מניפולציה פונקציונלית של מוצרים אימהיים הגן באמצעות<em&gt; במבחנה</em&gt; הבשלת ביצית דג הזברה

Summary

פרוטוקול אופטימיזציה עבור הבשלה חוץ גופית של ביציות דג הזברה המשמש מניפולציה של מוצרים הגן האימהי מוצג כאן.

Abstract

אירועים הסלולר המתרחשים בשלבים המוקדמים של התפתחות עוברית חיה מונעים על ידי מוצרי גן נגזר אימהי שהופקדו לתוך הביצית מתפתחת. בגלל האירועים הללו מסתמכים על מוצרים אימהיים אשר בדרך כלל לפעול בקרוב מאוד לאחר ההפריה-כי preexist בתוך הביצה, הגישות סטנדרטיות ביטוי וצמצום פונקציונלי מעורבות ההזרקה של חומרים כימיים לתוך הביצית המופרית הן בדרך כלל לא יעילות. במקום זאת, מניפולציות כאלה חייבות להתבצע במהלך oogenesis, לפני או במהלך ההצטברות של מוצרים אימהיים. מאמר זה מתאר בפירוט פרוטוקול להבשלה במבחנה של ביציות דג הזברה בשלה הפריה חוץ גופית הבאים שלהם, מניב עוברים קיימא כי לבגרות. שיטה זו מאפשרת המניפולציה הפונקציונלית של מוצרים אימהיים במהלך oogenesis, כגון הביטוי של מוצרים עבור הצלת פנוטיפי ו להדמית מבנה מתויג, כמו גםזה הפחתה של תפקוד הגן באמצעות סוכנים-גנטיקה הפוכה.

Introduction

במהלך הפיתוח של בעלי חיים, מוצרי גן פיקדונות אמא (למשל, RNAs, חלבונים, ביומולקולות אחרות) לתוך הביצה; מוצרים אלה הם חשובים עבור תהליכים תאיים מוקדם מיד לאחר הפריה ^{1, 2.} המניפולציה של הביטוי והתפקוד של מוצרים אימהיים היא בדרך כלל לא יעילה כשמשתמש בגישה סטנדרטית ההזרקה של חומרים כימיים לביצים מופרות ^3. זאת משום שרוב RNAs וחלבונים מיוצרים על ידי הביצית במהלך oogenesis, כך שמוצרים אימהיים טעון מראש כבר נמצאים בתוך הביצית בשלה. מוצרים קודמים כאלה הם אטומים מציאה פונקציונלית עם סוכני מיקוד גן, כגון oligos antisense Morpholino (MOS), כי MOS למקד את ה- mRNA, לא החלבון הקודם שכבר קיים הביצה על הפריה. בנוסף, תהליכים עובריים מוקדמים רבים קורים מהר מדי לאחר ההפריה להיות influenCED ידי מוצרי חלבון נגזרים RNA מוזרק לתוך הביצית המופרית, כמו רנ"א לא יכול להיות מיוצר מהר מספיק כדי להשפיע על האירועים הראשונים של עובר. מאותה הסיבה, מתויג תערובות חלבון הביעו באמצעות הזרקת mRNA לתוך הביצית המופרית לא יכול להיות מיוצר בזמן להדמיה במהלך התפקיד הפעיל שלהם בעובר המוקדם. ההזרקה לתוך ביציות בוגרות נמתחות לפני הפעלת ביצה אפשרית אך קשורה בנושאים טכניים דומים: ביציות בשלות כזו כבר טעונות מראש עם חלבון אימהי, והם לא יהיו פעילים translationally (כלומר, לייצר חלבון מן התמלילים אקסוגניים) עד אחרי הביצה הַפעָלָה. מסיבות אלה, המניפולציה של מוצרי גן אימהיים הפועל העובר מוקדם בדרך כלל צריכה להתבצע במהלך oogenesis ב הביצית הבשלה.

כפי גישה אחת התגברות על קשיים אלה, בשיטות הבשלה חוץ גופית, המאפשרות להבשלה של OOCytes מ IV הבמה כדי היווצרות הביצה, הוקמו דג הזברה. שיטות מוקדם מותרות הבשלה במבחנה, אך הביצים בוגרות וכתוצאה היו לא מוכשרות להפריה ^4. לאחר מכן, המניפולציה של תנאי התרבות מן ניטראלי 9.0 pH, מחקה את pH הבסיסי של נוזל ההשחלות נמצא מיני דגים ^{5, 6,} מותר להפריה אמינה במבחנה (IVF) לאחר במבחנת התבגרות ^{7, 8.} ואכן, במבחנה ביציות -matured יכול להניב עוברים קיימא כי לבגרות וכי הם פוריים ^{3, 8.} שיטה משופרת הותאמה נוספת לכלול המניפולציה התפקודית של גנים של האם, את הביטוי של חלבונים מתויגים במהלך oogenesis דג הזברה באמצעות ביטוי חיצוני, בתיווך MO פונקציונלי להפיל ב מחצלתuring שלב IV ביציות ³ (איור 1).

Oogenesis הזברה מציג מספר שלבים אופייניים המובילים להיווצרות של ביציות בוגרות ⁹ (ראה טבלה 1 עבור מדריך מהיר בשלבים השונים oogenesis). בקצרה, פיתוח הביצית היא ביוזמת הבמה ואני ביציות והיא נעצרה בשלב diplotene של לי prophase של המיוזה. ביציות אלו עוברים צמיחה באמצעות שעתוק פעיל (יזם בשלבים IA ו- IB), היווצרות של alveoli קליפת המוח (הידוע גם בשם גרגרי קליפת המוח, יזם בשלב II), ו vitellogenesis (יזם בשלב III). צמיחת ביצית תושלם במהלך השלב הרביעי, כאשר המיוזה לי קורות חיים, וכתוצאה מכך את פירוק גרעין הביצית, המכונה השלפוחית ​​הנבטיה (GV). לאחר מכן, המיוזה הוא נעצר שוב metaphase השנייה. השלמת צמיחה הביצית ומעצר meiotic בשלב IV מוביל למשל V לשלב בוגרז ^9. הסרת קרום הזקיקים מתרחשת במהלך שחרור הביצית לתוך לומן של השחלה ¹⁰ והוא חיוני הפריה והפעלה ביצה ראויה. לאחר הביצים נמתחות מאמם במהלך הזדווגות טבעית, הם הופכים הופעלו. דג הזברה, חשיפה למים מספיקה להפעלת ביצה מלאה, ללא קשר לנוכחות של זרע ^11.

