JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מפרטים את השיטה של S equen של P סורלן crosslinked, L igated, ו S נבחר H ybrids (SPLASH), אשר מאפשר מיפוי גנום רחב של interramolecular ו intermolecular RNA-RNA אינטראקציות in vivo . SPLASH ניתן ליישם את המחקר RNA אינטראקציות של אורגניזמים כולל שמרים, חיידקים ובני אדם.

Abstract

לדעת איך RNAs אינטראקציה עם עצמם ועם אחרים היא המפתח להבנת RNA הרגולציה הגן בתא. בעוד דוגמאות של אינטראקציות RNA-RNA כגון אינטראקציות microRNA-mRNA הוכחו כדי להסדיר ביטוי גנים, את מלוא היקף שבו אינטראקציות RNA להתרחש בתא עדיין לא ידוע. שיטות קודמות כדי לחקור אינטראקציות RNA התמקדו בעיקר על תת קבוצות של RNAs כי הם אינטראקציה עם חלבון מסוים או מינים RNA. כאן, אנו מפרטים שיטה בשם S equencing של P סורלן crosslinked, L igated, ו S נבחר H ybrids (SPLASH) המאפשר לכידת גנום רחב של אינטראקציות רנ"א in vivo בצורה משוחדת. SPLASH מנצל ב crosslinking vivo , קשירת הקרבה, רצף התפוקה גבוהה לזהות intramolecular ו intermolecular RNA בסיס זוגות שותפים ברחבי העולם. SPLASH ניתן ליישם אורגניזמים שונים, כולל חיידקים, שמרים ותאי אדם, כמו גםS תנאים מגוונים הסלולר כדי להקל על ההבנה של הדינמיקה של ארגון רנ"א תחת הקשרים הסלולר מגוונים. כל פרוטוקול SPLASH ניסיוני לוקח בערך 5 ימים כדי להשלים את העבודה חישובית לוקח בערך 7 ימים כדי להשלים.

Introduction

ללמוד כיצד מקרומולקולות לקפל וליצור אינטראקציה זה עם זה הוא המפתח להבנת רגולציה גנטית בתא. בעוד שמאמצים רבים התמקדו בעשור האחרון בהבנת האופן שבו דנ"א וחלבונים תורמים לרגולציה גנטית, ידוע פחות פחות על תקנה פוסט-תעתיקית של ביטוי גנים. RNA נושאת מידע הן ברצף הליניארי שלה והן במבנה המשני שלה ושלישוני 1 . היכולת שלה בסיס זוג עם עצמו ועם אחרים חשוב לתפקידה in vivo . ההתקדמות האחרונה בתפוקה גבוהה RNA מבנה משני בדיקה חיישן סיפק תובנות ערך למיקומים של אזורים בודדים כפול בודד transcriptome 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , Howeמידע על השותפים לאינטראקציה של זוגות עדיין חסר במידה רבה. כדי לקבוע איזה רצף RNA הוא אינטראקציה עם אזור RNA אחר transcriptome, אנחנו צריכים מידע גלובלי זוג חכם.

מיפוי זוגי אינטראקציות RNA חכם באופן גלובלי, ללא דעות מוקדמות באופן מסורתי היה אתגר גדול. בעוד גישות קודמות, כגון CLASH 9 , hiCLIP 10 ו RAP 11 , משמשות לזיהוי אינטראקציות רנ"א בקנה מידה גדול, טכניקות אלה בדרך כלל מפתבות צימוד בסיס RNA עבור קבוצת משנה של RNAs או אינטראקציה עם חלבון מסוים או מינים RNA. ההתפתחויות האחרונות בחקר אינטראקציות RNA העולמי כוללים את השיטה RPL 12 , אשר אינו מייצב אינטראקציות RNA in vivo ולכן יכול רק ללכוד תת קבוצה של אינטראקציות vivo . כדי להתגבר על האתגרים הללו, אנו ואחרים פיתחנו אסטרטגיות גנומיות רחבות ובלתי מוטותP רנ"א אינטראקציה ב vivo , באמצעות גרסאות שונה של crosslinker psoralen 13 , 14 , 15 . בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הפרטים עבור ביצוע S S השוואות של Sorsen crosslinked, L igated, ו S נבחר H ybrids (SPLASH), אשר מנצל psoralen biotinylated כדי crosslink בסיס זיווג RNAs ב vivo , ואחריו קשירת הקרבה ותפוקה גבוהה התפוקה כדי לזהות RNA בסיס זיווג שותפים גנום רחב ( איור 1 ) 15 .

