בידול יעיל של pluripotent בתאי גזע כדי NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; אבות הלבלב

Summary

כאן אנו מתארים פרוטוקול 4 שלבים להבדיל מתאי גזע עובריים אנושיים כדי NKX6-1 ⁺ אבות לבלב במבחנה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של שורות תאי גזע אנושיים pluripotent.

Abstract

יש תאי גזע פלוריפוטנטיים היכולת עצמית לחדש ולבדל שושלות מרובות, מה שהופך אותם מקור אטרקטיבי עבור הדור של ובתאים לבלב שיכול לשמש לחקר וטיפול עתיד של סוכרת. מאמר זה מתאר פרוטוקול בידול ארבעה שלבים שנועד ליצור ובתאי לבלב מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs). פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מספר תאי הגזע האנושי פלוריפוטנטיים קווי (hPSC). הגישה שננקטה כדי ליצור ובתאי לבלב היא להבדיל hESCs לבנות מודל מדויק בשלבים קריטיים התפתחות לבלב. זה מתחיל עם האינדוקציה של האנדודרם הסופי, אשר מושג על ידי culturing תא בנוכחות Activin A, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) ו CHIR990210. בידול דפוסים בהמשך עם פיברובלסטים Growth Factor 10 (FGF10) ו Dorsomorphin מייצרים תאים דומים במעי הקדמי האחורי. התוספת של ברטיןOIC חומצה, שהגולגולת, SANT-1 ו FGF10 מבדיל תאים במעי הקדמי האחורי לתאים אופייני endoderm הלבלב. לבסוף, השילוב של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), Nicotinamide ו noggin מוביל הדור יעיל של PDX1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ תאים. Cytometry זרימה מבוצע כדי לאשר את הביטוי של סמנים ספציפיים בשלבים המפתח של התפתחות הלבלב. PDX1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ אבות הלבלב בסוף השלב 4 מסוגלים לייצר תאי β בוגרים על השתלה לעכברי immunodeficient ויכולים להיות מובחן נוסף לייצר תאים מייצרי אינסולין במבחנה. לפיכך, הדור היעיל של PDX1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ אבות לבלב, כפי שמודגם בפרוטוקול זה, הוא בעלת חשיבות רבה כיוון שהיא מספקת פלטפורמה ללמוד פיתוח לבלב אנושי במבחנה מספקת מקור של תאים עם הפוטנציאל של הבחנה כדי תאי β שיכול EVentually לשמש לטיפול בסוכרת.

Introduction

השכיחות של סוכרת היא הגדילה על פי איגוד הסוכרת הקנדי, ההערכה היא כי למעלה מ -11 מיליון בני אדם בקנדה הוא סוכרת או prediabetic, עם 5-10% של אנשים אלה שיש סוכרת סוג 1 (T1D) ^1. T1D היא מחלה אוטואימונית אשר נגרמת על ידי הרס של תאי β לייצר אינסולין אשר ממוקמים בתוך איי לנגרהנס. נכון לעכשיו, אנשים החיים עם T1D דורשים מקורות חיצוניים של אינסולין ^2. למרות ההתקדמות בטיפול אינסולין, חולי T1D ממשיכים מתקשים לווסת את רמות הסוכר בדם שלהם ממשיכים לסבול הן חָסֵר ו היפרגליקמיה. טופס מבטיח טיפול לשחזר normoglycemia ב T1D הוא השימוש בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs), אשר יכול לשמש כדי ליצור אספקה בלתי מוגבלת של תאים המייצרים אינסולין β הוא in vivo ו במבחנה ^{3, 4, 5, 6, 7.} ההתמיינות hESCs כדי בטא דמויי תאים יכול לעשות את זה ניתן ללמוד סוכרת במבחנה, המאפשר זיהוי של מטרות טיפוליות חדשות לטיפול בסוכרת מסוג 2 ולספק תאים להשתלה לחולים T1D.