בתנאים במבחנה מאפשר כרגע להבשלה של ביציות משלב מוקדם IV-אשר ניתן לזהות לפי הגודל (690-730 מיקרומטר), בנוכחות GV גדול בעמדה האסימטרית, ואת מראה אטום לחלוטין עקב הצטברות של חלבוני חלמון (איור 2B) A הביצה הבמה V הבוגרת, מאופיינת GV מפורק לחלוטין וחדר מראה שקוף בשל חלמון עיבוד חלבון ¹² (איור 2 ג). בגישה זו, כולה שחלות המשךביציות aining בשלבים שונים של פיתוח יוסרו נקבות. ביציות רשאים לפתח 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-אחד (DHP), א-גרימת ההתבגרות יעיל הורמון ^8. במהלך תקופה זו, ביציות התבגרות ניתן להשפיע באמצעות הזרקה של ביטוי (למשל, הכתיר, במבחנה -transcribed תעתיקי) או לעשות פעולות של גנטיקה סוכנים (למשל, MOS). שכבת הזקיקים לא לשפוך ספונטנית לקראת סוף תקופת ההתבגרות, אז זה חייב להיות מוסר באופן ידני. לאחר defolliculation, הפריה חוץ גופיית מושגת על ידי מפעילת הפעלת ביצה באמצעות חשיפת הביצים למים (נוכח עוברי (E3 בינוני)) ¹³ ו פתרון זרע. Zygotes וכתוצאה לעבור התפתחות עוברית ולאפשר בהערכת היכולת של טיפולים כדי לתפעל תפקוד גן אימהי והן עבור להדמיה והניתוח של מוצרים אימהיים מתויגים ( איור 3).

Protocol

כל דג הזברה טופלה בהתאם קפדנים עם תרגול חיה טוב, כפי שהוגדרה על ידי הגופים רווחי בעלי החיים לאומיים ו / או מקומי הרלוונטיים, וכל העבודה בבעלי החיים אושרה על ידי הוועדה המתאימה (אונ' A3368-01 מספר האבטחה ויסקונסין-מדיסון). בעלי החיים יוחזקו בתנאים סטנדרטיים ב 26.5 מעלות צלזיוס.

1. טרום בחירה של נקבות

הערה: ביציות יכולות נשים בוגרות משתרעות בדרך כלל מגוון של שלבים התפתחותיים, משלב I עד V (איור 2). טיהור הנקבות של ביציות קודמות באמצעות הזדווגות טבעית מוצלחת מגדילה את הסנכרון של היערכות ביצית, כפי שזה עתה בפיתוח ביציות להופיע בתור עוקבה ^{3, 14.} בתוך כ 8 ימים לאחר טיהור, רוב הביציות נמצאות IV בשלב מוקדם, שבו הוא אופטימלי עבור החניכה של הבשלה במבחנה. סנכרון כזה מגדיל את התשואה של ביציות that יכול לעבור את התהליך המלא של הבשלה במבחנה, הקלת מניפולציה ניסויית. ראה ¹³ תיאורים קודמים לפרטים על הקמת דגי הזדווגויות זיווג ועל הרכב מים ודגים (כאן, 14 גרם של מלח ים 150 גרם של NaHCO ₃ ל -1,000 ליטר של מים אוסמוזה הפוכים, pH 6.5-8.5 (טווח מועדף: 6.8 -7.5) לבין מוליכות של 180-360 מיקרו-שניות). ראה ואח 'ברנד. ¹³ מתכונים נוספים.

1. שמונה עד עשרה ימים לפני המניפולציה תרבות חוץ גופית, השתמשו ברשת דגים להעביר זכר יחיד דג נקבה אחת של זן הרצוי טנק ההזדווגות. קבוצות מרובות זוג. השאירו אותם בן לילה טנק ההזדווגות. אפשר להם להזדווג במהלך הערב ושעות אחר הצהריים של יום המחרת.
2. השתמש נטו דגים להפריד את הנקבות כי להניב ביצים במהלך ההזדווגות ולמקם אותם למיכל נפרד. Feed הנקבות האלה פעמיים ביום עם תערובת מזון containing כ כמות שווה של ארטמיה פתיתי מזון לדגים. כמות המזון צריכה להיות מספיק כדי לספק כ 20 דקות, אבל לא יותר, זמן האכלה.

2. הכנת התבגרות בינונית

הערה: כן בינוני התבגרות ביום הניסוי הבשל חוץ גופייה, בתוך 1 h של הסרת הביציות מן הנקבה (ראה סעיף 3).

1. להוסיף 20 מ"ל של מדיום L-15 של ליבוביץ עם-גלוטמין L, pH 7.0, צינור חרוטי 50 מ"ל בתנאים סטריליים. תביאו אותו pH 9.0 עם 10 N NaOH.
2. להוסיף 9 מיליליטר של מדיום L-15 של ליבוביץ, pH 9.0, כדי 2 צינורות חרוטים נפרדים 50 מיליליטר. לייבל 1 צינור "+ DHP" והשני "-DHP."
3. בשנת הצינור + DHP, להוסיף 10 μL של 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-אחד (DHP), 490 μL של DH ₂ O, ו 500 μL של אלבומין 10% שור (BSA).
4. בשנת הצינור -DHP, להוסיף 100 μL של 10 מ"ג / מ"ל ​​gentamycin, 40081; L של DH ₂ O, ו 500 μL של 10% BSA.