בכתב יד זה, אנו מתארים את השלבים לביצוע SPLASH באמצעות תאים חסיד תרבותי, במקרה זה תאים הלה. פרוטוקול זהה ניתן להתאים בקלות תאים יונקים ההשעיה כדי שמרים תאים חיידקים. בקצרה, תאים Hella מטופלים עם psoralen biotinylated ו מוקרן ב 365 ננומטר כדי crosslink אינטראקציות RNA זוגות זוג in vivo. RNAs מחולצים מכן מן התאים, מקוטע מועשר על אזורים crosslinking באמצעות חרוזים streptavidin. אינטראקציה שברי RNA אז ligated יחד באמצעות קשירת הקרבה והפך לספריית cDNA עבור רצף עמוק. על רצף, RNAs chimeric ממופים על transcriptome / הגנום כדי לזהות את אזורי RNA אינטראקציה מותאמים זה לזה. יש לנו בהצלחה לנצל SPLASH לזהות אלפי אינטראקציות רנ"א in vivo בשמרים ותאים אנושיים שונים, כולל intramolecular ו intermolecular RNA בסיס צימוד בשיעורים שונים של RNAs, כגון snoRNAs, lncRNAs ו mRNAs, להציץ לתוך הארגון המבני דפוסי אינטראקציה של RNAs בתא.

Protocol

1. טיפול בתאים Hella עם Psoralen Psoralen Biotinated ו RNA

  1. התרבות תאים Hella ב Dulbecco שונה של הנשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין סטרפטומיצין (PS) בצלחת 10 ס"מ.
  2. לשטוף את התאים הלה פעמיים עם 5 מ"ל של 1x PBS. מסננים עודף PBS לחלוטין מן המנה על ידי הנחת צלחת אנכית במשך 1 דקות.
  3. הוסף 1 מ"ל של PBS המכיל 200 מיקרומטר של psoralen biotinylated ו 0.01% w / v digitonin, לתאים באופן אחיד ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. בעוד psoralen biotinylated יכול להזין את התא, החדירות שלו הוא הרבה יותר גבוה כאשר התאים חשופים כמויות נמוכות של digitonin (0.01%) במשך 5 דקות
  4. הסר את המכסה של צלחת 10 ס"מ המכיל את התאים HeLa מטופלים ומניחים את צלחת שטוחה על הקרח. מסננים את התבנית המכילה את התאים עם UV 365 ננומטר במשך 20 דקות על הקרח, במרחק של 3 ס"מ מן נורות UV, באמצעות crosslinker UV.
  5. בידוד tRNA otal מ תאים Hella על ידי guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform החילוץ בעקבות פרוטוקול של היצרן. הוסף 1: 1 נפח של isopropanol לזרז את הרנ"א בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    השהה נקודה: RNA ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס ב isopropanol ללא הגבלת זמן. נקודה כתם יכול להתבצע בשלב זה כדי לבדוק כי psoralen biotinylated בהצלחה נכנסו לתאים ויש לו crosslinked RNAs ב vivo ( איור 2 ).
  6. צנטריפוגה RNA זירז ב XG 20,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C כדי לשחזר את רנ"א. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של אתנול קר 70% כדי רנ"א גלולה לשטוף את רנ"א.
  7. צנטריפוגה דגימות ב XG 20,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ואוויר יבש את גלולה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. הוסף מים nuclease חינם לגלולה RNA ו לכמת את הריכוז של RNA באמצעות ספקטרומטר UV.
    השהה נקודה: RNA ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס לאחר Fמקפיא חנקן נוזלי.

