צבירת Cell מגנטי גזע 3D והתבגרות Bioreactor להתחדשות סחוס

Summary

Chondrogenesis מתאי גזע דורש כוונון עדין תנאי התרבות. כאן, אנו מציגים גישה מגנטית עבור עיבוי תאים, צעד חיוני ליזום chondrogenesis. בנוסף, אנו מראים כי התבגרות דינמית בתוך bioreactor חלה גירוי מכאני כדי המבנים הסלולר ומשפרת ייצור תאי מטריקס סחוסים.

Abstract

הנדסת סחוס עדיין מהווה אתגר בשל קשיים ביצירת שתל במבחנה תפקודית דומה רקמות הילידים. גישה בחנה לאחרונה לפיתוח תחליפים אוטולוגי כרוך הבידול של תאי גזע לתוך כונדרוציטים. כדי ליזום chondrogenesis זה, מידה של דחיסה של תאי הגזע נדרש; ומכאן, הראינו את הכדאיות של תאי עיבוי מגנטי, הוא בתוך פיגומים עבים פיגום ללא שימוש במקורות שדה מגנטיים מיניאטורי כמו משיכת תא. גישה מגנטית זה גם שמשה להנחות היתוך צבירה לבנות פיגום ללא, מאורגן, תלת ממדי (3D) רקמות כמה מילימטרים בגודלם. בנוסף בעל גודל משופר, הרקמה הנוצרת על-ידי היתוך מגנטי מונחה הציגה גידול משמעותי בביטוי של קולגן השנייה, ומגמה דומה נצפתה עבור ביטוי aggrecan. כמו סחוס הילידים היה נתון הכוחות tכובע השפיע מבנה 3D שלה, התבגרות דינמית גם בוצעה. Bioreactor המספק גירויים מכאניים שמש לתרבות הפיגומים המגנטיים הזורעים לאורך תקופה של 21 יום. התבגרות Bioreactor השתפרה במידה רבה chondrogenesis לתוך פיגומי cellularized; מטריקס שהושג בתנאים אלה היה עשיר קולגן השני aggrecan. עבודה זו מתארת ​​את הפוטנציאל החדשני של התעבות המגנטית של תאי גזע שכותרתו והתבגרות דינמית בתוך bioreactor לבידול chondrogenic משופר, הוא פיגומי פוליסכריד הפיגום ללא ובתוך.

Introduction

חלקיקים מגנטיים משמשים כבר במרפאת בתור סוכנים בניגוד עבור דימות תהודה מגנטית (MRI), והיישומים הטיפוליים שלהם ולשמור על רחבה. לדוגמא, הוכח לאחרונה כי תאי שכותרתו ניתן להשפיע in vivo באמצעות שדה מגנטי חיצוני ויכולים להיות מופנים ו / או נשמרו אתר מוגדר של השתלה ^{1, 2, 3.} ברפואת רגנרטיבית, הם יכולים לשמש כדי להנדס רקמות מאורגנות במבחנה ^4, כוללים כלי דם ברקמה ^{5, 6, 7, 8} עצם, ואת סחוס ^9.

סחוס במפרק שקוע בסביבת avascular, עושה תיקונים של רכיבי מטריקס מוגבלים מאוד כאשר הנזקים להתרחש. מסיבה זו, research מתמקדת כרגע על ההנדסה של החלפות סחוס hyaline שניתן מושתלות באתר הפגם. על מנת לייצר תחליף עצמי, כמה קבוצות מחקר בוחנות את השימוש של כונדרוציטים אוטולוגי כמקור תא ^{10, 11,} בעוד שאחרים מדגישים את היכולת של תאי גזע מזנכימיים (MSC) להתמיין chondrocytes ^{12, 13.} במחקרים קודמים סכמו כאן, בחרנו MSC, כמו דגימת מח העצם שלהם היא פשוטה למדי ואינו דורשת את ההקרבה של כונדרוציטים בריאים, אשר עלולים לאבד פנוטיפ שלהם ^14.