3. Dissection של ביציות וייזום של תרבות חוץ-גופית

הערה: ניסוי התרבות במבחנה מתבצע עם נקבות שנבחרו מראש 8-10 ימים אחרי שהם משחררים ביצים באמצעות הזדווגות טבעית. השתמש בינוני בשל שנעשה באותו היום (ראה סעיף 2). ביציות בוגרות כראוי אם לנתיחה החלה סמוכות לסוף מחזור ימי הדגים (נקבע במעבדה על ידי תאורה מלאכותית שנקבע מראש במתקן הדגים) ^13, ואולי מחקה תהליכים המתרחשים באמצעות הזדווגות טבעית. משמעות הדבר היא כי רוב השלבים פרוטוקול חייב להתבצע בשעות הערב אם הדגים הם שוכנו במתקן עם מחזור אור רגיל (למשל, מתחילה בצעד 3.2 בשעה 6 בערב במתקן עם תקופת האור 8 am כדי 10 בלילה), למרות עבודה בזמן תקופות אחרות אפשריות עם מחזור אור זמן שהוסט כראוי.

1. כן פתרון מניות 0.2% tricaine ב DH ₂ O, שנאגר עד 7.0 pH עם 1 M טריס, pH 9.0, ולשמור את הפתרון הזה ב 4 ° C. זה יכול להיות מוכן מראש.
2. ליזום את h הניסוי 0-4 לפני סוף מחזור האור היומי במתקן. בכוס 250 מ"ל, להוסיף 20 מ"ל של פתרון מניות 0.2% tricaine, pH 7.0, 80 מ"ל של מים ודגים ומערבבים.
3. מעבירים את הנקבות שנבחר מראש פתרון tricaine ו להרדים אותם על ידי חשיפת יתר. השאר את הנקבות בפתרון tricaine עבור 15 דקות לאחר הפסקת תנועת זימים.
4. בעזרת כף, לאסוף את הדגים מורדמים מפתרון tricaine ולשטוף אותם בקצרה במים דגים. מניחים את הדג על גבי מגבת נייר כדי לספוג את עודפי המים.
5. השתמש סכין גילוח נקי לערוף את הדגים מורדמים ברמה של סנפיר החזה. בעזרת מספריים לנתח, לעשות חתך אורכים בצד הגחון של הדג, הרחבת המסוף הקדמי לאזור האנאלי.
6. מניח את הדג על צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ לנתח עם אור האירוע. בעזרת זוג מלקחיים לנתח, להעביר חלקים השחלה אל צלחת תרבות 35 x 10 מ"מ המכיל 4 מ"ל של מדיום L-15 של ליבוביץ + DHP.
   הערה: השחלות, אשר מכילות ביציות מתפתחות, תופענה מבנים אטומים וגבשושיים בתוך חלל הגוף הפנימי.
7. בעזרת מלקחיים לנתח, לנתק את הביציות בעדינות מן המוני זקיקים. מיין ביציות מוקדם בשלב IV (איור 2B; לפני התמוטטות GV, בגודל כמעט מירבית מאופיין הציטופלסמה כהה, אטום ו GV ברורה ממבט הממוקם סימטרית בתוך הביצית). בטל ביציות בשלבים מוקדמים יותר (איור 2 א) וביצי V הבמה שקופות, בוגרת (דומות לאלה באיור 2C אך נוכח השחלות לפני טיפול DHP).
   הערה: ביציות נבחרות התבגרות ב IV בשלב מוקדם, בשלב המוקדם שתוצאתו oocyt הבוגרת, השלב החמישיes אחרי התנאים תרבות במבחנה (איור 2C ו- D) ^3. בגלל ביציות בשלב IV מייצרים מוצרים באופן פעיל, מניפולציה בשלב זה מאפשרת ביטוי של מוצרי אקסוגניים באמצעות הזרקת RNA או להפחתת תפקוד הגן באמצעות MOS הציג.
8. השתמש pipet כוס פסטר להעביר ביציות IV בשלב מוקדם כדי בצלחת תרבות הפלסטיק השני 35 x 10 מ"מ המכיל 4 מ"ל של מדיום L-15 של ליבוביץ + DHP. העבר כמויות מינימליות של המדיום -DHP אל צלחת ובה הפתרון + DHP.

4. microinjections ביצית

הערה: מבודד בשלב IV ביציות עוברת בתהליך הבשלה במבחנה ניתן microinjected להציג ריאגנטים עבור מניפולציה תפקודית או ביטוי חלבון מתויג. את microinjection של ריאגנטים, כגון mRNA ו MOS (ראה סעיף 4), הוא בדרך כלל מתבצע כאשר הביציות עוברות במבחנת matuיחס במדיום + DHP, לפני defolliculation. אם תרצה, כדי לאפשר יותר זמן לנהל מניפולציות לפני הבשלת ביצית, הזריקות יכולות להתבצע גם במדיום -DHP, לפני ההבשלה, עבור h 2 לפחות. הם יועברו לאחר מכן עד בינוני + DHP.

1. כן תעתיק באמצעות ערכת ביטוי סטנדרטית. להשאיר אותן -80 ° C כמו מניה 100-500 pg / μL להזרקה בריכוז סופי של 50-500 pg / μL (200 pg / μL מומלץ) במים רנ"א-כיתה. כן MOS בריכוז של 4 ng / μL במים לפי הוראות היצרן. להזריק אותם בריכוזים סופיים של 2 ng / μL (או כפי שנקבע באופן אמפירי).
   הערה: זריקות בדרך כלל מבוצעים במדיום + DHP לפני defolliculation (ראה הערה בסעיף 5).
2. אם מזריקים mRNA, מיד לפני ההזרקה, לדלל את ה- mRNA באמצעות מים כיתה RNA אוסמוזה הפוכה ו 0.2 M KCl להשיג פתרון סופי של 0.1 M KCl.
3. אם הזרקת MOS, מיד לפני ההזרקה, לדלל את MOS לריכוז הרצוי באמצעות מים אוסמוזה הפוכה ו 0.2 M KCl להשיג פתרון סופי של 0.1 M KCl.
4. ידני להחזיק ביציות עם מלקחיים בסדר להזריק כ 1 NL לתוך ביציות בשלב IV מסוג פרא באמצעות מחט עשתה עם טפטף נימי משך-זכוכית.
   1. הכן את המחטים זכוכית על ידי משיכת צינורות זכוכית נימי מחומם, טעינת הפתרון להיות מוזרק, וגם לשבור את קצה המחט עם מלקחיים, כפי שתואר לעיל פרוטוקולים עבור זריקה רגילה לעוברי מוקדם דג הזברה ^15.
      הערה: זה מועיל אם המחט יש להתחדד הדרגתי ולא פתאומי אחד; זה מאפשר יותר גמישות מבחינת המיקום של הפסקה קצה מחט וגם עוזר למנוע נזק לעובר מוזרק. שימוש באותה המחט פתרון באשר הזריקות העוברות, להתאים את עוצמת הקול מוזרק על ידי מראש בקביעההגדרות לחץ microinjector המייצרים את העוצמה הרצויה. ניתן לקבוע הגדרות אלה על ידי מדומה-הזרקת טיפת שמן מינרלי בשקופית כיול הבמה מיקרוסקופ (0.01 מ"מ) והתאמת הגדרות microinjector להשיג בקוטר הרצוי בולוס של פתרון מוזרק, כפי שתואר לעיל ^15.