2. פיצול רנ"א

  1. מחממים 15 μL של חיץ פירוק 2x RNA ו 10 μL של מדגם RNA (1 מיקרוגרם / μL) בנפרד צינורות 0.2 מ"ל PCR, ב 95 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות. מערבבים 10 μL של חיץ מחומם 2x RNA חיץ עם 10 מדגם RNA μL ידי pipetting למעלה ולמטה. דגירה המדגם על 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. עצור את התגובה על ידי הצמד לקרר את התגובה על הקרח.
  2. העברה ובריכה את התגובות 2 פיצול לצינור microfuge 1.5 מ"ל. הוסף 40 μL של מים nuclease חינם לתגובה, 10 μL של 3 M אצטט נתרן, 1 μL של גליקוגן ו 300 μL של אתנול 100% לתגובה פיצול. דגירה של רנ"א ב -20 מעלות צלזיוס למשך לפחות 1 שעות כדי להאיץ את רנ"א.
  3. צנטריפוגה RNA זירז ב XG 20,000 במשך 30 דקות, להסיר את supernatant ולשטוף את רנ"א באמצעות 1 מ"ל של אתנול 70%.
  4. צנטריפוגה רנ"א ב 20,000 xg במשך 15 דקות, remOve supernatant ו לפזר את רנ"א 20 μL של מים חינם nuclease.

3. בחירה גודל RNA ו elution

  1. הוסף 20 μL של צבע RNA טעינה כדי RNA התאושש בצינור microfuge. מחממים את RNA עם צבע RNA טעינה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ומניחים אותו על הקרח במשך 2 דקות.
  2. הוסף 3 μL של צבע RNA טוען μL 0.25 של סולם 10 DNA DNA בצינור microfuge. מחממים את הסולם על 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ומניחים אותו על הקרח במשך 2 דקות.
  3. טען את הסולם denatured ודגימות על גבי 8.6 ס"מ x 6.8 ס"מ 6% TBE ג'ל אוריאה ואת גודל הפיצול על ידי אלקטרופורזה במשך 40 דקות ב 180 V. הכתם הג'ל ב 10 מ"ל של חיץ TBE המכיל 1: 10,000 של ג'ל חומצה גרעין כתם עבור 5 דקות בחושך.
  4. לנקב צינור נקי 0.6 מ"ל microfuge בתחתית באמצעות מחט G 24 ומניחים אותו בצינור 2 microfuge מ"ל.
  5. דמיינו את להקות על ג'ל פוסט מוכתם באמצעות transilluminator לחתוך פרוסה ג'ל המתאים 90-110 nt. מעבירים את פרוסת ג'ל לתוך צינור ניקוד microfuge 0.6 מ"ל בצינור microfuge 2 מ"ל. בחירת גודל זה מבוצעת על מנת לאפשר את שברי chimeric יש אורך מינימלי כדי למפות את transcriptome ולהבחין בין מוצרים ligated הקרבה לעומת מוצרים לא מסודרים במדרגות הבחירה במורד הזרם.
  6. צנטריפוגה פרוסות ג'ל ב XG 12,000 בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות לגרוס את פרוסת ג'ל ולאסוף אותו בצינור microfuge 2 מ"ל. מחק את צינור ריק 0.6 מ"ל microfuge. הוסף 700 μL של חיץ elution על פרוסת ג'ל shredded בצינור microfuge 2 מ"ל ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך הלילה עם סיבוב קבוע, כדי לאפשר דיפוזיה של דגימות למאגר.
  7. מעבירים את פרוסות ג'ל ואת חיץ elution כדי צנטריפוגה מסנן צינור צנטריפוגות ב XG 20,000 במשך 2 דקות. פרוסות הג'ל יילכדו בתא העליון של המסנן. מחק את פרוסות הג 'ל ואת התא העליון.
  8. הוסף 1 μL של גליקוגן ו 700 μL של isopropanol 100% לתסנין בצינור microfuge ו להאיץ את RNA ב -20 מעלות צלזיוס למשך לפחות 1 שעות או לילה.
    השהה נקודה: RNA יכול להיות זירז ב isopropanol ללא הגבלת ב -20 מעלות צלזיוס.
  9. צנטריפוגה RNA זירז ב XG 20,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C כדי לשחזר את רנ"א. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של 70% אתנול קר לשטוף את גלולה RNA. צנטריפוגה גלולה שטף ב XG 20,000 במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  10. הסר את החיץ לשטוף ולהוסיף 20 μL של מים nuclease חינם resuspend RNA. לכמת את הריכוז של רנ"א באמצעות ספקטרומטר UV.
    השהה נקודה: RNA ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס לאחר הקפאת פלאש בחנקן נוזלי.

