Murine אבי העורקים למחוץ פגיעה: יעיל<em&gt; בויבו</em&gt; מודל של תאים שרירים חלקה תפוצת ו אנדותל פונקציה

Summary

Restenosis לאחר הליכים Cardiovascular (ניתוח מעקף, אנגיופלסטיקה, או stenting) היא בעיה משמעותית להפחית את עמידות של נהלים אלה. טיפול אידיאלי יהיה לעכב תפוצת שריר חלקה (VSMC) תוך קידום התחדשות האנדותל. אנו מתארים מודל להערכה סימולטנית של התפשטות VSMC ותפקוד האנדותל in vivo.

Abstract

שחזור עורקי, בין אם ניתוח אנגיופלסטי או ניתוח מעקף, כולל טראומה יאטרוגנית הגורמת לשיבוש אנדותל ותפוצת תאי שריר חלקה (VSMC). מודלים מורין משותף ללמוד כלי קטן כגון עורקי הראש ואת עורקי הירך. להלן אנו מתארים מערכת vivo שבו שתי התפשטות VSMC ו פונקציה מחסום האנדותל ניתן להעריך בו זמנית בכלי גדול. למדנו את התגובה העורקים infrarenal לפציעה C57BL / 6 עכברים. אבי העורקים נפגעו מהוריד הכליתי השמאלי עד לשתי ההתהוות של אבי העורקים על ידי 30 ריסקות טרנסמומיות של משך 5 שניות עם מוליך כותנה. שינויים מורפולוגיים הוערכו עם היסטולוגיה קונבנציונלית. עובי דופן העורקים נמדד מן המשטח לומינליטיה. שילוב EDU וכתמים נגד עם DAPI ואלפא אקטין שימש להדגים התפשטות VSMC. הפעלת ERK1 / 2, מנחה ידוע של היווצרות היפרפלזיה אינטימית, הרתיעהממוקש על ידי ניתוח כתם המערבי. ההשפעה של דלקת נקבע על ידי אימונוהיסטוכימיה עבור תאים B, T- תאים, ומקרופאגים . En פנים קטעים של האנדותל היו דמיינו עם מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). פונקציה אנדותל המכשול נקבע עם מכתים Evans כחול. פגיעה בחצי הדם גרמה לעיבוי קיר העורקים. פגיעה זו גרמה להתפשטות VSMC, הבולט ביותר ב 3 ימים לאחר הפציעה, ואת ההפעלה המוקדמת של ERK1 / 2 ו ירד p27 ^ביטוי kip1. פגיעה לא הביאה לגידול בתאי B, תאי T, או חדירת מקרופאגים בקיר הספינה. פציעה גרמה למחלות תא אנדותליות חלקיות ולאובדן מגע של תאים תאיים. פגיעה גרמה לאובדן משמעותי של תפקוד מחסום האנדותל, אשר חזר לקו הבסיס לאחר שבעה ימים. Murine transmural בוטה אב העורקים מודל הפציעה מספקת מערכת יעילה כדי ללמוד בו זמנית הן התפשטות VSMC ו מחסום אנדותל פונקציה בכלי גדול.

Introduction

רסטנוזה ניתוח מעקפים (ניתוח מעקפים, אנגיופלסטיקה או סטנט) הוא בעיה משמעותית בהפחתת עמידותם של תהליכים אלה. כל ההליכים רה-וסקולריזציה הם מנוגע על ידי restenosis. האסטרטגיות הנוכחיות למניעת רסטנוזיס (סטנטים משחררים תרופה ובלונים מצופים בסמים) מעכבים את תאי השריר החלקים של כלי הדם (VSMC) ואת התפשטות תאי האנדותל (EC). כתוצאה מכך, התערבויות אלה למנוע restenosis מתווך VSMC, אלא גם למנוע את התחדשות האנדותל. ללא אנדותל שלם, החולים נדרשים להיות על סוכנים נוגדי טסיות חזק כדי להקטין את הסיכון של פקקת באתרו בסיכון של דימום סיבוכים. טיפול אידיאלי יהיה לעכב התפשטות VSMC תוך קידום התחדשות האנדותל. לכן, יש צורך בו זמנית מחקר התפשטות VSMC ו מחסום אנדותל פונקציה אני vivo .