5. הבשלת הביצית ו Defolliculation

הערה: במהלך הבשלת ביצית, הביציות תהפוכנה שקופות בהדרגה, אשר מאפשרת ההערכה של תנאי תרבות מוצלחים.

1. המשך הדוגרים בשלה (ובמידת צורך, מוזרקות) ביציות במדיום + DHP ב 26.5 מעלות צלזיוס, מעת לעת הבדיקה (כל 30 דקות) כדי להבטיח כי הביציות להישאר שלמות עוברות התבגרות נאותה על ידי הפיכתו שקופה בהדרגה (ראה איור 2 ג) .
   1. הסר ביציות lysing עם פיפטה פסטר וזורקים אותםבכוס פסולת מעבדה כדי לשמור על האיכות של המדיום. חילופי בינוני התרבות עם כ-נפח מחצית בינונית טרי + DHP לשמור פתרון ברור, בהתאם לכמות לתמס ביצית.
   2. אפשר בשל במבחנה להמשיך עד ברוב של הביציות להיות שקופים ויש לי GV כי הוא כבר לא נראה לעין (כ 2 h בטיפול DHP, ראו האיור 2C לעומת D). הצג אותם תחת מיקרוסקופ לנתח עם אופטיקה אור מועבר.
2. הסר את קרום הזקיקים החיצוני ביותר מכל ביצית התבגרה. שימוש במלקחיים חוץ-בסדר לעשות קרע בקרום הזקיקים באזור עם שטח מוגבר בין הביצית לבין הממברנה. לקלף חלק הממברנה לגלגל את הביצית מחוץ קרום תוך החזקת חלק מקולף.
   הערה: קרום כוריוני הבסיסי יהיה בדרך כלל להישאר בשיתוף הדוק עם הביצה במהלך תהליך זה; אחרי ביצת מעשהivation, היא מתרחבת כדי ליצור שכבת מגן על העובר.
3. מעבירים את ביציות defolliculated בנפח מינימלי של המדיום (בדרך כלל, להעביר כ 5-10 ביציות בוגרות תוך פחות מ 20 μL) כדי בצלחת פטרי עם כמה טיפות של תרבות (+ DHP) בינוני ולהמשיך הפריה.

6. הפריה של ביציות בתרבית חוץ-גופית

הערה: הפתרון הזרע על הקרח, הכין מתחת, תשמור העוצמה שלה במשך כ 2 h.

1. כן פתרון זרע לקראת סוף שלב הבשלת ביצית ולפני defolliculation אשכים באמצעות מחמש זכרים ב 500 μL של הפתרון הנקס, כפי שתואר לעיל ^{16, 17.}
2. להוסיף 10-50 μL של פתרון הזרע אל ביציות defolliculated במדיום תרבות + DHP. חכו 10 s.
3. בעזרת פיפטה, להוסיף כמה טיפות של עובריים (E3) בינוני ביציות. חכו 1 דקות ולאחר מכן לשטוף את plאכלו עם מדיום E3.
   הערה: הרכב בינוני E3 היא כדלקמן: 5 מ"מ NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 מ"מ CaCl _2, 0.33 מ"מ MgSO _4, ו 1-5% מתילן בלו ^13.
4. חזור על שלבי 5.3, 6.2, ו 6.3 להשיג מספר גדול יותר של עוברים מופרים.
5. אפשר העוברים מופרית לפתח. שימוש במיקרוסקופ לנתח עם אופטיקה האור המועבר לצפות להתקדמות בשלבים מחשוף כדי להבטיח הפריה מוצלחת, כפי שתואר לעיל עבור הפריה ^17, וביום ^18.

תוצאות

כדי לקבוע אם ההליך המתואר לעיל מצליח, העוברים ניתן להבחין בשלבים המחשופים כדי לאשר את המראה של דפוס המחשוף הסטריאוטיפי מוקדם העוברי ^18, כמו גם 24 שעות לאחר הפריה (hpf) כדי לאשר את ההתפתחות התקינה תכנית הגוף הבסיסית. הליך זה מאפשר המניפולציה של מוצרים אימהיים ללימודים תפקודיים באמצעות ההזרקה של חומרים כימיים, כגון תעתיק ו MOS, במהלך פיתוח ביצית.

מניפולציה של מוצרים אימהיים ללימודים תפקודיים:

קידוד mRNA עבור wild-type ומוצרים מוטציה ניתן להזריק לתוך מבחנה ביציות התבגרות כדי לבדוק את ההשפעה של המניפולציה של תפקוד הגן האימהי במהלך המיוזה ואת בשלבים עובריים מוקדמים. לדוגמא, עובר wild-type ניתן להזריק עם אינטרנטmRNA LD-הסוג כדי לבדוק את ההשפעה של ביטוי יתר של מוצר, או עם RNA המוטציה לבדוק דומיננטיות פוטנציאל (למשל, לזכות של פונקציה ו antimorphic) תופעות בתהליכים אלה. ביציות בתרבות במבחנה מסוגלות לייצר חלבון מ- mRNA אקסוגניים ברחבי פיתוח ביצית, כפי שמוצג על ידי הביטוי של GFP מ- mRNA המוזרק, אם כי רק ביציות כי ליזום תנאי תרבות בשלב IV של oogenesis יכולה להתפתח ביציות V לשלב בוגר (איור 2B -2D, ראה גם יאיר ואח. ^3). הביטוי של מוצר מסוג פרא דרך mRNA מוזרק גם אינסטרומנטלי למען הצלתה של מוטציות אימהי-אפקט לאשר זהות הגן במהלך שיבוט מיקומית ^{3, 24.} במקרה זה, ה- mRNA מסוג פרא מוזרק לתוך ביציות מנשים מוטציה הומוזיגוטים לבדוק אם מוצרים מסוג פרא יכול להציל את פנוטיפ מוטנטי. זו הצלה גנטית מתוארת איור 3A-3C, שבו מוזרק mRNA AurB מוצג להציל את ההשפעות פנוטיפי של מוטציה בגן המקביל שלה, האי הסלולר (CEI) (איור 3A-3C). העוברים מקבוצה מלאה מותר גם לפתח להראות את פנוטיפ מוטנטי המקביל ^3. RNA Mutant ניתן להזריק גם לתוך ביציות מוטציה כדי לבדוק אם המוצר מוטציה שומרת פונקציה חלקית על ידי השוואת מידת הצלה לנזקים שנגרמו עקב המוצר wild-type.

ביטוי חלבון מן mRNA מוזרק לתוך ביציות מתפתחות נראה להתרחש עם עיכוב מעט או ללא. ביטוי GFP החזק הוא ציין בתוך 2 h של ההזרקה של ה- mRNA המתאים, ללא קשר לשלב ההתפתחותי של ביצית ³ (איור 2B-2D; ראה גם תאיר ואח ^3.). מוצרים כגון mCherry:Sas6 ו Birc5b (Motley): GFP ניתן להבחין מיד לאחר ההפריה ובמהלך מחזור התא העוברי הראשון ^{3, 25.} ההזרקה של ה- mRNA במהלך oogenesis גם מובילה את הייצור של חלבון זה, ללא קשר המחצית המתויגת התמזגה, הוא פונקציונלי מייד לאחר הפריה, כפי שמוצגים במקרה של מוצרים אימהיים עבור אי הסלולר / ³ aurB, מחזור עקר / lrmp ^24, ו מוטלים / bir5b ^25. תרגום-חסימת גם MOS השפעה מיד לאחר ההפריה, כפי שמוצג על מחזור עקר / Lrmp ³ ו בשלבים מאוחרים יותר של העובר, כמו במקרה של משימה בלתי אפשרית / dhx16 ^3. אחוי-חסימת MOS, כאשר מוזרקים ביציות התבגרות, אולי לא יהיה השפעה על תפקוד אימהי, ככל הנראה עקב שכבר כיום תעתיק אימהי בוגר ביציות בשלב IV ^3.

דור של morphants:

בעת שימוש MO המתאים גן עם מוטציה כבר-מזוהה, פנוטיפ morphant צפוי לחקות את פנוטיפ מוטנטי. Morphants מושווה עובר uninjected ולאלה מוזרקים עם סטנדרט, לשלוט MO. הזרקה של morpholino חסימת התרגום מצליח phenocopy את פנוטיפ מוטנטי ידוע ^3, כפי שמוצג על ידי הזרקה של Lrmp MO לתוך ביציות, אשר מחקה את פנוטיפ מוטנטי של המוטציה המקביל, מחזור סרק (איור 3D-F). הספציפי של MOS ניתן לקבוע באמצעות אותו הגישות בשימוש בעת הזרקת MOS לעוברים (שנבחן בעבר) ^{19, 20.}

ביטוי של חלבוני היתוך שכותרתו fluorescently:

mRNA קידוד למוצרי הגן של עניין התמזגו חלבוני ניאון (למשל, ה- GFP ו mCherry) יכול גם להיות מוזרק לתוך או wild-type או ביציות מוטציה לדמיין את המוצרים המתאימים בתוך העובר מוקדם (כלומר, המשקף דפוס לוקליזציה subcellular; איור 3G ו 3H). תעתיקי קידוד עבור תערובות דומות אך מעורבי האלל המוטנטי יכולים לבוא לידי ביטוי באופן דומה כדי לבדוק אם המוטציה משפיעה בשום localizations התת-תאי פוטנציאל.