4. העשרת RNA אזורים crosslinking

  1. וורטקס streptavidin מצופה חרוזים מגנטיים במרץ כדי resuspend חרוזים homogenously בצינור. העברת 100 μL של חרוזים לצינור 1.5 microfuge מ"ל ומניחים אותו על מגנטמעמד IC דקות 1 כדי לאפשר את החרוזים לדבוק בצד המגנטי של הצינור. הסר את המאגר אחסון מן החרוזים בזהירות לקחת את הצינור מתוך מעמד מגנט.
  2. הוסף מאגר 1 תמוגה מ"ל לחרוזים בצינור microfuge ופיפטה למעלה ולמטה. מניחים את microfuge המכיל חרוזים על מעמד מגנטי עבור 1 דקות להפריד את החרוזים מן החיץ לשטוף. חזור על זה עבור סך של 3 שוטף.
  3. הסר את חיץ לשטוף מן החרוזים על ידי הצבת חרוזים microfuge המכילים על מעמד מגנטי במשך 1 דקות. הוסף מעכב RNase (1: 200) למאגר תמוגה ולהוסיף 100 μL של חיץ תמוגה כדי חרוזים שטף בצינור microfuge.
  4. הוסף 2 מ"ל של חיץ הכלאה שהוכן טרי, 1 מ"ל של חיץ תמוגה בתוספת, 1.5 מיקרוגרם של RNA Rractated בגודל ו 100 μL של חרוזים resuspended לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל חרוטי. וורטקס הצינור בעדינות.
  5. דגירה צינור צנטריפוגה 15 מ"ל חרוטי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם סיבוב סוף לסיבוב.טרום לחמם את החיץ לשטוף ב 37 מעלות צלזיוס.
  6. מניחים את צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל חרוטי על מעמד מגנטי עבור צינורות 15 מ"ל במשך 2 דקות להפריד את החרוזים מן המאגר. פיפטה את המאגר בזהירות מתוך הצינור וזורקים אותו.
  7. הוסף 1 מ"ל של חיץ לשטוף מראש חימם את חרוזים, פיפטה למעלה ולמטה ולהעביר את החרוזים לצינור microfuge 1.5 מ"ל. לדגור על חרוזים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, עם סיבוב סוף הסיום.
  8. צנטריפוגות בקצרה את התוכן של הצינור microfuge. מניחים את החרוזים 1.5 מ"ל שטף צינורות microfuge על מעמד מגנטי עבור צינורות 2 מ"ל במשך 1 דקות, להפריד את החרוזים מן החיץ לשטוף. הסר את המאגר מן החרוזים על ידי pipetting בעדינות את המאגר מתוך הצינור microfuge.
  9. הוסף 1 מ"ל של חיץ לשטוף מראש לחימום חרוזים פיפטה למעלה ולמטה לחזור על לשטוף. לבצע סך של 5 שוטף. בסוף לשטוף 5, להסיר את חיץ לשטוף ידי הצבת microfuge המכילים חרוזים על מגנט לעמוד עבורדקה 1.