מוקדם צעד חיוני כדי ליזום את בידול chondrogenic של תאי גזע הוא ההתעבות שלהם. אגרגטים תא נוצרים בדרך כלל באף אחת צנטריפוגה או micromass תרבות ^15; עם זאת, שיטות התעבות האלה neither להציג את הפוטנציאל ליצור צבירי תאים בתוך פיגומים עבים ולא את הפוטנציאל לשלוט ההיתוך של אגרגטים. במאמר זה, אנו מתארים גישה חדשנית עיבוי בתאי גזע באמצעות תיוג MSC מגנטי משיכה מגנטית. טכניקה זו הוכחה כדי ליצור מבני 3D ללא פיגום באמצעות שילוב של אגרגטים אחד עם השני כדי להשיג רקמות סחוס בקנה מידת מילימטר ^9. זריעת מגנטי של פיגומים עבים וגדולים גם אפשרה את האפשרות של הגדלת הגודל של הרקמות המהונדסות, עיצוב צורה יותר בקלות שימושית עבור השתלה, ולגוון את הפוטנציאל עבור יישומים קליניים תיקון סחוס. כאן, אנו בפירוט את הפרוטוקול עבור הזריעה המגנטית של MSC לתוך פיגומים נקבוביים מורכבים סוכרים טבעיים, pullulan, פולימרים, פיגומים השתמשו בעבר כדי להגביל תאי גזע ^{16, 17.} בידול Chondrogenic היה finally המבוצעת bioreactor כדי להבטיח מזין רציף דיפוזיה גז לתוך ליבת המטריצה ​​של הפיגומים שנזרעו עם צפיפות גבוהה של תאים. מלבד מתן חומרים מזינים, גורמי גדילה chondrogenic, וגז אל התאים, bioreactor המוצעים גירוי מכני. בסך הכל, הטכנולוגיה המגנטית נהגה להגביל תאי גזע, בשילוב עם התבגרות דינמית bioreactor, יכולה לשפר בידול chondrogenic ניכרה.

Protocol

1. בניית התקנים מגנטיים

הערה: המכשירים המשמשים זריעת תאים משתנים בהתאם ליישום (איור 1). כדי ליצור אגרגטים, מספר התאים מוגבל 2.5 × 10 ⁵ / המצרפי, כך העצות המגנטיות חייבות להיות דקות מאוד (750 מיקרומטר קוטר). כדי לזרוע את פיגומי 1.8 סנטימטר ^2/7-עבה מ"מ, המגנטים חייבים להיות גדולים יותר (3 מ"מ קוטר) ויבטיחו נדידת תאי הדרך הנקבובית של הפיגום.

1. בניית מכשיר עם-מגנטים מיקרו עבור היווצרות המצרפי (איור 1A)
   1. הפוך-חורים מיקרו עם מקדח 0.8 מ"מ באמצעות צלחות אלומיניום (3 ס"מ קוטר ו 6 מ"מ עובי).
   2. הכנס קצה מגנטי (750 מיקרומטר קוטר) לתוך כל חור של הצלחת.
   3. מניחים דיסק זה מעל מגנט ניאודימיום קבע, אשר מבטיח המגנטיזציה רוויה.
2. בניית מכשיר זריעת פיגום ( 1B איור)
   1. חותכים פוליסטירן קשה לתוך 2.4 ס"מ ² ריבועים.
   2. הכנס 9 מגנטים קטנים (3 מ"מ קוטר, 6 מ"מ ארוך) במרחק שווה על פני שטח של 1.6 ס"מ ^_2.
   3. מניחים את המכשיר על פני מגנט ניאודימיום קבע.

2. תיוג תא גזע

הערה: גזע תאים תויגו עם 0.1 מ"מ חלקיקים מגנטיים עבור 30 דק '(2.6 ± 0.2 pg ברזל / תא) כדי ליצור אגרגטים, תוך שהם תויגו עם 0.2 מ"מ חלקיקים מגנטיים עבור 30 דקות (5 ± 0.4 pg ברזל / תא) לזרע פיגומים. ריכוזי ננו-חלקיקים אלו פעמי דגירה שמשו בעבר ופורסם עבור MSC ותאים אחרים ^{18, 19,} וזה כבר נקבע כי חלקיקים השפיעו לא כדאי תא ולא יכולת בידול MSC. מסת הברזל המשולבת על ידי תאי הגזע נמדדה באמצעות יחיד CEll magnetophoresis ^{19, 20.}