איור 1: In Vitro הביצית הבשלה. תרשים סכמטי המציג את השלבים השונים הכרוכים הבשלת הביצית במבחנה. נקבות בוגרות הם שנבחרו מראש על-נחת ביצה 8 ימים לפני ההליך, כדי לטהר אותם ביצים שכבר התבגרו וכדי פרוMote פיתוח ביצית חדש. השחלות, המכילה ביציות מתפתחות, יוסרו נקבות והועברו מדיום המכיל את DHP ההורמון לגרום הבשלת ביצית במבחנה. לאחר ההסרה מן הנקבות ומייד לפני או במהלך הבשלת ביצית, ביציות ניתן להזריק עם מוצרי RNA ריאגנטים אחרים עבור המניפולציה התפקודית של גורמים אימהיים. ביציות בוגרות הם defolliculated ידני מופרים במבחנה עם פתרון זרע להניב עוברים מופרים, קיימא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: In Vitro ביצית בשל ביטוי של מוצרי מ- mRNA המוזרק. (א) ביציות בשלבי I-III, שנצפו שחלותנקבות 4 ימים שלאחר טיהור (DPP). (ב) ביציות בשלב IV, שנצפו שחלות מהנקבות." 8 DPP. השלפוחית ​​הנבטיה (GV, ראש החץ) נראית בבירור ואת תופסת תפקיד אקסצנטרי. השלב השלישי ביציות ב (א) גם להפגין GV ברורה ממבט ראשון, אבל הוא נמצא מרוכז בתוך הביצית. ביציות שלב IV ב (ב) יש גודל כי הוא קרוב מירבית בהשוואה לזו של ביציות בוגרות ב (ג). (C ו- D) ביציות בשלב V (להבשיל ביציות) לאחר 2 h בתנאים הבשלה במבחנה יזם בשלב IV, כמו (B), והזריקו במהלך ההתבגרות עם קידוד GFP, במבחנה עיבד ה- mRNA (C, האור הנראה רק; D, כיסוי של האור הנראה הקרינה GFP). GV היא כבר לא נראית לעין ביציות בשלב V, אשר גם פחות אטום מאשר ביציות בשלב IV. ביציות מוזרקות לבטא חלבון ה- GFP (D). Defolliculation של ביציות בשלב IV בוגרות היא described בסעיף בפרוטוקול. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר. כל לוחות הועתקו, באישור, מן נאיר ואח ^3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: שיבושים ו ויזואליזציה של מוצרים אימהיים דרך במבחנת ביצית בשלה. (A - C) החילוץ של פנוטיפ אימהי-השפעה הנגרמת על ידי מוטציה B סלולר האי / אורורה באמצעות הזרקה של mRNA מסוג פרא aurB לתוך ביציות בשלב IV CEI / aurB. תמונות ממוזגות מראות נוף חיה של 65 blastodiscs MPF הקבוע, דמיין עם נוגדנים אנטי-האס-קטנין להדגיש ממברנות (ירוק), נוגדנים אנטי-α-טובולין כדי לציין מיקרוטובולים (אדום), ו DAPI לייעד DNA (כחול). (א) הצטברות β-קטנין בעוברים מהסוג פרא, מעידה על התבגרות תלם נורמלית. (ב) העובר CEI / aurB מן הביצית בשלב IV uninjected CEI / aurB מציגה התלמים חלקית, בסיסי אשר אינם צוברים β-קטנין. (ג) הצילה CEI / עובר aurB מן ביצית CEI / aurB הוזרקה mRNA מהסוג פרא aurB מראה הצטברות β-קטנין חזקה בבית התלמים. (D - F) Phenocopy של אפקט אימהי הנגרמת על ידי מוטציה מחזור עקר / lrmp מן הזרקה של Lrmp morpholino לתוך הבמה IV ביציות. תמונות ממוזגות מראות נוף חיה של 70 blastodiscs קבוע MPF, דמיין עם נוגדנים אנטי-γ טובולין כדי לציין centrosomes (אדום) ו DAPI לייעד DNA (כחול). (ד) עובר מסוג פרא, כל מקורביו גרעין עם טובולין γ, סמן חומר centrosomal. (E) ב מוטנטים FUE אימהי-השפעה, פיוז'ן pronuclear נכשל, וכתוצאה מכך בשתיים עד שלוש מדבקות תוויות DNA התואמות-גרעינים פרו הורית unfused וגוף הקוטב עבור המיוזה השנייה. (ו) morphants Lrmp, שבו הפונקציה Lrmp אימהי מעוכבת, גרעינים להיכשל באופן דומה לחלק ובנוסף, אינם מקשרים עם טובולין γ. (G ו- H) ויזואליזציה של המוצר אימהי המיוצר בעובר המוקדם. Sass6-mCherry חלבון מ- mRNA אקסוגניים מוזרק לתוך הבמה IV ביציות מבצע לוקליזציה של צנטריול. תמונות ממוזגות מראות נוף חיה של 40 blastodiscs קבוע MPF, דמיין עם נוגדנים אנטי-γ טובולין להדגיש centrosomes (ירוק), קרינת mCherry כדי לציין Sass6 (אדום), ו DAPI לייעד DNA (כחול). (G) הביע Sass6-mCherry חלבון מבצע לוקליזציה של מוקדים שכותרתו ידי הסמן centrosome γ טובולין באתרי איגוף הגרעין (חיצים). (H ), מראה רק Sass6-mCherry ו DAPI לבהירות. את העוברים (G ו- H) הם קבועים, אבל הקרינה של מוצרים הביעו, כגון תערובות mCherry, יכולה להיות גם ציינה עובר לחיות (לא מוצג). בר סולם = 100 מיקרומטר AF ו 10 מיקרומטר G ו- H. כל לוחות הועתקו, באישור, מן נאיר ואח ^3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

שלבי oogenesis	ביצית קוטר (מיקרומטר)	ציון דרך מפתח (ים)
1A - Prefollicle	7 עד 20	ייזום של שעתוק פעיל, הצטברות של nucleoli
1B - זקיק	20 כדי 140	Decondensation של הכרומוזומים
שני - נֹאדִית קורטיקלי	140 כדי 340	ייצור alveoli קורטיקלי
III - Vitellogenesis	340 כדי 690	החשכת ooplasm ידי הצטברות של חלבון ושומנים חלמון מבשר
IV מוקדם - הבשלת הביצית	690 כדי 730 (טווח תחתון)	לוקליזציה אסימטרית של שלפוחית ​​נבטיה
IV מוקדם - הבשלת הביצית	690 כדי 730 (טווח עליון)	שלפוחית ​​רמינל נעלמת, מעצר בבית metaphase II
V - ביצית למבוגרת	~ 750	Ooplasm / חלמון הופך שקוף

טבלה 1: ציוני דרך של התפתחות הביצית זברהדג.

Discussion

הפרוטוקול הנ"ל הוא המניפולציה של מוצרי גן לפני ההפריה, ובכך מאפשר לחקר מוצרי גן אימהיים בעובר דג הזברה מוקדם. מחקרים קודמים הצליחו להבשיל ביציות במבחנה ^4; פרוטוקול זה עבר שינוי כדי לאפשר ההפריה הבאה של במבחנה התבגרה ⁸ ביציות. זה בתורו מאפשר הזרקה של חומרים כימיים עבור מניפולציה פונקציונלי להדמיה של מוצרים בירושה אימהי בעובר המוקדם ^3. עובר נובע שיטה זו יכולה להיות בת קיימא ויכול לשרוד להיות מבוגרים פוריים. בניסויים ראשוניים, כמחצית עוברי המופרות נגזרים בהליך זה הייתה קיימא ביום 5 של פיתוח, כפי שהוערך על ידי אינפלציה בשלפוחית ​​שחייה בשלב זה, כמחצית שהפך בריאות, מבוגרים פורים (תצפיות לא פורסמו).