5. קשירת קשירת

  1. הוסף 1 מ"ל של חיץ k4ase polynucleotide T4 קר (PNK) חיץ כדי חרוזים שטף דגירה חרוזים במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, עם סיבוב הסיום. מניחים את הצינור microfuge המכיל את החרוזים על רצועת מגנטי במשך 1 דקות בעדינות להסיר את המאגר PN4 TK. חזור על שלב זה עבור סך של 2 שוטף ולהסיר את חיץ PNK T4 לאחר לשטוף האחרון.
  2. הוסף חוצצים לחרוזים, לפי טבלה 1 . כדי לאפשר את הקצוות 3 'של קטע רנ"א להיות ligated ל 3' מתאמים להלן, דגירה החרוזים במאגר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות עם תסיסה מתמדת להמיר את 3 "מחזורי פוספט הקבוצה בסוף RNA כדי 3 'אה.
  3. הוסף למאגרים את התגובה הקודמת, לפי טבלה 2 . כדי לאפשר את הקצה 5 'של שברי רנ"א להיות קשירת המוסמכת, דגירה התגובה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות עם תסיסה מתמדת בנוכחות ATP, כדי להמיר 5 'OH על רנ"א כדי 5' פוספט.
  4. הוסף חיץ לתגובה הקודמת לביצוע קשירת הקרבה, על פי טבלה 3 . דגירה התגובה ב 16 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות, עם תסיסה מתמדת,
  5. מניחים את microfuge המכיל את הרנ"א ligated על מעמד מגנט במשך 1 דקות. הסר את supernatant בזהירות ולהוסיף 1 מ"ל של טמפרטורת החדר לשטוף טמפרטורה החרוזים. Resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה.
  6. מניחים את הצינור microfuge על מגנט לעמוד דקות 1 ולהסיר את החיץ לשטוף בזהירות. לבצע סך של 2 שוטף, ולהסיר את חיץ לשטוף מן חרוזים בסוף לשטוף את השני.
  7. הוסף 100 μL של חיץ PK RNA כדי חרוזים resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה. מחממים את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על בלוק חום.
  8. צינת המדגם על הקרח דקות 1 ולהוסיף 500 μL של guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform למדגם. מערבבים על ידי vortexing במרץ עבור 10 s. דגירה mixtuמחדש בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    השהה נקודה: RNA ניתן לאחסן guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.
  9. הוסף 100 μL של כלורופורם כדי guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform חילוץ דגימות. וורטקס במרץ עבור 10 s. צנטריפוגה דגימות ב XG 20,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C.
  10. העברת 400 μL של השכבה מימית צינור חדש 1.5 מ"ל microfuge. הוסף 800 μL (2 כרכים) של אתנול 100% ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
  11. מעבירים את הפתרון RNA לעמודי ניקוי RNA ולשחזר את ההוראות הבאות של היצרן רנ"א, להבטיח כי גם RNAs קטנים נשמרים. Elute RNA ב μL 100 של מים ללא nuclease.
    השהה נקודה: RNA ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס לאחר הקפאת פלאש בחנקן נוזלי.

6. היפוך crosslinking של Psoralen Biotinylated

  1. מעבירים את μL 100 של דגימות eluted לתוך באר של 24 גםאכלתי. הסר את המכסה להקרין את המדגם תחת 254 ננומטר UV, במשך 5 דקות על הקרח.
  2. מעבירים את המדגם crosslinked הפוך לצינור microfuge נקי. הוסף 10 μL של אצטט נתרן, 1 μL של גליקוגן ו 300 μL של אתנול 100% ו להאיץ את RNA ב -20 מעלות צלזיוס למשך לפחות 1 שעות או לילה.
    השהה נקודה: RNA יכול להיות זירז אתנול ללא הגבלת ב -20 מעלות צלזיוס.
  3. צנטריפוגה RNA זירז ב XG 20,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C כדי לשחזר את רנ"א. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של 70% אתנול קר לשטוף את גלולה RNA.
  4. צנטריפוגה גלולה שטף ב XG 20,000 במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את חיץ לשטוף ולהוסיף 4.25 μL של מים nuclease חינם resuspend RNA. מעבירים את RNA לצינור 0.2 מ"ל PCR.
    השהה נקודה: RNA ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס לאחר הקפאת פלאש בחנקן נוזלי.