נכון להיום, יש לנתקמודלים העכבר של restenosis ¹ . מודלים אלה כוללים קשירת עורקים ופציעה עורק הירך חוט ² . מודלים אבי העורקים כוללים מיקום סטנט ³ , פגיעה בלון ⁴ , ו alortraft אבי העורקים ⁵ . כל המודלים הנוכחיים מוגבלים. Carutid קשירת מייצר זורם בתיווך neointimal הנגע ואין פגיעה אנדותל. בנוסף, הן עורקי הראש ואת הירך יש הרבה פחות שכבות תאים פחות מאשר כלי אדם, הגבלת הערך translational שלהם. אבי העורקים של העכבר הוא כ 1.3 מ"מ קוטר, הוא כלי שיט רק הקרובה לעורק אנושי קליני (רלוונטי) קלינית (3).

למרות פוטנציאל translational של מודלים אבי העורקים של Murine, מודלים הנוכחי יש מגבלות. מודלים אלה דורשים מיומנויות מתקדמות microsurgical וציוד מיוחדים כגון בלונים אנגיופלסטי ו stents. כאן אנו מציגיםרומן, טכניקה לשחזור בו זמנית לעורר התפשטות VSMC ולשבש את תפקוד מחסום האנדותל.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הצהרת האתיקה: הפרוטוקולים לטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת מרילנד (פרוטוקול מס '0416009) ונערכו על פי תקני AAALAC-International.