הניסיון המוצלח ביותר ביצירת תאים מייצרי אינסולין hESCs במבחנה היא לשחזר את האירועים עובריים המתרחשות במהלך התפתחות הלבלב ^{4, 5.} זה כרוך המניפולציה של מסלולי איתות מובהקים מודל שלבי מפתח מדויק של הלבלב מתפתח. פיתוח לבלב מתחיל עם האינדוקציה של האנדודרם הסופי, אשר מאופיין על ידי הביטוי של CXCR4 ו CD117 (c-KIT) ^{8, 9.} תקנה מדויקת של definitארגון endoderm ive נדרש להקמת צינור הבטן, אשר לאחר מכן עובר קדמי אל אחוריים ואת גחון-הגבה דפוסים. הגבה וניצני לבלב גחון לצאת מהאזור במעי הקדמי האחורי המבטא את גן homeobox לבלב תריסריון (Pdx1), אשר הוא הכרחי עבור התפתחות לבלב ^10. הגבה וניצני גחון פתיל כדי ליצור את הלבלב, אשר לאחר מכן עובר שיפוץ נרחב אפיתל והרחבה ^11. מחויבות השושלת האנדוקרינית אקסוקרינית מלווה דור ובתאים מולטיפוטנטיים (MPCs) המבטאים, בין היתר, את שעתוק גורמי Pdx1, Nkx6.1 ו Ptf1a ^{12, 13.} MPCs שיהפכו תאי האנדוקרינית ductal ממשיך להביע Nkx6-1 תוך הפחתת ביטוי Ptf1a. בניגוד לכך, תאי שושלת אקסוקרינית יאבדו expression של Nkx6-1 ולתחזק Ptf1a הביטוי ^12.

גורם השכפול Nkx6-1 יש תפקיד מרכזי בפיתוח לבלב, בפרט במהלך ההתמיינות של תאי אב האנדוקרינית כדי בטאו תאים. כפי שתואר קודם לכן, המחיקה של תוצאות Nkx6-1 במבנה לקוי של תאי β במהלך התפתחות הלבלב ^14. לכן, יצירת תאי β מייצר אינסולין הוא במבחנת in vivo דורשת האינדוקציה היעילה של Nkx6-1.

אנחנו לאחרונה פתחנו פרוטוקול ביעילות ליצור PDX1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ אבות לבלב מ hPSCs. HPSC נגזרים אלה אבות לבלב לייצר תאי β בוגרים על השתלה לעכברי immunodeficient ^3. פרוטוקול הבידול ניתן לחלק 4 שלבים אופייניים: 1) אינדוקציה האנדודרם סופית, 2) דפוסים במעי הקדמי האחורי, 3) מפרט הלבלב ו -4) אינדוקציה NKX6-1. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של כל שלב של התמיינות מכוונת.

Protocol

1. הכנת פתרונות ומדיה

הערה: הכן את כל התקשורת עבור תרבית תאים בסביבה סטרילית. יש מדיה להתבצע ומשומשים מיד. פרטים מגיבים ניתנים לוח החומרים.

1. מדיה בידול
   1. הכן יום 0 בידול מדיה: RPMI בינוני עם 1% גלוטמין, 2 מיקרומטר CHIR 99,021, 100 ng / ml Activin א ', 10 ⁴ M MTG.
   2. הכן מדיה בידול יום 1-2: RPMI בינוני עם 1% גלוטמין, 100 ng / ml Activin א ', 10 ⁴ M MTG, 5 ng / ml bFGF, 50 מיקרוגרם / מ"ל חומצה אסקורבית.
   3. הכן מדיה בידול יום 3-5: RPMI בינוני עם 1% גלוטמין, 1% B27, 10 ⁴ M MTG, 0.75 מיקרומטר Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10.
   4. הכן מדיה בידול יום 6-7: DMEM עם 1% גלוטמין, 1% B27, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​אסקורבית חומצה, 50 ng / ml FGF10, 0.25 SANT-1 מיקרומטר, 2 מיקרומטר החומצה הרטינואית, 50 ng / ml noggin.
      הערה: רטינואיתחומצה יש להוסיף התקשורת אחרונה ומדיה צריכה להיות מוגנת מפני אור כדי למנוע חמצוני שפלה ^15.
   5. הכן יום 8-12 בידול מדיה: DMEM עם 1% גלוטמין, 1% B27, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​אסקורבית חומצה, 50 ng / ml noggin, 100 ng / ml hEGF, 10 מ"מ Nicotinamide.
2. הכן חיץ FACS: 10% FBS ב PBS, מינוס סידן ומגנזיום.