ישנם מספרשלבים קריטיים של לשקול בפרוטוקול. ביציות בשלב המתאים ליזום התבגרות (IV בשלב מוקדם) ניתן מועשרות אם הנקבה כבר הזדווגו לאחרונה, אך לא לפני 8 DPP. באמצעות דגים שלא הזדווגו לאחרונה עלול לגרום מתנוונת ביצים ^14, אשר לא עוברים התבגרות. נקבות שהזדווגו בתוך פחות מ 8 ימים תהיינה רוב של ביצים בשלב III או פחות, ובכך, את הביצים לא תבשלנה כהלכה במבחנה. שחלות אצל נשים שהזדווגו לפני 8 ימים תהיינה חלק אופטימלי של ביציות ב IV בשלב מוקדם. אלה יכולים להיות מוכרים על ידי האטימות שלהם ואת הנוכחות של GV בעמדה אקסצנטרית (האיור 2B). נחישות ביצית בשלב יכולה להיות גם בעזרת מדידת גודל, עם הביציות להציב לשקופית מיקרומטר בוגר תחת מיקרוסקופ לעומת הנחיות היערכות סטנדרטיות (לוח 1). עם זאת, ביציות IV בשלב מוקדם יש גודל כמעט מקסימאלי לעומת להתבגרביציות (מוכרות על ידי שקיפות והחוסר היחסי של GV; איור 2C) ומוכרים בקלות, כפי שתוארו לעיל, אשר בדרך כלל אינו המצריך של מדידת גודל ביצית ישירה.

בשינה הבשלה במבחנה חייב להתחיל בתוך מספר שעות של סוף מחזור האור שאליו תורם ביצית האישה הם יתרגלו. ביציות לא יבשילו כהלכה, משתקף בשיעורי הפריה עניים, אם תורבתו בתקופת הבוקר של מחזור אור. סיבת תלות היממה של שיטת הבשלת הביצית במבחנה אינה מובנת אך סביר משקפת הטיות יממה בסיסיות התבגרות ביצת in vivo מעורבת ביטוי גני אופניים במהלך oogenesis ^21. סיבה נפוצה עבור ביציות שלא עוברים מוצלח הבשל במבחנה למרות היערכות ביצית הראויה היא כי DHP פג. הורמון DHP יפוג בדרך כלל אחרי שנה, וכדי להבטיח את האפקטהתבגרות אייב, האצווה העבודה צריכה להיות מוחלפת בתוך 9 חודשים של שימוש.

ההזרקה של ביציות היא עוד צעד קריטי כאשר מטרת השיטה היא המניפולציה הפונקציונלית של מוצרים אימהיים. יש הליך זה דרישות שונות מאלה עבור זריקות רגילות הביצית המופרית ב 0-30 MPF. אחד ממרכיבי המפתח של הזרקת הביצית הוא הצורך לבצע את זריקות בתנאים שאינם להוביל הפעלת ביצה מוקדמת, כגון במדיום L-15 של ליבוביץ ^{22, 23.} מכיוון שהם מוטמעים השחלות, ביציות התבגרות גם להוות אתגר מסוים כדי הזרקה. הפרוטוקול הנ"ל מרמז מתנער ביציות ראשונות מן ההשחלות ואז אוחזים זה ניתק ביצית בנפרד עם מלקחיים בזמן ההזרקה. טכניקה זו עובדת היטב ומאפשרת ביציות טרום מיון בשלב המתאים עם טיפול מינימאלי. יכולות לשמש גם שיטות חלופיות, כגוןכמו: i) ביציות צבת לתוך זריקה רגילה שקתות agarose ^15, שבו הקירות האנכיים של תמיכת שוקת הביצית במהלך ההזרקה (ב שיטה חלופית זו, הביציות צריכות להיות מועברות צלחות הזרקה תוך שמר במדיום בשל חוץ גופייה) ו- II יכול להיות מוחזקת) המאפשר הביציות להישאר למסת השחלות מצורפות, אשר עם מלקחיים במהלך ההזרקה כדי למנוע מגע עם הביצית המוזרקת (בגישה זו, הביציות צריכות להיות מנותקות לאחר הזרקה היא להקל חשיפת DHP ולאפשר defolliculation שלהם חיוני, כשלעצמו עבור IVF). למרות האתגר הספציפי הזה, ביציות בשלב IV ניתן חדרו בקלות עם מחט הזריקה, סביר כי קרום כוריוני בשלב זה אינו מפותח ⁹ במלואו.

מגבלה אחת של פרוטוקול ההתבגרות הנוכחי היא כי בתנאים בשלים במבחנה מקדמת פיתוח ביצית נאהיכול לא ייווצר כאשר הביצית הבשלה הוא יזם בשלבים מוקדמים יותר בשלב IV. הביציות להיות מוכשרות כדי להגיב DHP ידי עובר התבגרות כאשר הם מגיעים בקוטר של 520 מיקרומטר, אשר מתרחש במהלך השלב III (vitellogenesis, מתאים למגוון 340-ל-690-מיקרומטר) ^9. עם זאת, בתרבות תוצאות ביציות בשלב III ביציות שאינן מוסמכים להפריה ^3. רק ביציות אשר במבחנה תרבות היא יזמה ב IV הבמה (איור 2B) יכול להתפתח ביציות בוגרות, שלב V (איור 2C ו- D). זה עשוי להיות קשור לעובדה שלב III הוא חיוני לצמיחה vitellogenesis ואת הביצית ^9. לפיכך, ההליך הבשלת הביצית במבחנה המוצגת במאמר זה אמור לשמש רק עם אוכלוסייה החל שלב IV ביציות (B), ולא עם ביציות בשלבים מוקדמים (שלבים I - III; e Figur 2A). מאותה הסיבה, הליך זה מוגבל גנים באים לידי ביטוי בשלב IV או במאוחר. המניפולציה התפקודית של גנים שמוצריה הביעו מוקדם יותר עשויה במקום יש להסתמך על שיטות גנטיות (ראה להלן). שיפורים שיטות ההתבגרות תרבות במבחנה עשוי בעתיד לאפשר התחלת culturing הביצית בשלבים מוקדמים יותר, ובכך להרחיב את הכוח של הגישה הבשלה חוץ גופית.

