרתו ^99m (1-5), כולל הפרדת מוצר שכותרתו מ ליגנד tetrazine ללא תווית, באמצעות HPLC (C ₁₈ התהפכה פאזי). בדרך כלל, להשתמש שיפוע elution של 30:70 ACN: H ₂ O (שניהם עם 0.1% TFA) כדי 40:60 ACN: H ₂ O מעל 20 דקות (18 דקות) ו טור 100 מ"מ 4.6 x ₁₈ C אנליטית. השתמש בשני UV (254 ננומטר) וזיהוי גמא.
      1. לקחת דגימה קטנה של כל מוצר שהכותרת ולהשוות זמן שמירת HPLC שלה לזה של inj-שיתוףected, שאינם רדיואקטיביים, Re-שכותרתו סטנדרטי (0.125 מ"ג ב 20% מתנול-H ₂ O). התקן שכותרתו Re מזוהה עקבות UV HPLC, ויהיה elute באותו זמן כמו במתחם Tc שכותרתו ^99m ב עקבות γ-HPLC. שיתוף הזרקה זה מראה פסגות בזמני שימור דומים, המאשרת את זהותו של ^99m Tc שכותרתו מתחם.
   8. להתאדות הממס מתוך שברי HPLC באמצעות מאייד (36 מעלות צלזיוס, 8 mbar, 3 דקות, 6,000 סל"ד).
   9. נסח במתחם המטוהר בריכוז של 7.4 kBq / μL ב PBS, המכיל BSA 0.5% ו 0.01% Tween-80.
   10. כדי להבטיח את התרכובות שכותרתו יציבות, לבצע מחקר יציבות חוץ גופייה. דגירה למתחם ניסח ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1, 4 ו -6 שעות, הזרקת כמות קטנה (3.7 MBq) של התערובת על HPLC בכל נקודת זמן כדי להעריך את היציבות.

2. מחקרים ביו-הפצה טרום ממוקד

1. הכנת חיות
   1. שימוש 7-9 בן שבוע, עכברים Balb / c נקבה (n = 3), לנהל TCO-BP מנוסחת מלוחים (20 מ"ג / ק"ג) (5 מיקרוגרם / μL), באמצעות הזרקת הזנב ורידים.
   2. העבר את העכבר בהתקן ריסון פיזי, ולזהות את הוורידים ממוקמים על המשטחים לרוחב של הזנב ולנגב עם מטלית אלכוהול. בערך בשעה 2 ס"מ מהקצה של הזנב, להכניס מחט 30-מד בזווית שטוחה, במקביל הווריד. לאט לוחץ על המתג כדי להזריק, להסיר מחט ולהחיל ספוג גזה נקי במקום ההזרקה עם לחץ קל עד עוצר דימום.
   3. בשעה 1 הזרקת שעות שלאחר של TCO-BP, לנהל ~ 0.74 MBq (20 μCi) של ^99m Tc-tetrazine מנוסחת 100 μL של 0.5% BSA, 0.01% Tween-80 ב PBS, באמצעות הזרקה-וריד הזנב.
2. מחקרים ביו-הפצה
   1. בנקודת הזמן הרצויה (t = 6 שעות), לטשטש את העכברים באמצעות 3% isoflurane תערובת גז חמצן 2%. להפגין כדידואר נסיגת קמצוץ על העכבר הרדים כדי לוודא שהם תחת מטוס של הרדמה כירורגית.
   2. איסוף דם (1 מ"ל) באמצעות לנקב לב באמצעות מזרק טרום שטופלו הפרין. מקום עכבר על גבית עם אף בחרוט אף הרדמה המשיכה ולאתר את תהליך xiphoid על החיה.
      1. הכנס מחט 25 G, מעט שמאלה של קו האמצע של החיה תחת תהליך xiphoid, בזווית 20 מעלות. הכנס את המחט, ולאט לאט למשוך בחזרה על הבוכנה לראות דם רכזת המחט אם הלב היה מנוקב. מעט מחדש את המחט תוך כדי לחיצה על הבוכנה במידת הצורך, כדי לנקב את הלב. לאט להקיז דם לתוך המזרק.
   3. להרדימו על ידי נקע בצוואר הרחם, בעוד בהרדמה.
   4. מניח כל חיה בתוך שקית פלסטיק ולהשתמש כיל מנה (הגדרת Tc ^99m) כדי למדוד את רמת פעילות הגוף כולו.
   5. אסוף את רקמות ונוזלים הבאים טרום לשקולed לספור צינורות: דם, עצמות (ברך וכתף), כיס מרה, כליות, כבד, קיבה (עם תוכן), מעי דק (עם תוכן), מעי גס ואת מעי אטום (עם תוכן), בלוטת תריס ואת קנה נשימה, שלפוחית ​​שתן עם שתן , וזנב.
   6. לשטוף רקמות מתאימות (למעט דם, כיס מרה, ואת שלפוחית ​​שתן) ב PBS להסיר דם כתם יבש לפני הנחת רקמות צינורות ספירה מתאימות.
   7. מניחים פגר חיה בתוך שקית ניילון ולמדוד פעילות הגוף כולו שיורית באמצעות כיל מנה.
   8. לשקול כל שפופרת המכילה דגימת רקמה. המשקל ההתחלתי הפחת של הצינור כדי לקבל מסה של רקמה.
   9. השתמש כיל מנה (הגדרת Tc ^99m) כדי למדוד את כמות פעילות מדגם בדיקה (100 μL) בעת ההזרקה עבור כל עכבר.
      הערה: זה מדגם בדיקה שווה את עוצמת הזריקה, ובכך נותן את ספירת הפעילות בזמן ההזרקה.
   10. בעת מדידת רקמות,liquot 5 μL של מדגם הבדיקה השתמש בעבר. השתמש דלפק גמא רב-גלאי (הגדרת Tc ^99m) ולספור להשיג הספירה לדקה (CPM) עבור מדגם בדיקת 5 μL.
   11. השתמש בשני הערכים שהתקבלו ב 2.2.9 ו 2.2.10 לחשב את הפעילות ואת קשר CPM בעזרת משוואת 1 להשיג מקדם מרה (CPM μCi ^-1).
       (1)
   12. השתמש הדלפק גמא למדוד את כמות רדיואקטיביות בכל רקמה או מדגם נוזל.
   13. השתמש במשוואה 1 כדי לחשב את הסכום של הפעילות בכל רקמה או נוזל בזמן יחסית המדידה מהחומר המוזרק הכולל. ערך זה מנורמל אז לפי משקל איבר כפי שדווח מהחומר המוזרק אחוזים לגרם (כלומר,% מזהה / g) של רקמות.
   14. בצע את השלבים 2.1.2 כדי 2.2.13 לנהל ניסוי ביקורת שלילית באמצעות הליגנדים tetrazine Tc שכותרתו ^99m ב absence של TCO-BP. עכברי קורבן (n = 3) ברמה של 0.5, 1, 4 ו -6 הזרקת שעות שלאחר ולקבל רקמה או נוזל כמתואר לעיל.