1. תאי גזע ותרבות המזנכימה האנושי (MSC) במצע גידול תאי גזע mesenchymal שלם (MSCGM) בשעה 37 ° C ו 5% CO ₂ עד סמוך למפגש (~ 90%).
2. הכן את הפתרון תיוג מגנטי על ידי ערבוב 0.1 או 0.2 מ"מ מגהמיט תחמוצת ברזל מצופה ציטרט (γFe ₂ O _3; הליבה: 8 בקוטר ננומטר) במדיום 5A של סרום ללא מקוי שונה במכון ממוריאל פארק רוזוול (RMPI) ללא גלוטמין ו המכיל 5 נתרן ציטרט מ"מ.
3. מחק את המדיום, לשטוף את התאים עם המדיום RPMI סרום ללא ללא גלוטמין, ולהוסיף 10 מ"ל של תמיסת הננו-חלקיק תחמוצת ברזל לכל בקבוק תרבות 150 ס"מ ^2, נפח המינימלי הנדרש כדי לכסות את כל התאים.
4. דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO ₂ ואז להשליך את הפתרון ננו-חלקיקים. השרייה במשך 5 דקות עם סרום ללא בינוני RPMI ללא גלוטמין כדי להפנים את נאןoparticles עדיין מחוברת הממברנה.
5. מחק את המדיום RPMI ולהוסיף 25 מ"ל של מדיום MSCGM מלאה לכל בקבוק. דגירה לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO _2.

3. זריעת תאים מגנטית

1. טרי להכין את המדיום chondrogenic באמצעות בינוני הנשר Modified של Dulbecco (DMEM) גלוקוז גבוהה עם L- גלוטמין ידי הוספת 50 מיקרומטר L-אסקורבית חומצה 2-פוספט, 0.1 מיקרומטר dexamethasone, 1 מ"מ פירובט נתרן, 0.35 מ"מ L- פרולין, 1% התרבות האוניברסלית תוסף המכיל אינסולין, transferrin האנושי וחומצה selenous (ITS-Premix), ו 10 ng / mL 3 והפיכת צמיחה גורם-בטא (-β3 TGF).
2. לנתק את התאים מגנטי באמצעות 8 מ"ל של 0.05%-EDTA טריפסין לכל בקבוק תרבות 150 ס"מ ² ו צנטריפוגות התאים ניתק ב 260 × g עבור 5 דקות. לשאוב את המדיום ולספור את התאים מושעה מחדש.
3. מניחים בצלחת פטרי תרבית תאים תחתית זכוכית (35 מ"מ) על גבי שני המכשירים מגנטי.
4. מ'agnetically ליצור אגרגטים, להוסיף 3 מ"ל של מדיום chondrogenic אל צלחת פטרי להפקיד את נפח הקטן בעדינות האפשר (לא יותר מ 8 μL) המכיל 2.5 × 10 ⁵ תאים שכותרתו לכל המצרפי (עד 16 אגרגטים ניתן להפקיד). השאירו את צלחת פטרי במשך 20-30 דקות מבלי להזיז אותו, שמאפשר לו ליצור spheroids, ולאחר מכן למקם את המכשיר שלם, כולל צלחת פטרי המכילה את 16 אגרגטים, לתוך החממה ב 37 ° C ו 5% CO _2.
5. אגרגטים מלאה הטופס הבא באותו פרוטוקול ולהחליף המדיום להשלים עם בינוניות chondrogenic ללא TGF-β3.
   1. כדי ליצור את המבנה המצרפי 3D, למקם 2 אגרגטים במגע ביום 8 כדי ליצור 8 כפילויות וליזום ההיתוך. ביום 11, למזג 2 כפילויות כדי ליצור 4 רביעיות. לבסוף, פתיל 4 רביעיים ביום 15 כדי להשיג את המבנה הסופי.
   2. במקביל, ליצור אגרגטים על ידי צנטריפוגה 2.5 × 10 ⁵ שכותרתו בתאי גזע ב 26015; g עבור 5 דקות צינורות 15 מ"ל עם 1.5 מ"ל של מדיום chondrogenic עם או בלי TGF-β3 (עבור מדגם ובקרה, בהתאמה).
6. כדי מגנטי פיגומי זרע, למקם כל פיגום יבש לתוך צלחת פטרי. השתמש פיגומים פוליסכריד נקבוביים עשויים pullulan / dextran ^21. במשך כל פיגום, לדלל 2 × 10 ⁶ בתאי גזע שכותרתו 350 μL של המדיום chondrogenic ללא-β3 TGF ובזהירות פיפטה תאים על הפיגום.
   1. דגירה של 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר חדירה לתא מלא בתוך הפיגום ואז בעדינות להוסיף 3 מ"ל של מדיום chondrogenic עם או בלי-β3 TGF (עבור מדגם או מלאה, בהתאמה) על צלחת פטרי.
   2. דגירת גרדום cellularized במכשיר המגנטי שלה ב 37 ° C ו 5% CO ₂ עבור 4 ימים כדי לאפשר נדידת תאי הדרך הנקבובית פיגום הריתוק.
7. במקביל, זרע פיגומים עם 2 × 10 ⁶ תאי גזע שכותרתו באים באותה שיטת דגירה ללא המגנט להשיג פיגומי זרע אחיד שולטים חיובי.