מגבלה נוספת של השיטה המוצגת היא defolliculation, אשר חיונית בשלבים הבאים המעורבים הפריה, וכיום היא צעד שער הגבלה בהליך. קרום פוליקולרית הוא שכבה שקופה סביב הביצית מתפתחת, וההסרה יכולה להיות מייגעת. אם הקרום הזה לא יוסר לחלוטין, הביצה לא תהפוך תופעל באופן מלא מופרה. זה שהובהר ע"י הכישלון הסיסי להרחיב את הפיתוח של להציב סדיר, תלם דמוי structures (pseudocleavages), מאפיין של עוברים מופרים ^11. שיטות defolliculation אנזימתי כגון collagenase, כפי שמוצג ב Xenopus, נוסו. עם זאת, בידיים שלנו, הטכניקה הזו לא הצליחה, ולכן אנו מסתמכים על defolliculation ידנית. מכיוון defolliculation הידנית היא עתיר עבודה זמן רב, קשה לקבל קבוצות גדולות של ביצים מופרות לאחר הבשלת ביצית חוץ גופייה. בשל ההגבלה הזמנית שהוטלה על ידי defolliculation הידנית, אנחנו כרגע לדשן כמה ביצי defolliculated, בוגרת בכל פעם, בקבוצות קטנות של 5-10 ביצים. השילוב של defolliculation אנזימטי עם הליך זה היה משמעותי צפוי להגדיל את התשואה שלה וקלות הכוללת שימוש.

למרות העוברים הנוצרים לאחר הפריית מבחנה ביציות -matured יכול להיות מבוגרים קיימא, נציין כי לאחר הפריה חוץ גופית, לחלק מעוברי לעשות לא מחלקים בדרך כלל או מבעוד מועד. בימים אלו אנו בחירה לקווים אשר ההתפשטות כולל סיבובים של הבשלת ביצית חוץ גופייה, אשר עלול לגרום דפוסים חזקים יותר של התפתחות עוברית נגזר באמצעות שיטה זו.

ההליך אפשר עבור ההצלה הברורה או להדמיה של לוקליזציה חלבון במשך מספר המוטציות ^{24, 25.} עם זאת, עבור גנים מסוימים, הרגולציה של ביטוי המוצר עשויה להיות מכרעת, כך המוצרים הביעו ידי מוזרק mRNA עשויים להוביל לתוצאות משתנות ^26. כמו כן, חשוב להיות מודעים כל הפקדים (למשל, עוברים מוזרק עם ריאגנטים בעלי תכונות דומות לאלו ששימשו בניסוי עדיין הם חזו לא לייצר השפעה, כגון MOS שליטה או RNAs קידוד עבור חלבונים אינרטי בלבד, כגון כמו GFP), כפי השתנות בסיסית עשויה להוביל למסקנות לא תקינות.

NT "> גישה המעורבת מניפולציה במבחנה ואחריו הפריה שימושי במיוחד במקרה של מוצרים שהופקדו אימהי, שבו הגישה הסטנדרטית של הזרקת RNA, MOS, או חלבון לתוך הביצית המופרית לא יכול להפחית מוצרים ביעילות שנצברה כבר בתוך הביצה. שיטות אחרות שפותחו לאחרונה, כגון דור קריספר-מוטציה, הם גם יעילות ביצירת תנאי מוטציה בגנים הביעו אימהי ^26. עם זאת, שיטה זו דורשת את הצמיחה של כמה דורות של דגים. טכניקת הבשלת ביצית במבחנה מאפשרת מניפולציה תפקודית מהירה ללמוד את הפונקציה של גנים הביעו אימהי, כולל ההצלה phenocopy של מוטציות אימהית-השפעה, כמו גם הביטוי של רנ"א וחלבונים בעובר המוקדם.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
Na2HPO4	Sigma	S3264
KH2PO4	Sigma	P9791
CaCl2	Sigma	C7902
MgSO2-7H2O	Sigma	63138
NaHCO2	Sigma	S5761
Tricaine	Western Chemical	Tricaine-D (MS 222)	FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base	Sigma	77-86-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl	Sigma	920-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4 - 5 in)	PennPlax	(ThatFishThatPlace # 212370)	available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon			available in most standard stores
Dissecting scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissecting forceps	Dumont	SS	available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source)	Nikon	SMZ645	or equivalent
Reflective light source (LED arms)	Fostec	KL1600 LED	or equivalent
Petri plates 10 cm diameter			any maker
Eppendorf tubes 1.5 mL			any maker
Ice bucket			any maker
Narrow spatula	Fisher	14-374
Depression glass plate	Corning Inc	722085 (Fisher cat. No 13-748B)	available from Fisher Scientific
Paper towels			any maker
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666-11	available from Fisher Scientific
Timer stop watch			any maker
Wash bottle	Thermo Scientific	24020500	available from Fisher Scientific
beakers, 250 mL (2)	Corning Inc.	1000250	available from Fisher Scientific
Leibovitz'z L-15 medium	Thermofisher	11415064
NaOH	Sigma	221465	for pH'ing
BSA	Sigma	A2058
17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP)	Sigma	P6285
gentamicin	Sigma	G1272
Injection Apparatus	Eppendorf	FemtoJet	or equivalent
Capillary Tubing for injection needles	FHC	30-30-1	or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm
Needle puller	Sutter Instruments	Model P-87	any maker
Micropipetor (1 - 20 µL range) with tips			any maker
Micropipetor (20 - 200 µL range) with tips			any maker
Micropipetor (100 - 1000 µL range) with tips			any maker
Conical tubes 15 mL			any maker
Conical tubes 50 mL			any maker
plastic pipette 10 mL with bulb			any maker
plastic pipette 20 mL with bulb			any maker
Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm	AmScope	MR095	or equivalent
Reagents for fish water:
Instant Ocean Salt	Drs. Foster & Smith	CD-116528
Sodium bicarbonate (cell culture tested)	Sigma	S5761-1KG
Reagents for E3 medium:
NaCl	Sigma	S5886-1KG
KCl	Sigma	P5405-500G
CaCl2, dihydrate	Sigma	C7902-500G
MgSO4, heptahydrate	Sigma	63138-250G
Methylene Blue	Sigma	M9140-25G
Fish Food:
Frozen brine shrimp	Brine Shrimp Direct	FBSFKG50
Tetramin Flakes	Drs. Foster & Smith	16623