2. בידול hESC

הערה: hESC הם הפשירו, passaged והרחיב על פיברובלסטים עובריים בעכבר מוקרן בנוכחות מדיה מבוססת KOSR בתוספת bFGF ^16. HESCs מוכן בידול כאשר התאים מגיעים 80-95% confluency. בשלב זה המושבות צריכות להיות גדולות עם גבולות מוגדרים וכן (איור 1 א) 'domelike' מבנה. כל תרבית התאים מתבצעת שטוח תחתון, צלחות שטופלו בתרבית רקמה מצופית 0.1% ג'לטין. בדרך כלל, התאים גדלים ב 6 או12-גם צלחות, במחזורי התקשורת של 2 מ"ל או 1 מ"ל, בהתאמה.

1. ביום 0, להתחיל בידול על ידי החלפת מדיה המבוססת KOSR עם מדיה בידול 0 יום.
2. בימים 1 ו -2, לנער את הצלחת בעדינות כדי להסיר את כל התאים המתים מן monolayer לפני aspirating. חלף עם יום 1-2 בידול מדיה.
3. ביום 3, תאי קציר עבור cytometry זרימה. אם התאים לבטא יותר מ -90% CXCR4 ⁺ / CD117 ^+, המשך לשלב 2.4.
4. בימים 3 ו -5, לנער את הצלחת בעדינות כדי להסיר את כל התאים המתים מן monolayer לפני aspirating. חלף עם יום 3-5 בידול מדיה.
5. בימים 6 ו -7, להחליף עם מדיה בידול יום 6-7.
6. בימים 8, 10 ו -12, להחליף עם יום 8-12 מדיה בידול.
7. ביום 13, תאי קציר עבור cytometry זרימה כדי לקבוע PDX1 וביטוי NKX6-1.

3. תאי קציר עבור ניתוח cytometry הזרימה

1. לנתק תאים עםפתרון טריפסין מסחרי 1x על פי הפרוטוקול של היצרן ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
2. הסר פתרון טריפסין מסחרי ו resuspend תאים בודדים 1,000 μl FACS חוצץ עם 30 μl DNase I.
3. תאים מסננים באמצעות מסננת תא רשת ניילון 35 מיקרומטר ולהעביר צינור microcentrifuge.
4. תאי צנטריפוגה ב 455 XG במשך 5 דקות. כן תאים עבור מכתים או לחיות או קבוע.

4. מכתים עבור cytometry זרימה

1. זרימה לקראת מכתים חי ביום 3
   1. תאים Resuspend ב 1,000 μl FACS חוצץ. העברת 200 μl (כ 1-3 x 10 ⁵ תאים) לשתי בארות של צלחת 96-היטב (הן דוגמאות בלא כתם ומוכתמת).
   2. צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת.
   3. הכתם עם נוגדנים ראשוניים מצומדות, CXCR4: APC ו CD117: PE (ראה M aterials טבלה) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור.
   4. צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת.
   5. דגימות גלולות ב 100 μl חיץ FACS.
   6. צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת.
   7. Resuspend כל דגימה והעברת בהיקף כולל של 300-500 μl FACS הצפת 1 מ"ל מבחנות מיקרו או 5 צינורות מ"ל מסביב לתחתית.
   8. דגימות לרוץ על זרימת cytometer ^17. אם דגימות לא ניתן להפעיל באופן מיידי, חנות ב 4 ° C מוגן מפני אור.
2. זרימה לקראת מכתים קבוע ביום 13
   1. Resuspend התא גלולה בפתרון קיבעון / permeabilization מסחרי למשך 24 שעות ב 4 ° C..
   2. צנטריפוגה מדגם ב 455 XG במשך 5 דקות. Resuspend ב 400 μl פתרון פרם / Wash.
   3. העבר 200 μl של המדגם (כ 0.5-1 x 10 ⁶ תאים) כדי two בארות צלחת 96-היטב (לשליטה IgG ו PDX1 / NKX6-1 מכתים). צנטריפוגה ב 931 XG למשך 2 דקות.
   4. Resuspend את כדורי תא 100 μl פתרון פרם / לשטוף המכיל נוגדני שליטה אנטי PDX1 ואנטי NKX6-1 ראשוני או אלוטיפ (ראה לוח חומרים). דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
   5. צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת. דגימות גלולות ב 100 μl פתרון פרם / Wash.
   6. צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת.
   7. Resuspend דגימות 100 μl פרם / Wash המכילה נוגדנים משני בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 מוגן מפני אור.
   8. צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת.
   9. דגימות גלולות ב 100 μl פרמו / לשטוף פתרון.
   10. צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת.
   11. נציגלאכול צעד 4.2.9 ו 4.2.10.
   12. Resuspend כל דגימה והעברת בהיקף כולל של 300-500 μl FACS הצפת 1 מ"ל מבחנות מיקרו או 5 צינורות מ"ל מסביב לתחתית.
   13. דגימות לרוץ על זרימת cytometer ^17. אם דגימות לא ניתן להפעיל באופן מיידי, חנות ב 4 ° C מוגן מפני אור.

תוצאות

דור יעיל של אבות לבלב מסתמך על הגידול הנכון ותחזוקה של תאים שלא עברו התמיינות ואחריו התוספת המדויקת של מולקולות ספציפיות איתות במהלך פרוטוקול הבידול, כפי שמודגם סכמטי באיור 1 א. ביום 0, תאים שלא עברו התמיינות צריכים להיות ומחוברות 80-95% ומושב?...

Discussion

יצירה בהצלחה NKX6-1 ⁺ אבות לבלב מ hPSCs במבחנה מסתמכת על השימוש של תרבויות באיכות גבוהות של hPSCs והבחנה מכוון מעורבות בוויסות המדויקת של מסלולי איתות ספציפיים ששולטים שלבי התפתחות מפתח במהלך התפתחות לבלב. למרות פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לגרום ביטוי חזק של NKX6-1 פני...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and cytokines
1-Thioglycerol (MTG)	Sigma	M6145
Activin A	R&D	338-AC/CF
Ascorbic Acid	Sigma	A4544
B-27 Supplement	Life Technologies	12587-010
BD Cytofix/Cytoperm Buffer	BD Bioscience	554722
BD Perm/Wash buffer, 1x	BD Bioscience	554723
bFGF	R&D	233-FB
CHIR990210	Tocris	4423a
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11995
DNase I	VWR	80510-412
Dorsomorphin	Sigma	P5499
EGF	R&D	236-EG
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	88150
FGF10	R&D	345-FG
Gelatin from porcine skin	Sigma	G1890
Glutamine	Life Technologies	25030
Nicotinamide	Sigma	NO636
NOGGIN	R&D	3344-NG
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063
Retinoic acid	Sigma	R2625
RPMI Medium 1640	Life Technologies	11875
SANT-1	Tocris	1974
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Life Technologies	12605-010
Name	Company	Catalogue Number	Comments
Antibodies for flow cytometry (working dilutions)
CD117 PE (1:100)	Life Technologies	CD11705
CXCR4 APC (1:50)	BD  Bioscience	551966
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400)	Life Technologies	A-31571
Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	705-546-147
Isotype Control Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	015-000-003
Isotype Control Goat IgG	R&D	AB-108-C
NKX6-1 (1:2,000)	DSHB	F55A10
PDX1 (1:100)	R&D	AF2419