תוצאות

הליגנדים היו מסונתזים באמצעות linkers ו chelators השונים באמצעות אסטרטגית amination רדוקטיבי פשוטה (איור 2), ואחריו צימוד של המוצר אל tetrazine הזמין מסחרי ^{22, 23.} Radiolabeling בוצע תוך שימוש באותה השיטה לכל התרכובות והיה מאוד לשחזור...

Discussion

אוסף של chelates tridentate צמוד tetrazine של קטבים שונים הוכן, ואת השירות של המתחמים שלהם ^99m Tc תגובת IEDDA עם נגזרת TCO in vivo הוערך. שיטת תיוג יעילה לשחזור ^99m Tc פותחה במשך חמש tetrazine-chelates, שבו הריכוז ליגנד היה 10 ^-3 M. שלב התיוג לווה deprotection של T- קבוצות בוטיל (עבור תרכ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Argon gas	Alphagaz	---	---
Na2CO3	EMD Millipore	106395	---
Na2B4O7·10H2O	Anachemia	S9640	---
KNaC4H4O6·4H2O	Anachemia	217255	---
Technelite 99mTc generator	Lantheus medical imaging	---	Source of 99mTcO4-
0.9% Saline	Lantheus medical imaging	---	To elute generator
1 M HCl	Lab Chem	---	---
MeOH	Caledon	---	---
ACN	Caledon	---	HPLC grade
Millipore H2O	Thermo Fisher Scientific	Barnstead Nanopure	---
DCM	Caledon	---	---
TFA	Caledon	---	---
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH 7.4 1x
BSA	Sigma Aldrich	A7906	---
Tween80	Sigma Aldrich	P8047	---
Isoflurane	CDMV	108737	Supplier: Fresenius Kabi Animal Health
HPLC	Waters	1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590)	---
HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4	Phenomenex	00G-4435-E0	Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm
HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5	Waters	186003115	XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm x 100 mm
Microwave Reactor	Biotage	Initiator 8	---
Biotage V10 Evaporator	Biotage	Serial # V1041	---
Dose calibrator	Capintec, Inc.	CRC-25R	---
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard 1470 Automatic Gamma Counter	---
Animal room scale	Mettler Toledo	XP105 Delta Range	---
Microwave vials	Biotage	355629	0.5-2 mL