7. הפוך שעתוק ו cDNA Circularization

  1. הוסף 0.75 μLשל מקשר RNA (0.5 מיקרוגרם / μL) למדגם resuspended ב צינור PCR וחום על 80 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. מניחים את המדגם על הקרח במשך 2 דקות.
  2. הוסף את המאגרים למדגם מפוגל עבור קשירת 3 מתאם, על פי טבלה 4 . דגירה התגובה ב 25 מעלות צלזיוס למשך 2.5 שעות.
  3. מעבירים את התגובה לצינור microfuge 1.5 מ"ל. הוסף 90 μL של מים nuclease חינם לתגובה, ואחריו μL 10 של אצטט נתרן, 1 μL של גליקוגן ו 300 μL של אתנול 100%. להאיץ את רנ"א ב -20 מעלות צלזיוס למשך לפחות 1 שעות או לילה.
    השהה נקודה: RNA יכול להיות זירז אתנול ללא הגבלת ב -20 מעלות צלזיוס.
  4. צנטריפוגה RNA זירז ב XG 20,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C כדי לשחזר את רנ"א. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של 70% אתנול קר לשטוף את גלולה RNA.
  5. צנטריפוגה גלולה שטף ב 20,000 גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את החיץ לשטוף resuspend גלולה μL 5 של nuclease חינם WAter.
  6. הוסף 5 μL של צבע RNA טעינה כדי RNA התאושש בצינור microfuge. מחממים את RNA עם צבע RNA טעינה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ומניחים אותו על הקרח במשך 2 דקות.
  7. הוסף 3 μL של צבע RNA טוען μL 0.25 של סולם 10 DNA DNA בצינור microfuge. מחממים את הסולם על 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ומניחים אותו על הקרח במשך 2 דקות.
  8. ביצוע החלוקה גודל באמצעות 8.6 ס"מ x 6.8 ס"מ 6% TBE אוריאה ג'ל כמו בשלבים 3.3 ו -3.4.
  9. דמיינו את הג 'ל מוכתם כתם חומצה גרעין באמצעות transilluminator וחותכים פרוסה ג'ל המתאים 110-140 nt על הסולם. מעבירים את פרוסת ג'ל לתוך צינור microctuge 0.6 מ"מ microfuge בצינור microfuge 2 מ"ל ופעל בפרוטוקול מ 3.6-3.9.
  10. הוסף 5 μL של מים nuclease חינם resuspend גלולה RNA. מעבירים את RNA לצינור 0.2 מ"ל PCR.
    השהה נקודה: RNA ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס לאחר הקפאת פלאש בחנקן נוזלי.
  11. הוסף 1 μL של תחל RT ב 1.2581, M כדי RNA ב צינור PCR וחום על 80 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. מניחים את המדגם על הקרח במשך 2 דקות.
  12. הוסף את המאגרים לתעתיק הפוך בהתאם לטבלה 5 . לדגור את התגובה ב 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  13. הוסף 1.1 μL של 1 NaOH N לתגובה וחום ב 98 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. מניחים את התגובה על הקרח.
  14. מעבירים את התגובה לצינור microfuge 1.5 מ"ל. הוסף 90 μL של מים nuclease חינם לתגובה, ואחריו μL 10 של אצטט נתרן, 1 μL של גליקוגן ו 300 μL של אתנול 100%. להאיץ את ה- DNA ב -20 מעלות צלזיוס למשך לפחות 1 או לילה.
    השהה נקודה: ה- DNA יכול להיות זירז אתנול ללא הגבלת ב -20 מעלות צלזיוס.
  15. צנטריפוגות ה- DNA זירז ב 20,000 גרם למשך 30 דקות ב 4 ° C כדי לשחזר את ה- DNA. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של 70% אתנול קר לשטוף את גלולה דנ"א. צנטריפוגה גלולה שטף ב XG 20,000 במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את לשטוף את הכביסה resuspend pelלתת 5 μL של מים חינם nuclease.
  16. ביצוע החלוקה גודל באמצעות 8.6 ס"מ x 6.8 ס"מ 6% TBE אוריאה ג'ל כמו בשלבים 3.3 ו -3.4.
  17. דמיינו את הג 'ל פוסט מוכתם באמצעות transilluminator לחתוך פרוסה ג'ל המתאים 200-240 nt על הסולם. הפוך transcribed cDNA עכשיו 96 בסיסים יותר מאשר קטע RNA בשל תוספת של 96 בסיס RT תחל. מעבירים את פרוסת ג'ל לתוך צינור ניקוד microfuge 0.6 מ"ל בצינור microfuge 2 מ"ל.
  18. צנטריפוגה פרוסות ג'ל ב XG 12,000 בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות לגרוס את פרוסת ג'ל ולאסוף אותו בצינור microfuge 2 מ"ל. מחק את צינור ריק 0.6 מ"ל microfuge.
  19. הוסף 700 μL של חיץ elution על פרוסת ג'ל shredded בצינור 2 microfuge מ"ל ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות עם סיבוב קבוע. בצע את הפרוטוקול כפי שמתואר בשלבים 3.7-8.8.
  20. הוסף 6 μL של מים nuclease חינם resuspend גלולה דנ"א. מעבירים את ה- DNA צינור 0.2 מ"ל PCR.
    נקודת השהיה: DNA יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס לאחר הקפאה פלאש בחנקן נוזלי.
  21. הוסף את המאגרים לתגובה עבור מעגלי cDNA, על פי טבלה 6 . לדגור את התגובה ב 60 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות וחום על 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להשבית את התגובה.
  22. מעבירים את התגובה לצינור microfuge 1.5 מ"ל. לטהר את cDNA מעגלית באמצעות עמודה ניקוי DNA בעקבות הוראות היצרן. הוסף 20 μL של מים nuclease חינם לעמוד כדי elute מטוהרים cDNA.
    השהה נקודה: DNA יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.