1. הליך כירורגי

1. טכניקת הרדמה
   1. לעקר את כל המכשירים המשמשים ניתוח הישרדות עם קיטור עיקור ב 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   2. להשרות הרדמה באמצעות מיכל אינדוקציה עם 100% O ₂ ו 2.5% isoflurane נמסר באמצעות מאדה דיוק. לאחר אינדוקציה, להפסיק את isoflurane ולשטוף את החדר עם O ₂ . לשמור על הרדמה עם isoflurane 1.5-2% באמצעות מסכת פנים 1 L / min O ₂ על ידי שאיפה.
   3. צרף הן את החדר אינדוקציה ומסכה בפני נזלת פחם עבור ספיגת גז פסולת כדי להגן על כוח אדם. ודא מטוס הרדמה נאותה על ידי הדגמהכי אין תגובה לגירויים מזיקים (קמצוץ הבוהן).
   4. יצירת שדה אופרטיבי המורכב מגש כירורגי עם כרית איזותרמית לספק תמיכה תרמית במהלך הניתוח. כרית איזותרמית נוספת תספק תמיכה תרמית לבעלי חיים כלוב ההתאוששות שלהם.
2. הכנת בעלי חיים
   1. בצע את החקירה הבאה על 10-12 שבועות זכר C57BL זכר / 6 עכברים.
   2. הסר את השיער על פני הבטן הגחון של החיה מן עצם החזה לאזור המפשעה עם סוכן דפילציה או קליפר חשמל עם להב מספר 40.
      1. במקרה של סוכן דפילציה, להחיל מתחם זה לאזור כירורגי במשך 2-3 דקות ולאחר מכן להסיר אותו עם כותנה. אנו משתמשים במתחם זמין מסחרית של סידן הידרוקסיד ו hydroxide נתרן.
   3. הכן את האזור על הכתף עם אלכוהול 70% ו subcutaneous להזריק carprofen (5 מ"ג / ק"ג) עם 25 מד או מחט קטן יותר נשא. זֶההטיפול יספק כאבים לאחר הניתוח עבור החיה.
   4. מעבירים את החיה לשדה הניתוח וממקמים שכיבה הגב.
   5. הכן את האתר כירורגית על ידי מקרצף 8-12% providone- יוד עם applicator כותנה נקי או גזה כותנה. לאחר מכן לשטוף את העור פעמיים עם אלכוהול 70%.
   6. מניחים חומר סיכה עיניים בשתי העיניים כדי להפחית את השכיחות של יובש הקרנית. לכסות את האתר כירורגי עם וילון סטרילי.
3. טכניקה אופרטיבית
   1. הפוך חציון בטן laparotomy בטן כ 2-2.5 ס"מ אורך עם אזמל מתחיל מיד הזנב את תהליך xiphoid ומתרחב לכיוון האגן.
   2. מוסיפים את המעי הדק ואת התריסריון ומשקפים לרוחב ימינה. מגלגלים רצועה של כותנה סטרילית גזה ספוג עם תמיסת מלח סטרילית להזרקת כדי לאפשר אריזה של viscera כדי לשפר את החשיפה.
   3. עם המעי הדק מגויס בצד ימין שלהבטן, לחשוף את retroperitoneum לחשוף את אבי העורקים הבטן מן הווריד הכליתי השמאלי כדי bifurcation אבי העורקים ( איור 1 ).
   4. עם המוליך סטרילי צמר גפן, לספק 30 רצופים רצופים, כל חמש שניות משך.
   5. הסר את האריזה ולאפשר viscera לחזור למקום הילידים שלהם.
   6. סגור fascia עם ריצה תפר חד פעמיות 4-0 absorbable (polydioxanone). העור הוא סגור עם ריצה 6-0 non-absorbable תפר monofilament (ניילון).
4. שחזור וטיפול לאחר הטיפול
   1. לאחר ההליך, במקום החיה בכלוב התאוששות עם מצעים נקיים על כרית isothermal להמשיך תמיכה תרמית עד בעל החיים הוא מסוגל אמבולט בדרך כלל. אל תעזוב את החיה ללא השגחה עד שהדבר יוכיח את היכולת לשמור על שכיבה.
   2. לפקח על החיה בכל שעה במשך 4 שעות לאחר הניתוח הראשון. לאחר החיה אמבולטינג בדרך כלל לחזור אני לא לחדר ההקצאה שהוקצה. החיה לא תשכן בחברה של חיה אחרת עד שתחלים לגמרי.
   3. לפקח על החיה פעמיים ביום עבור הראשון 72 שעות לאחר הניתוח לפחות 3 פעמים בשבוע לאחר מכן. הניטור כולל שקילת החיה שלוש פעמים בשבוע.
   4. ניהול carpofen (5 מ"ג / ק"ג) תת עורית פעמיים ביום עבור הראשון 72 שעות לאחר הניתוח.

2. רכש של רקמות

1. שיטת המתת חסד
   1. להרדים את החיות בנקודות זמן קבועות מראש.
   2. להשרות הרדמה באמצעות מיכל אינדוקציה עם 100% O ₂ ו 2.5% isoflurane נמסר באמצעות מאדה דיוק.
      1. כדי ללמוד את השלמות של האנדותל, Admin Evans כחול לצבוע את החיה.
         הערה: אוואנס כחול הוא צבע Azo טעונה שלילית עם זיקה מחייב גבוהה עבור אלבומין והוא יכול רק כלי דם כתם בהיעדר אנדותל שלםS = "xref"> 6.
      2. עבור מחקרים שלמות האנדותל, בזמן המתת חסד, perfuse החיות עם 5 מ"ל של 0.3% אוונס צבע כחול ואחריו 5 מ"ל PBS בלחץ פיזיולוגי במשך 5 דקות. החיה נשמרת במישור כירורגי של הרדמה במהלך הליך זלוף.
   3. לאחר השגת מטוס הרדמה עמוק, לפתוח את החזה עם סטרנוטומי. לעשות חתך באטריום הנכון כדי לאפשר ניקוז של דם מן החיה וגישה החדר השמאלי הוא ניגש עם מחט 21 G להזריק פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) עד השפכים מן אטריום ימין ברור.
   4. לאחר זלוף עם PBS, הזן את הבטן דרך חתך קו האמצע.
   5. שוב, לגייס את המעי הדק בצד הימני של הבטן לחשוף את אבי העורקים infrenal, בחדות לנתח את אבי העורקים הסמוכים לרקמות ובלו אותו מן הווריד הכליתי השמאלי כדי bifurcation אבי העורקים.
   6. חנות אבי העורקים הוסר ב paraformald 4%פתרון ehyde עד עיבוד רקמות מתרחשת.
      1. עבור מחקרים שלמות האנדותל, לפתוח את אבי העורקים longitudinally ולהצמיד אותו גיליון שעווה לחשוף את כולו של משטח luminal ⁶ . ביצוע הערכה איכותית של שלמות האנדותל על ידי מידת מכתים עם צבע כחול אוואנס ⁶ .
      2. עבור מבחני היסטולוגיה אחרים, סעיף אבי העורקים באופן רוחבי להטביע אותו אופטימלית טמפרטורת חיתוך (OCT) תרכובות כפי שהוכתב על ידי השיטה היסטולוגית לשמש ⁷ .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

סעיפים אביזר רוחבי מוטבע OCT היו מחולקים, ומוכתמים hematoxylin ו eosin לאחר מכן מוכתמות עם כתם Verhoeff- ואן Gieson (VVG) לזהות את lamina אלסטית פנימיים וחיצוניים ⁷ . פציעה מוחצת גרמה לעיבוי קיר אבי העורקים בהשוואה לאורטאס של בעלי חיים שטופלו בהליך דמה (laparotomy ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

יש לנו מאופיין את ההשפעות של מודל פגיעה אבץ Murine שמביא hyperplasia המדיאלי תפקוד לקוי של האנדותל. ניתוק EC חלקי לאורך האינטימה של אבי העורקים מלווה באובדן מגע של תאים סלולריים ושיפור של בליטות התא. במקביל, תפקוד מחסום האנדותל היה לקוי באופן משמעותי, אשר גירוי נתיבי איתות המי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ocular lubricant	Dechra	17033-211-38	Pharmaceutical agents
Isoflurane	VetOne	502017	Pharmaceutical agents
Carprofen	Zoetis	26357	Pharmaceutical agents
Precision vaporizer	Summit Medical	10675	Surgical supplies
Charcoal scavenger	Bickford Inc.	80120	Surgical supplies
Isothermal pad	Harvard Apparatus	50-7053-R	Surgical supplies
Sterile cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-124	Surgical supplies
4-0 absorbable monofilament suture	Ethicon, Inc	J310	Surgical supplies
5-0 non-absorbable monofilament suture	Ethicon,Inc	1666	Surgical supplies
21-gauge x 1 inch needle	BD Biosciences	305165	Surgical supplies
25-gauge x 1 inch  needle	BD Biosciences	305125	Surgical supplies
Dry sterilizer	Cellpoint	7770	Surgical supplies
Fine scissors	Fine Science Tools	14058-09	Surgical instruments
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12	Surgical instruments
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20	Surgical instruments
Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge	Fine Science Tools	15000-00	Surgical instruments
Needle driver	Fine Science Tools	91201-13	Surgical instruments
Scalpel handle #4	Fine Science Tools	10004-13	Surgical instruments
Scalpel blades #10	Fine Science Tools	10010-00	Surgical instruments
PBS	Lonza	17-516F	Reagents for tissue processing
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129	Reagents for tissue processing
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagents for tissue processing
Modeling wax	Bego	40001	Reagents for tissue processing
OCT compound	Tissue-Tek Sakura	4583	Reagents for tissue processing
Mayer's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	MHS16	Reagents for immunohistological analysis
Eosin Y solution alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110316	Reagents for immunohistological analysis
Elastin stain kit	Sigma-Aldrich	HT25A	Reagents for immunohistological analysis
Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit	Invitrogen	C10337	Reagents for immunohistological analysis
Anti-Erk1/2 antibody	Cell Signaling Technology	4695	Reagents for immunohistological analysis
Anti-phospho-Erk1/2 antibody	Cell Signaling Technology	4370	Reagents for immunohistological analysis
Anti-p27kip1 antibody	Cell Signaling Technology	3698	Reagents for immunohistological analysis
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	Reagents for immunohistological analysis