בידול 4. אל chondrocytes

הערה: לאחר 4 ימים של דגירה, להסיר את המגנטים ולהמשיך הבשלת chondrogenic או בצלחת פטרי (תנאים סטטי) או בתוך bioreactor (תנאים דינמיים). דגימות בקרה שליליות התבגרו בתנאים סטטיים עם מדיום chondrogenic ללא-β3 TGF.

1. בתנאים סטטיים, לשמור על פיגומים או אגרגטים cellularized באותה צלחת פטרי. שינוי המדיום chondrogenic פעמים בשבוע במשך 21 ימים.
2. בתנאים דינאמיים, להכין את bioreactor.
   1. חותך צינורות סיליקון ב באורך המתאים על פי הפרוטוקול של היצרן.
   2. חיטוי כל החומרים: תא תרבות 500 מיליליטר, צינורות, מסובבי 2-דרך, ואת כלובים.
   3. מניחים את חלקי bioreactor לתוך microbio סטרילי תחנת בטיחות הגיונית. חבר את הצינורות אל מסובבי 2-way לתא ההתרבות בעקבות הוראות היצרן.
   4. להעביר בזהירות את הפיגומים cellularized לתוך כלובים מעוקר באמצעות מרית סטרילי. מניחים 2 פיגומים בכל כלוב. כאשר הכלובים מוכנים, להכניס אותם לתוך המחטים של המכסה כדי לשמור אותם לנוע במהלך סיבוב נוסף. ממלא את חדר התרבות עם מדיום chondrogenic ולסגור אותו עם המכסה המכיל את הכלובים.
3. הפעל את משאבת peristaltic למלא את הצינורות עם מדיום chondrogenic וכדי לחסל בועות אוויר.
4. מניח ולאבטח את הלילה המלאים לתוך המנוע של bioreactor ולהדליק את המחשב, אשר שולט סיבובים הן של הזרוע ובית הנבחרים.
5. החלת מהירות סיבוב של 5 סיבובים לדקה (סל"ד) משתי הזרוע ובית הנבחרים. כוון את המשאבה peristaltic בקצב זרימה של 10 סל"ד עבור האכלה רציפה של הפיגומים cellularized.

התחת = "jove_title"> 5. הפקת רנ"א ניתוח ביטוי גנים

הערה: לפני מיצוי RNA, לעכל את הפיגומים עם פתרון אנזימטי.

1. הכן 1 מ"ל של פתרון אנזימטי על ידי הוספת 100 μL של pullulanase (40 U / mL) ו 50 μL של dextranase (60 מ"ג / מ"ל) כדי 850 מ"ל של מדיום סרום ללא DMEM.
2. יש לשטוף את הפיגומים פעמיים עם מדיום סרום ללא DMEM, להשליך את המדיום, ולהוסיף 800 μL של פתרון אנזימטי לכל הגרדום. דגירה של 15-30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת תסיסה עדינה.
3. כאשר הפיגום נמס לגמרי, להעביר את פתרון המכיל את התאים לצינור 1.5 מ"ל, צנטריפוגות ב g 300 × עבור 10 דקות, בזהירות לשאוב את המדיום, לשטוף פעמיים עם סטרילי 1 × פוספט שנאגרו מלוחים (PBS), צנטריפוגות ב 300 × g עבור 10 דקות, מחדש להשעות את התאים בתמיסת בידוד RNA.
4. כדי לחלץ את RNA מן אגרגטים, למקם הספרואידים בפתרון בידוד RNA ולחלוטין למחוץ אותם באמצעות homogenizer לפני ביצוע חילוץ RNA.
5. לבודד את RNA באמצעות ערכה להפקת RNA הכוללת על פי הוראות היצרן.
6. לסנתז DNA משלים מ 400 ננוגרם של רנ"א הכל באמצעות transcriptase הפוכה על פי הוראות היצרן, באמצעות 250-ng פריימרים אקראיים, 1 μL של תמהיל dNTP (10 מ"מ כל אחד), ו 40 U / mL RNase מעכב; היקף התגובה הסופי הוא 20 μL. בסוף התגובה, להוסיף 80 μL של מים מזוקקים להשיג נפח סופי של 100 μL.
7. לקבלת תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים (PCR), להשתמש בשילוב PCR המכיל ריאגנט פלורסנט לכמת את הביטוי היחסי של הגנים של עניין, כגון aggrecan (AGC) וקולגן השנייה (Col II), עם 10 × cDNA מדולל. לנרמל את רמות של ביטוי גנים עם חלבון ריבוזומלי גן התייחסות, גדול, P0 (RPLP0). בצע את החישובים עם 2 ^- נוסחא ^ΔΔCT, שבו ΔΔCT = ΔCT של מצב מובחן - אומר ΔCT של מצב מלא, וכל ΔCT מייצג את CT של הגן של עניין - CT של גן ההתייחסות (RPLP0).
8. לקבוע מדידות סטטיסטיות כמו ערכים ממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM). לבצע את הניתוח עם ניסויים עצמאיים 2 n ≥. השתמש מבחן t לנתח את ההבדלים הסטטיסטיים בין כדורי centrifuged ו בשילובים מגנטיים (* p <0.05). לקבוע את המשמעות עם מבחן Kruskal-Wallis (פרמטרית חד סטרית ANOVA) לנתח הבדלים סטטיסטיים בין פיגומים מבודלים עם הפיגום המלא (* p <0.05).

6. ניתוח היסטולוגית

1. יש לשטוף את הפיגומים או אגרגטים cellularized עם 1 סטרילי × PBS, ולתקן אותן בתמיסת פורמלין 10% עבור 1 שעות בטמפרטורת חדר, ולשטוף עם 1 × PBS.
2. הסר את PBS, להטביע את הדגימות עוקצות אופטימליהטמפרטורה מתחם G (אוקטובר), ולהקפיא אותם באמבט איזופנטאן שקוע חנקן נוזלי. חנות המדגם ב -20 מעלות צלזיוס. חותך את הדגימות עם cryostat להשיג cryosections 8-מיקרומטר ליחידות או 12 מיקרומטר עבור פיגומי cellularized.
3. הכתם cryosections עם פתרון toluidine כחול 0.5% עבור 2 דקות, לשטוף במי ברז, מייבשים עם 100% אתנול, להבהיר באמצעות טולואן, ולעגן את השקופיות עם הרכבה בינונית עבור מיקרוסקופ אור.

תוצאות

ראשית, אגרגטים יכול להיווצר בנפרד באמצעות מיקרו-מגנטים על ידי הפקדת 2.5 × 10 ⁵ תאי גזע שכותרתו (איור 2 א). אגרגטים יחידים אלה (~ 0.8 מ"מ גודל) לאחר מכן ניתן התמזגו לתוך בזכות מבנים גדולים כדי היתוך רציף, מושרה מגנטי. למשל, ביום 8 של התבגרות chond...

Discussion

ראשית, בגלל הטכניקות שהוצגו כאן מסתמכים על ההפנמה של חלקיקים מגנטיים, נושא חשוב אחד הוא תוצאה של חלקיקים ברגע שהם למקם בתוך התאים. נכון חלקיקי ברזל עלולים לגרום לרעילויות פוטנציאל או יכולת בידול לקויה תלוי בגודל, הציפוי שלהם, וזמן חשיפה ^19,

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3)	PHENIX - University Paris 6	Made and given by C. Ménager	Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge
Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds	LIOAD - University Nantes	Made and given by C. Le Visage	Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2.
TisXell Regeneration System	QuinXell Technologies	QX900-002	Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber
Cage for scaffolds: Histosette II M492	VWR	720-0909
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501	Three independant batches have been used
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL)	Life Technologies	15140-122
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
Sodium pyruvate solution 100 mM	Sigma	S8636
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C
TGF-beta 3 protein 10 µg	Interchim	30R-AT028
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus	Sigma	P2986
Dextranase from Chaetomium erraticum	Sigma	D0443
NucleoSpin RNA Extraction Kit	Macherey-Nagel	740955.5
SuperScript II Reverse Transcriptase	Life Technologies	18064-014
Random Primer - Hexamer	Promega	C1181	500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample
Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor	Promega	N2511	40 U/µL: put 1 µL per sample
PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each)	Roche	10842321
SyBr Green PCR Master Mix	Life Technologies	4368708
Step One Plus Real-Time PCR System	Life Technologies	4381792
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
OCT solution	VWR	361603E
Isopentane	Sigma	M32631
Toluidine blue O	VWR	1.15930.0025
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Toluene	VWR	1.08323.1000
Mounting medium Pertex	Histolab	840
RPLP0 Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'
Aggrecan Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'
Collagen II Primer for qPCR	Eurogentec		5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'