8. הגברה PCR (קנה מידה קטן PCR)

  1. הוסף את המאגרים לתגובה על פי טבלה 7 עבור הגברה PCR לבדוק את מספר מינימלי של מחזורים צריך הגברה הספריה.
  2. הגדר את תנאי רכיבה על PCR על פי לוח 8 . להשהות את התגובה ולהעביר 5 μL שלהתגובה PCR ב 10, 15 ו - 20 מחזורים, לתוך צינורות נפרדים 1.5 מ"ל microfuge.
  3. הוסף 1 μL של 6x DNA ג'ל טוען צבע לכל אחד 5 תגובה μL PCR במחזורים שונים. בצע ג'ל אלקטרופורזה על ג'ל agarose 3%, ב 120 V, במשך שעה 1 לדמיין את מוצרי ה- PCR.
    1. השתמש במספר הנמוך ביותר של מחזורי PCR (Y) המציגים הגברה בסביבות 250 בסיסים ( באיור 3 , יש להקה חזקה ב 15 מחזורים של הגברה ו הלהקה חלש ב 10 מחזורים 12. 12 מחזורים של הגברה PCR בקנה מידה גדול צפוי ליצור מספיק חומר עבור רצף עמוק כמו כמות cDNA בשימוש הוא 10 פעמים כי הגברה PCR בקנה מידה קטן).

9. הגברה PCR (בקנה מידה גדול PCR) וטיהור

  1. הוסף את המאגרים לתגובה על פי טבלה 9 עבור הגברה PCR עבור PCR בקנה מידה גדול.
  2. הגדר את תנאי רכיבה על אופניים PCR על פילוח 10 .
  3. הוסף 5 μL של 6x דנ"א ג'ל טעינת צבע μL 25 של תגובה PCR לטעון לתוך באר של ג'ל agarose 3%. טען 1 קילו פלוס סולם DNA לתוך באר נפרד. בצע ג'ל אלקטרופורזה ב 100 V, עבור 1.5 שעות.
  4. דמיינו את הג'ל השלם באמצעות Transilluminator UV.
  5. גודל לחלץ פרוסה ג'ל המכיל מוצרים PCR מ 200-300 בסיסים ולהעביר את הג'ל לצינור נקי 2 microfuge מ"ל.
  6. הוסף 1 מ"ל של חיץ מסיסות ג'ל, מתוך ערכת ג'ל דנ"א החילוץ, כדי פרוסת ג'ל ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, או עד הג 'ל מתמוסס, עם תסיסה מתמדת.
  7. הוסף 200 μL של isopropanol על ג 'ל מומס ומערבבים היטב על ידי pipetting. העברת 700 μL של המדגם למוצר ג 'ל DNA מיצוי ניקוי עמודה צנטריפוגה ב XG 13,000 במשך 30 שניות. שמור את העברת המדגם מומס לעמודה עד כל המדגם נטען על העמודה.
  8. הוסף 500 μL חיץ המסיסות ג'ל,ואחריו 700 μL של חיץ לשטוף עמודה, לעמודה, על פי פרוטוקול של היצרן. הוסף 12 μL של מים nuclease חינם למרכז הטור כדי לחמוק DNA. השהה נקודה: DNA יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
  9. לכמת את הריכוז של ה- DNA באמצעות כימות fluorometric. אם ספריות מרובות נבנות ומאוחדות יחד עבור רצף, מוסיפים כמות שווה של כל דגימה לבריכה, עבור סידור תפוקה גבוהה.

תוצאות

איור 1 מתאר את הסכימה של זרימת העבודה SPLASH. על תוספת של psoralen biotinylated בנוכחות 0.01% digitonin, ו crosslinking UV, RNA סך מופק מהתאים ואת כתם נקודה מבוצעת על מנת להבטיח crosslinking של biotinylated כדי RNA קרה ביעילות ( איור 2 ). אנו משתמשים biiginylated בסיס או...

Discussion

כאן, אנו מתארים בפירוט את זרימת עבודה ניסיונית וחישובית עבור SPLASH, שיטה המאפשרת לנו לזהות אינטראקציות RNA חכם חכמים בצורה גנום רחב. אנו ניצלו בהצלחה SPLASH בתרבית חיידקים, שמרים ותרבויות האדם צופים כי האסטרטגיה יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על אורגניזמים שונים תחת מדינות ...

Disclosures

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

אנו מודים לחברי המעבדה וואן ומעבדת Nagarajan לדיונים אינפורמטיביים. N.Nagarajan נתמך על ידי מימון מ * כוכב. Y.Wan נתמך על ידי מימון מ- A * סטאר וחברה במדע- Branco Weiss Fellowship.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb Plus DNA LadderLife Technologies Holdings Pte Ltd10787026DNA ladder
10 bp DNA ladderLife Technologies Holdings Pte Ltd10821-015DNA ladder
20% SDS solutionFirst BASEBUF-2052-1L  
20x SSCFirst BASEBUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate SolutionFirst BASEBUF-1151-1L-pH5.2  Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1Bio-Rad1610145TBE Urea gel component
Ambion Buffer KitLife Technologies Holdings Pte LtdAM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade  PromegaV3131 TBE Urea gel component
Bromophenol BlueSigma-AldrichB0126-25G
ChloroformMerck1.02445.1000RNA extraction
Single strand DNA ligaseEpicentreCL9025KCircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filtersSigma-AldrichCLS8160-96EACostar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINESigma-AldrichD5628-1GFor cell treatment
Dark Reader Transilluminator Clare Chemical ResearchDark Reader DR89X TransilluminatorBlue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6x)Life Technologies Holdings Pte LtdR0611Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle MediumPan BioTechP04-03500For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beadsLife Technologies Holdings Pte Ltd65002Dynabeads MyOne Streptavidin C1 
Magnetic stand for 15 mL tubesLife Technologies Holdings Pte Ltd12301DDynaMag-15
Magnetic stand for 15 mL tubesLife Technologies Holdings Pte Ltd12321DDynaMag-2
ThermoMixerEppendorf5382 000.015Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralenLife Technologies Holdings Pte Ltd29986EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL HitachiF8T5/BL 365 nm UV bulb
Fetal Bovine SerumLife Technologies Holdings Pte Ltd10270106  Components of Hela medium
FormamidePromegaH5052  Component in hybridization buffer
G8T5Sankyo-DenkiG8T5254 nm UV bulb
GlycogenLife Technologies Holdings Pte Ltd10814010Required for nucleic acid precipitation
NanodropLife Technologies Holdings Pte LtdNanodrop 2000Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water First BASEBUF-1180-500ml  
Penicillin Streptomycin  Life Technologies Holdings Pte Ltd15140122  Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x)Life Technologies Holdings Pte LtdF531L Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1New England BiolabsE7335L PCR primers
DNA Gel Extraction KitQIAgen28106QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kitLife Technologies Holdings Pte LtdQ32854Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kitQiagen74106RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase InhibitorLife Technologies Holdings Pte LtdAM2696SUPERase In
Reverse transcriptaseLife Technologies Holdings Pte Ltd18080400SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel StainLife Technologies Holdings Pte LtdS11494SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide KinaseNew England BiolabsM0201LEnd repair enzyme
T4 RNA Ligase 1New England BiolabsM0204LEnzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQNew England BiolabsM0373LEnzyme for adaptor ligation
TemedBio-Rad1610801TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroformLife Technologies Holdings Pte Ltd15596018TRIzol® Reagent for RNA extraction
UreaFirst BASEBIO-2070-5kg  
UV crosslinkerStratagene400072UV Stratalinker 1800
UV TransilluminatorUVP95-0417-01For visualizing of bands
Xylene Cyanol FFSigma-AldrichX4126-10G
DNA cleanup itZymo Research D4004Zymo DNA concentrator-5 
List of software required
FastQC software0.11.4http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software1.0.7https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software0.7.12http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software1.2.1http://www.htslib.org/
PULLSEQ software1.0.2https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software2.5.0chttps://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON scriptPYTHON 2.7.11https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON scriptPYTHON 2.7.11https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK scriptAWK GNU 4.1.2https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer 
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2x RNA fragmentation buffer
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8.3
2x RNA loading Dye
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1 mM EDTA
3' RNA adapter sequence:
5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence:
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG

References

  1. Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
  2. Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
  3. Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
  4. Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
  5. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
  6. Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
  7. Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
  8. Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
  9. Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
  10. Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
  11. Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
  12. Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
  13. Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
  14. Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
  15. Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

123RNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved