JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בעקבות הכנת נוגדן חד-שבטי-modified Cu 64 מחייב לקולטן תא T בעכברים טרנסגניים, תאי T הם רדיואקטיבי in vivo, ניתח עבור כדאיות, פונקציונליות, יציבות תיוג אפופטוזיס, והועברו adoptively לעכברים עם דרכי הנשימה מתעכב מסוג רגישות יתר תגובה עבור הדמיה לא פולשנית של טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים / טומוגרפיה ממוחשבת (PET / CT).

Abstract

פרוטוקול זה ממחיש את הייצור של 64 Cu ואת radiolabeling נטיה / chelator של נוגדנים חד שבטיים (מב) ואחריו תרבית תאים לימפוציטים בעכברים ו 64 Cu-נוגדן לקולטן מיקוד של תאים. בהערכה במבחנה של radiolabel ולא פולשנית ב מעקב תא vivo במודל חיה של תגובת רגישות יתר בדרכי נשימה מתעכב-סוג (DTHR) על ידי PET / CT מתוארים.

בפירוט, הנטייה של מב עם חומצת 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic chelator (DOTA) מוצגת. בעקבות ייצור של 64 Cu רדיואקטיבי, radiolabeling של מב DOTA מצומדות מתואר. הבא, הרחבת ovalbumin עוף (Cova) -specific CD4 + אינטרפרון (IFN) -γ-ייצור תאי T מסייעים (Cova-TH1) ואת radiolabeling עוקבות של תאים Cova-TH1 מתוארים. טכניקות שונות במבחנה ב מוצגות להעריך את EFfects של 64 Cu-radiolabeling על תאים, כגון קביעת כדאיות התא על ידי הרחקה trypan כחול, מכתים עבור אפופטוזיס עם Annexin V עבור זרימת cytometry, ואת ההערכה של פונקציונליות ידי IFN-γ assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) . יתר על כן, קביעת ספיגת רדיואקטיבי לתוך התאים ואת יציבות התיוג מתוארת בפירוט. פרוטוקול זה ממשיך ומתאר כיצד לבצע מחקרי מעקב תא במודל חיה במשך DTHR דרכי נשימה, ולכן, בדומה להשפעה DHTR בדרכי נשימה חריפה הנגרמת Cova בעכברי BALB / ג כלולה. לבסוף, זרימת עבודת PET / CT חזקה כולל רכישת תמונה, שחזור וניתוח מוצגת.

64 גישת מיקוד קולטן Cu-הנוגדן עם הפנמת קולטן עוקבת מספקת סגולית ויציבות גבוהות, רעילויות הסלולר מופחתות, ושיעורים בזרימה נמוכים לעומת PET-קליעים נותבים משותפים תיוג תא, למשל 64 CuBIS -pyruvaldehyde (N4-methylthiosemicarbazone) (64 Cu-PTSM). לבסוף, הגישה שלנו מאפשרת לא פולשנית למעקב תא vivo על ידי PET / CT עם יחס אות-רקע אופטימלי עבור 48 h. גישה ניסיונית זו ניתן להעביר מודלים שונים של בעלי חיים סוגי תאים עם קולטני קרום הנכנס כי הן הפנימו.

Introduction

מעקב תא לא פולשני הוא כלי תכליתי כדי לפקח תא פונקציה, גירת ביות in vivo. מחקרי מעקב תא שנעשה לאחרונה התמקדו המזנכימה 1, 2 או תאי גזע שמקורם במוח עצם 3 בהקשר של רפואת רגנרטיבית, תאי דם לבנים היקפיים עצמיים דלקת או לימפוציטים מסוג T ב טיפולים בתאי מאמצת נגד סרטן 3, 4. וביאור באתרי הפעולה ואת העקרונות הביולוגיים הבסיסיים של טיפולים מבוססי תאי היא בעלת חשיבות עצומה. לימפוציטים CD8 + T ציטוטוקסיים, מהונדסים גנטיים הקולטן לאנטיגן כימרי (CAR) תאי T או לימפוציטים שחדר-גידול (TILs) נחשבו נרחב כתקן הזהב. עם זאת, אנטיגן ספציפי הקשור לגידול תא TH1 שהוכח מהווה טיפול אלטרנטיבי יעיל 4, </ sup> 5, 6, 7.

כמו שחקני מפתח דלקת, מחלות אוטואימוניות ספציפי איבר (למשל, דלקת מפרקים שגרוניות או אסטמה), ותאים של ריבית גבוהה חיסוני סרטן, חשוב לאפיין את דפוסי הפצת ביות הזמניים של תאי TH1. הדמיה לא פולשנית in vivo על ידי PET מציגה שיטה כמותית, רגישה מאוד 8 לבחון דפוסי נדידת תאים, ב ביות vivo, וכן באתרי פעולת תא T ותגובות בזמן דלקת, אלרגיות, דלקות או גידולי דחייה 9, 10, 11.

מבחינה קלינית, 111 ב-oxine משמש scintigraphy לויקוציטים עבור אפליה של דלקת וזיהום 12, תוך 2-deoxy-2- (18F) fluoro-D-גלוקוז (18 F-FDG) הוא נפוץ ללימודי מעקב התא על ידי 3 PET, 13. חסרון עיקרי אחד נותב PET הזה, לעומת זאת, הוא זמן מחצית החיים הקצר של 18 F רדיונוקלידית ב 109.7 דקות ואת היציבות התאית הנמוכה המונעת הדמיה בנקודות זמן מאוחר לפרסם העברת תא מאמצת. עבור לטווח ארוך יותר במחקרי מעקב תא vivo על ידי PET, למרות יציבה בתאים, 64 Cu-PTSM משמש לעתים קרובות כדי לתייג nonspecifically תאים 14, 15 עם השפעות מזיקות ממוזערות על כדאיויות תא T ולתפקד 16.

פרוטוקול זה מתאר שיטה נוספת להפחית תופעות נחות על כדאיות התא ומתפקדים באמצעות קולטן תא T (TCR) מב רדיואקטיבי -specific. ראשית, הייצור של Cu 64 רדיואיזוטופיים, הנטייה של KJ1-26 מב עם הדואר chelator DOTA, ואת radiolabeling Cu-64 העוקבות מוצגות. בשלב שני, הבידוד הרחב של תאי Cova-TH1 של עכברים תורמים DO11.10 ואת radiolabeling עם 64 Cu-טעון DOTA מצומדות מב KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) מתוארים בפירוט. ההערכה של ערכים ספיגים בזרימה של רדיואקטיביות עם כיל מינון ועל ידי γ-ספירה, בהתאמה, כמו גם את הערכה של ההשפעות של 64 Cu-radiolabeling על כדאיויות תא על ידי הרחקת trypan כחולה ופונקציונלי עם IFN-γ ELISA מוצג . עבור לא פולשנית למעקב תא vivo, ההתמחרות של מודל עכבר של רכישת תמונת DTHR בדרכי נשימה חריפה הנגרמת Cova ידי PET / CT לאחר העברת תא מאמצת מתוארת.

יתר על כן, גישת תיוג זו ניתן להעביר מודלים למחלות שונים, תאי T בעכברים עם TCRs שונה או תאים בכלל עניין עם קולטנים או mar ביטוי קרום הנכנסKERS שבבסיס קרום רציף shuttling 17.

Protocol

הוראות בטיחות: כאשר טיפול רדיואקטיביות, לאחסן 64 Cu מאחורי 2 אינץ 'בעובי לבן להוביל ולהשתמש מיגון בהתאמה לכל כלי נושאת פעילות. שימוש בכלים מתאימים כדי להתמודד בעקיפין מקורות מסוככים כדי למנוע מגע יד ישיר למזער חשיפה לחומר רדיואקטיבי. תמיד ללבוש תגי מעקב dosimetry קרינה וציוד מיגון אישי ולבדוק את עצמך ואת אזור העבודה עבור זיהום מייד לטפל בה. בטל ציוד מיגון אישי מזוהם לפני שעזבתי את האזור שבו חומר רדיואקטיבי משמש. אחסן את פסולת רדיואקטיבית כולו מאחורי שריון העופרת עד Cu 64 הרדיואקטיבי רקובים (כ 10 חצי lifes = 127 h) לפני סילוק נאות.

1. 64 הפקת Cu

הערה: רדיואיזוטופיים 64 Cu מופק באמצעות 64 Ni (p, n) 64 תגובה גרעינית Cu באמצעות PETtהציקלוטרון הגזע על פי פרוטוקול שונה של אל מקארתי et. 18.

  1. במשך 64 ייצור Cu, מקרינים 64 Ni, אשר electroplated על צלחת פלטינה / אירידיום (90/10), עם 30 מיקרו-אמפר עבור 6 שעות עם קרן הפרוטונים של 12.4 MeV.
  2. מחממים את היעד פלטינה / אירידיום ל 100 מעלות צלזיוס בתא ייעודי polyetheretherketone (פיק) דגירה 2 מ"ל של HCl מרוכזת עבור 20 דקות לפרק 64 Cu / 64 Ni.
  3. הוסף עוד 1 מ"ל של HCl מרוכזת דגירה במשך 10 דקות.
  4. לאדות HCl באמצעות זרם של ארגון לקרר את תא לטמפרטורת החדר.
  5. לרוקן את החדר עם 3 מ"ל של 4% 0.2 M HCl ו 96% מתנול (נ / נ) ולהעביר את הפתרון הזה לעמודה חילוף יונים כי היה טרום מותנה עם 4% 0.2 M HCl מתנול דקות לפחות 15. תזרים-דרך שניתן להשתמש בהם כדי למחזר 64 Ni.
  6. שטפו את 64 Cu שמרו בטור עם 4% 0.2 i M HClמתנול n.
  7. Elute 64 Cu עם 70% 1.3 M HCl / 30% isopropanol (נ / V) לתוך בקבוקון אוסף, להתאדות הפתרון בזרם של ארגון ולתת את הבקבוקון להתקרר לטמפרטורת החדר.
  8. ממיסים 64 Cu ב 140-210 μL של 0.1 M HCl.

2. הצמידו נוגדן עם DOTA ו לאחר 64 Cu-radiolabeling

הערה: chelator DOTA יקושר לקבוצות אמינו תפקודית של מב ידי N-hydroxysuccinimide (NHS) כימיה אסתר ואת המצומד יהיה מאוחר רדיואקטיבי עם 64 Cu 19.

  1. התאם את הריכוז של KJ1-26-מב ל 8 מ"ג / מ"ל ו diafiltrate 1 מ"ל של מב פתרון נגד 0.1 M Na 2 HPO 4 pH 7.5 שטופלו 1.2 g / L של שרף חילוף יונים chelating באמצעות משקל מולקולרי מנותקים ( MWCO 30 kDA) יחידת מסנן צנטריפוגלי. החל 3 שלבים הכביסה הבאים עם 14 מ"ל של חיץ. לאחר שלב הכביסה הסופי,להתרכז הפתרון שוב 1 מ"ל. לכמת את ריכוז הנוגדנים על ידי מדידות 280nm OD.
  2. הכן פתרון DOTA-NHS ב ultrapure או מים PCR כיתה בריכוז של 10 מ"ג / מ"ל ​​מיד לפני השימוש. תנו בקבוקון להסתגל לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה כדי למנוע התעבות מים, ובזהירות להסיר DOTA-NHS בעזרת מרית פלסטיק. הוספת 216 μL של פתרון DOTA-NHS זה 8 מ"ג של הפתרון KJ1-26-מב diafiltrated, ומערבבים היטב, דגירה במשך 24 שעות ב 4 ° C על מיקסר נפילה.
  3. Diafiltrate DOTA-KJ1-26-מב נגד 0.25 M אמוניום אצטט, pH 7.0, שטופלו 1.2 g / L של שרף חילוף יונים chelating, באמצעות משקל מולקולרי מנותקים (MWCO 30 KDA) יחידת מסנן צנטריפוגלי. החל 7 צעדי כביסה. לרכז את מב לנפח סופי של 1 מ"ל ושוב למדוד את ריכוז החלבון על ידי מדידות 280nm OD.
  4. לפני radiolabeling, להחליף את החיץ של DOTA-KJ1-26-מב ל PBS באמצעות בגודל EXCכרומטוגרפיה lusion באמצעות עמודות סינון ג'ל. זה גם מסיר זיהומי מולקולות קטנות פוטנציאל.
  5. הכן 100 MBq 64 CuCl 2 פתרון 10 מ"מ HCl ולהתאים את ה- pH 6-7 עם 10x PBS. הוספת 200 מיקרוגרם של DOTA-KJ1-26-מב. דגירה של 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  6. עבור בקרת איכות, לבצע כרומטוגרפיה בשכבה דקה עם נתרן ציטרט 0.1 M (pH 5) כשלב הנייד ולנתח ידי autoradiography. לפחות 90% מהפעולה צריכים להיות קשורים הנוגדן ובכך להתגלות בנקודת ההתחלה. פעילות מאוגדת היא chelated ידי השלב הנייד מבוסס ציטרט פסים לחזית הממסה. לקבלת הפניה, שימוש 64 2 CuCl מומלץ.

3. עוף ovalbumin ספציפי TH1 (Cova-TH1) בידוד תא והרחבה

הערה: התרבות של תאי TH1 מתוארת על פי מחקרים שפורסמו בעבר 16, 17.

  1. לבודד טחול ובלוטות לימפה extraperitoneal (LNs) מעכברים DO11.10.
    1. קורבן העכבר בהתאם לתקנות פדרליות. לחטא את החיה עם 70% אתנול ו לקבע אותו עם דבק להסרת הטחול LNs. ביצוע חתך החציוני ולהפריד את העור מפני הצפק על ידי רוחבית משיכתו לכל אתר.
    2. אתר את צוואר הרחם, צירים, הזרוע ואת LNs מפשעתי. הסר אותם עם מלקחיים בוטים ולמקם אותם 1% נסיוב עגל עוברי (FCS) / חיץ PBS.
    3. פתח את הצפק ולאתר את הטחול. הפרד את הטחול לבלב ורקמת חיבור ולמקם אותו 1% חיץ FCS / PBS. לקבלת הנחיות נוספות, לראות אזכור 20,21.
  2. הטחול LNs בשר טחון דרך מסנן 40 מיקרומטר לתוך 50 מ"ל להבריג צינור כובע באמצעות הבוכנה של המזרק. יש לשטוף את המסנן עם 10 מ"ל 1% FCS / PBS-חיץ.
  3. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. Subsequently, לבצע תמוגה של אריתרוציטים ידי הוספת אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) חיץ תמס (1.5 מ"ל לכל חיה התורם) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. להוסיף 8.5 מ"ל 1% FCS / PBS-חיץ (לכל חיה התורם).
  4. צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. שוטפים את התאים ב 10 מ"ל 1% FCS / PBS-חיץ, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
  5. עבור הפרדה תא מגנטי, להשעות את התאים 1% FCS / PBS-חיץ ולהוסיף CD4 + microbeads. עיין בהוראות היצרן עבור נפח המאגר וכמות CD4 + microbeads להשתמש.
  6. דגירה של 20 דקות ב 4 °. ואז להוסיף 1% FCS / PBS-חיץ עד 50 מ"ל, צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant.
  7. המשך עם בידוד תא CD4 + T באמצעות עמודות הפרדה מגנטית מסחריות עמדת מגנט בהתאמה על פי הפרוטוקול של היצרן. התאם את תאי CD4 + T eluted על שיתוףncentration של 10 6 תאים / מ"ל ב בינוני של הנשר Modified של Dulbecco עם 10% חום מומת FCS, 2.5% פניצילין / סטרפטומיצין, 1% חיץ HEPES, 1% חומצות אמינו MEM, פירובט סודיום 1%, ו 0.2% 2-mercaptoethanol וחנות אותם 4 מעלות צלזיוס.
  8. אסוף את פריקת עמודת צינור כובע 50 מיליליטר בורג להכין תאי מציגי אנטיגן (נגמ"שים). צנטריפוגה הפריקה הטור ב 400 XG במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
  9. להוסיף 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​אנטי CD4 (שיבוט: Gk1.5), 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​אנטי CD8 (שיבוט: 5367.2) ו 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​עכבר אנטי עכברוש-מב (MAR18.5) ו 1.5 השלמה ארנב מ"ל. דגירה של 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  10. צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 5 דקות, להסיר את supernatant ולהוסיף 3 בינוני מ"ל. מקרינים את נגמ"שים על מקור γ-ray או רנטגן עם 30 Gy בסך הכל. לאחר מכן, להתאים את נגמ"שי לריכוז של 5 x 10 6 תאים / מ"ל.
  11. הוספת 100 μL של CD4 + T תאים 100 μL של נגמ"שים על PLA 96-היטבte יחד עם 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​Cova 323-339-פפטיד, 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​אנטי-IL-4-מב, 0.3 מיקרומטר CPG1668-oligonucleotides ו 5 U / mL IL-2.
  12. להוסיף 50 U / mL IL-2 כל שני וחמישי. לאחר 3 - 4 ימים, להעביר את התאים מן צלחות 96-היטב צלחות 24-היטב. שלב 3-5 בארות מהצלחת 96-היטב היטב אחד על הצלחת 24-היטב. הוספת 100 U / mL IL-2 בינוני המכיל בתוך 1: יחס 1.
  13. לאחר 2-3 ימים אחרים, להעביר את התאים מן הצלחת 48-היטב 175 בקבוקוני תרבית תאי סנטימטר 2 (1 x 48-גם צלחת לכל בקבוק). מלאו עם מדיום 1: יחס 1. להוסיף 50 U / mL IL-2 כל שני וחמישי.
  14. פיצול התאים על פי צפיפות התאים ולהוסיף 50 U / mL IL-2 כל שני וחמישי. באופן זה, תרבות התאים עבור 10 ימים אחרים.

4. Radiolabeling Cell Cova-TH1

הערה: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב יחול על תאים בתרבית Cova-TH1 לאפשר תיוג רדיואקטיבי תאי.

  1. עבור Cova-TH1 CEradiolabeling ll, לצייר 37 MBq של Cu-DOTA-KJ1-26-מב רדיואקטיבי 64 בתוך מזרק ללא נפח מת באמצעות כיל מנה. להוסיף 1 מ"ל מלוחים לקבל פתרון 37 MBq / מ"ל.
  2. להשעות תאים Cova-TH1 במדיום ב 2 x 10 6 תאים / מ"ל ולהוסיף 0.5 מ"ל של השעיה התא היטב כל צלחת 48-היטב.
  3. להוסיף 20 μL של 37 MBq מוכן טרי / מ"ל 64 פתרון Cu-DOTA-KJ1-26-מב היטב בכל צלחת 48-היטב. היחס הסופי עבור התיוג הוא 0.7 MBq לכל 10 6 תאים בנפח של 520 μL. לדגור על 37 מעלות צלזיוס ו 7.5% CO 2 עבור 30 דקות.
  4. לאחר הדגירה, בזהירות מחדש להשעות את התאים בכל טוב ולהעביר את ההשעיה תא מהצלחת 48-היטב לתוך 50 מ"ל להבריג צינור כובע. כדי להקטין את איבוד התא, לשטוף היטב עם כל מדיום מחומם מראש.
  5. צנטריפוגה ההשעיה תא Cova-TH1 ב 400 XG במשך 5 דקות, לבטל את supernatant, מחדש להשעות התאים 10 מ"ל prewarmed PBS. הסר ו-ל'liquot השעית התא עבור ספירת תאים. חזור על שלב הכביסה.
  6. ספירת תאי Cova-TH1 קיימא ב דילול מתאים עם כתמי כחולי trypan.
  7. התאם את הריכוז התא 5 x 10 7 תאים / מ"ל עבור הזרקה (IP) הזרקה של 10 7 תאים 200 μL PBS.
  8. חזור על שלבים 4.3-4.5 כדי radiolabel התאים Cova-TH1 עם כמויות גדלות והולכות של פעילות, למשל, 1.4 MBq או 2.1 MBq לכל 10 6 תאים.
    1. כדי radiolabel התאים עם 1.4 MBq לכל 10 6 תאים, השתמש 40 μL של 37 MBq / מ"ל 64 פתרון Cu-DOTA-KJ1-26-מב ו 60 μL עבור radiolabeling עם 2.1 MBq לכל 10 6 תאים. בצע את השלבים 4.3-4.7 עם 0.7 MBq, 1.4 MBq ו 2.1 MBq 64 Cu-PTSM אך להגדיל את זמן תיוג כדי 3 h לחקירות השוואתי 17.
    2. עבור לשלב 5 כדי לקבוע את הכמות האופטימלית של פעילות.

5. הערכה במבחנה של השפעת Radiolabel על תאי Cova-TH1

הערה: אפיון ההשפעות של radiolabel על תאי TH1 מתבצע באמצעות assay הרחקה trypan כחול עבור כדאיות, IFN-γ ELISA עבור הערכה פונקציונליות PE-Annexin V מכתים עבור אינדוקציה של אפופטוזיס 16, 17. קביעה הספיגה תאי ואת בזרימה של רדיואקטיביות גם מתוארת למטה. בתור השוואה, 64 Cu-PTSM שכותרתו תאים Cova-TH1 יכול לשמש גם.

  1. השפעה על כדאיות ידי הרחקה כחול trypan
    1. התאם לפחות 18 x 10 6 תאים Cova-TH1 רדיואקטיבי עם 0.7 MBq / 10 6 תאים, 1.4 MBq / 10 6 תאים ו 2.1 MBq / 10 6 תאים בהתאמה לריכוז של 2 x 10 6 תאים / מ"ל ולבצע צעדים 5.1. 2-5.1.7 עבור כל מנת פעילות. שימוש לא radioactive KJ1-26-מב שכותרתו תאים Cova-TH1 ותאי Cova-TH1 ללא תווית כמו הפקדים.
    2. Pipet 1 מ"ל של פתרון התא לתוך 9 בארות של צלחת 24-היטב.
    3. אסוף את התוכן של 3 בארות לתוך 3 15 מ"ל נפרד לדפוק צינורות כובע, 3 שעות לאחר radiolabeling הראשונית.
    4. שוטפים את בארות שעכשיו ריקה בינוני מחומם מראש כדי למזער אובדן התא ולהוסיף המדיום אל 15 מ"ל בהתאמה לדפוק צינורות כובע משלב 5.1.3.
    5. צנטריפוגה 15 צינורות מ"ל ב 400 XG במשך 5 דקות מחדש להשעות את התא גלולה וכתוצאה 1 מ"ל של מדיום מראש התחמם.
    6. רוזן הוא תאי קיימא מתו בכחול trypan בנפרד עבור כל צינור 15 מיליליטר ו לחשב את אחוז תאי קיימא.
    7. חזור על שלבים 5.1.3-5.1.6 24 ו 48 פוסט h 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב radiolabeling.
  2. אפקטים על פונקציונליות נקבע על ידי γ-IFN ELISA
    הערה: כדי להעריך את ההשפעה של productio Cu-DOTA-KJ1 26-מב radiolabel על IFN-γ 64n כסמן של פונקציונליות, לבצע ELISA IFN-γ מן ההספק מסחרי להתייחס התייחסות 17 לפרטים נוספים.
    1. לפזר 10 5 תאים קיימא ב 100 μL של המדיום על צלחת 96-היטב, 3 פוסט h 64 radiolabeling Cu-DOTA-KJ1-26 של תאים Cova-TH1 עם 0.7 MBq, 1.4 MBq או 2.1 MBq. השתמשו ללא תווית, הלא רדיואקטיבי KJ1-26-מב-שכותרתו או 64 תאים Cu-PTSM שכותרתו Cova-TH1 כמו הפקדים.
    2. לעורר ייצור IFN-γ ב 10 5 64 תאים Cu-DOTA-KJ1-26-מב-שכותרתו Cova-TH1 ב 100 בינוני μL עם 10 מיקרוגרם / מ"ל של הפפטיד Cova, 5 U / mL IL-2 ו 5x10 5 נגמ"שים ב 100 μL של המדיום עבור 24 שעות ב 37 ° C ו- 7.5% CO 2. פקדים נוספים עשויים להיות תנאים אחרים ללא תוספת של הפפטיד Cova.
    3. לנתח את supernatant ידי ELISA פי הוראות היצרן.
    4. חזור על שלב 5.2.2. כדי 5.2.3. ב 24 ו 48 שעות לאחר הליך התיוג.
  3. אינדוקציה של אפופטוזיס נקבע על ידי מכתים V PE-Annexin עבור cytometry זרימה
    הערה: כדי להעריך אינדוקציה אפופטוזיס על ידי radiolabel Cu-DOTA-KJ1-26-מב 64, השתמש בערכה זמין מסחרית עבור זרימת cytometry ולהכין דגימות תאים על פי הוראות היצרן לפני צביעה עם Annexin V עבור אקספוזיציה סרין phosphatidyl על קרום התא .
    1. בשלב 3, 24 ו 48 פוסט h 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב radiolabeling של תאים Cova-TH1, triplicates כתם עם לפחות 10 6 64 תאים Cu-DOTA-KJ1-26-מב-שכותרתו Cova-TH1 עם ערכת Annexin V לפי הוראות היצרן ולנתח במהלך השעה הקרובה. שימוש שאינו רדיואקטיבי KJ1-26-מב-שכותרתו, 64 Cu-PTSM שכותרתו ללא תווית Cova-TH1 תאים כקבוצת ביקורת. אנא להתייחס התייחסות 17 לפרטים נוספים.
  4. ספיג בזרימה
    הערה: הספיגה של 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב לתוך התאים נמדד כיל מינון ואת בזרימה של רדיואקטיביות נמדדת ב assay ספירה-γ 0, 5, 24, ו 48 שעות לאחר radiolabeling.
    1. כן עשרה צינורות γ-ספירה בכל במשך 64 תאי Cu-DOTA-KJ1-26-מב-שכותרתו Cova-TH1, supernatant בהתאמה ואת השלב לשטוף.
    2. העברת 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב-שכותרתו תאים Cova-TH1 ב 1 מ"ל של מדיום לתוך אחד מעשרת צינורות γ-ספירה ישירות לאחר radiolabeling. עבור כל אחת מנקודות הזמן 5, 24 ו 48 שעות לאחר radiolabeling, לשמור לפחות 10 7 64 תאים Cu-DOTA-KJ1-26-מב-שכותרתו Cova-TH1 במדיום על צלחות תרבית תאים 24-היטב באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 7.5% CO 2.
    3. בצנטריפוגה הצינורות-ספירת γ ב 400 XG במשך 5 דקות ולהעביר את supernatant לתוך עשרה צינורות חדשים γ-ספירה.
    4. שוטפים את התאים פעם בינוני 1 מ"ל להסיר את שבריר מאוגד של 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מבd לאסוף את supernatant עשר צינורות γ-ספירה חדשה.
    5. להוסיף 1 מדיום חדש מיליליטר לתאי Cova-TH1 ולקבוע את הערך הספיג הראשוני כיל מנה. הצינורות ניתן לאחסן גם באינקובטור ב 37 ° C ו- 7.5% CO 2.
    6. חזור על שלבי 5.4.2 עד 5.4.5 לאחר 5, 24 ו 48 h ולמדוד כל הצינורות ב נגדי γ על פי הפרוטוקול של היצרן. כדי לתקן דעיכה רדיואקטיבית לניתוח כמותי, להשתמש סטנדרט עם מנה מוגדרת של רדיואקטיביות.

6. OVA מושרה DTHR Airway החריף

הערה: דינמיקת ההגירה ודפוסי ביות של שהועברו adoptively ו רדיואקטיבי Cova-TH1 תאים לאתר של דלקת תהיה מדמיינים לכמת במודל חיה עבור מושרה Cova בדרכי נשימה-DTHR 16, 17.

  1. להזריק 8 שבועות בן עכברים BALB / C-IP עם תערובת של 150 μL אלuminum ג'ל / 50 μL Cova-פתרון (10 מיקרוגרם ב 50 μL PBS) לחסן העכברים.
  2. שבועיים לאחר חיסון, להרדים את העכברים עם 100 מ"ג / ק"ג קטמין 5 מ"ג / ק"ג xylazine ידי הזרקת IP. מניחים את עכברי הניסוי על גבם לאט pipet 100 מיקרוגרם Cova מומס 50 μL PBS לתוך הנחיריים של החיות. החיות ינשמו טיפת פתרון אחר טיפה.
  3. חזור אחרי 24 h. עבור זירוזים DTHR בדרכי הנשימה חזק, לחזור שוב לאחר 48 שעות.
  4. כדי לנתח את ההגירה הספציפית של תאי Cova-TH1 הועברו, לגרום-DTHR דרכי נשימה עם טורקיה-או פסיון-OVA שליטה. לכן, חזור על שלבים 6.1-6.3 באמצעות OVA-חלבון בהתאמה.

7. הדמיה vivo באמצעות PET / CT

הערה: in vivo ההדמיה של 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב-שכותרתו Cova-TH1 תאי Cova-DTHR עכברים חולים להמלטה מלאה מדגימים את הביות הספציפית המיילדינמיקת Gration של תאי Cova-TH1. לכן, לרכוש סריקות PET CT סטטי אנטומיים סורק ברצף 3, 24 ו 48 שעות לאחר העברת תא המאמצת.

  1. מיד לאחר radiolabeling, להתאים את Cu-DOTA-KJ1-26-מב-שכותרתו Cova-TH1 התאים 5 x 10 7 תאים / מ"ל להזרקה ip של 10 7 תאים 200 μL 64.
  2. באמצעות מזרק מ"ל 1 ו מחט 30-מד, לצייר 200 μL של 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב-שכותרתו Cova-TH1 תא ההשעיה ו להזריק את התאים IP לתוך החיות Cova-DTHR-חולה בין 4 וה הפטמה ה 5. כדי לקבוע את הסכום הכולל מוזרק של רדיואקטיביות, למדוד את המזרק כיל מנה לפני ואחרי ההזרקה.
  3. להרדים את העכברים, 10 דקות לפני המועד הספיג הרצוי, עם isoflurane 1.5% חמצן 100% (קצב זרימה: 0.7 L / min) בקופסא הרדמה מבוקרת טמפרטורה.
  4. בינתיים, כדי להקל על שיתוף רישוםתמונות PET ו- CT במהלך ניתוח תמונה, לתקן נימי זכוכית המכילות 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב פתרון או חינם 64 CuCl 2 פתרון מתחת למיטת העכבר.
    1. לכן, להכין תמיסה של 0.37 MBq / מ"ל ​​ולמלא נימי זכוכית עם נפח של 10 μL עם הפתרון הזה. מאז אותות רדיואקטיביות תאים שמקורם הוא מטבען חלשים, לא להשתמש בכמויות גבוהות של פעילות כדי לוודא כי הסמנים אינם מפריעים אותות הנגזרות תא בעכברים.
  5. לאחר שהגיע סובלנות כירורגיים, כפי שצוין על ידי האובדן של רפלקס נסיגת פדלים של הגפיים האחוריים, להעביר את העכבר כדי מיטה חיה מחמד-ו CT-תואמת קטנה מצוידת במערכת צינורות מתאימה לשמור הרדמה.
  6. לשתק את העכבר על מיטת החיה הקטנה באמצעות צמר גפן באיספלנית. החל משחת עין כדי למנוע התייבשות של העיניים.
  7. מעביר את מיטת עכבר סורק PET, למרכז את שדה ראייה עם focuים על הריאות ועל לרכוש סריקת PET סטטי 20 דק 'עם חלון האנרגיה של 350-650 keV.
  8. מעביר את מיטת עכבר סורק CT. ויה הסקאוט נוף, למרכז את שדה הראייה על הריאות. לרכוש תמונה CT מישוריים באמצעות 360 תחזיות במהלך סיבוב 360 מעלות במצב "צעד לירות" עם זמן חשיפה של 350 ms ו binning גורם 4.

ניתוח תמונה 8.

  1. לשחזר נתוני הרשימה-mode PET-ידי החלת מקסימיזציה ציפיית משנה סטטיסטי איטרטיבי הורה אלגוריתם 2D (אסם) וסריקות CT לתמונת 3D עם גודל פיקסל של 75 מיקרומטר.
  2. עבור שיתוף רישום תמונה באמצעות תוכנת ניתוח תמונה מתאימה (למשל Inveon מחקר עבודה או Pmod), להשתמש בכלי שיתוף רישום האוטומטיים. אם זה לא מצליח, השתמש נימי הזכוכית מתחת למיטת העכבר כהנחיה לשתף לרשום את תמונות PET ו- CT המשוחזרות מרחבית של צירי, נוף עטרה ועל sagittal.
  3. תקן את תמונות חיות המחמדעבור התפרקות רדיואקטיבית באמצעות החוק דעיכה רדיואקטיבית במחצית במשרה של 64 Cu רדיונוקלידית ב 12.7 h. עבור נורמליזציה תמונה, לבחור תמונה אחת (א) כהפניה ולהתאים את עוצמת התצוגה התמונה בתוכנת ניתוח תמונה בהתאמה.
    1. ניצול הערכי פשוט להגדיר עבור תמונת הפנייה (א), את הפעילות המוזרקת (א) ואת הפעילות המוזרקת עבור תמונות האחרות (X), לנרמל את התמונות האחרות באמצעות המשוואה הבאה: (פעילות מוזרקת (X) / פעילות מוזרקת ( א)) ערכי עוצמת x (א).
  4. צייר כרכי 3D של עניין (VOI) על אות PET המנורמלת של LNs ריאתי perithymic.
  5. לקבוע את המינון אחוז מוזרק לס"מ 3 (% מזהה / ס"מ 3) באמצעות המשוואה הבאה: (ממוצע הפעילות בפעילות VOI / הכוללת את העכבר) x 100. לקבלת הנחיות נוספות לגבי ניתוח תמונה, לראות אזכור 22, 23.

תוצאות

איור 1 מסכם את התיוג של תאי Cova-TH1 עם 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב ואת עיצוב ניסיוני עבור במבחנה במחקרי vivo מכוסים בפרוטוקול זה.

figure-results-370
איור 1: 64 ...

Discussion

פרוטוקול זה מציג שיטה אמינה וקלה radiolabel תאים ביציבות למעקב in vivo על ידי PET. ניצול שיטה זו, תאי Cova-TH1, מבודד והרחיב במבחנה מעכברים התורם, יכול להיות רדיואקטיבי עם 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב ו הביות שלהם היה במעקב של LNs ריאתי perithymic כאתרים של המצגת Cova בתוך Cova מושרה DTHR בדרכי נ...

Disclosures

החוקרים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מודים ד"ר ג'וליה מנהיים, וולטר Ehrlichmann, רמונה Stumm, Funda קיי, דניאל Bukala, מארן Harant כמו גם נטלי Altmeyer על התמיכה במהלך ניתוח ניסויים ונתונים. עבודה זו נתמכה על ידי ורנר סימנס-קרן, DFG דרך SFB685 (פרויקט B6) ומזל (2309-0-0).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
HCl, SuprapurMerck, Darmstadt, Germany1.0031864Cu production
Methanol, SuprapurMerck, Darmstadt, Germany1.0600764Cu production
Isopropanol, SuprapurMerck, Darmstadt, Germany1.010464Cu production
Pt/Ir (90/10) plateÖgussaCustom made64Cu production
PEEK chamberWKLCustom made64Cu production
64NiChemotrade64Cu production
Polygram SIL G/UV 254 plateMacherey-Nagel80502164Cu production
Ion exchange columnBioRadAG1-X864Cu production
Solid state target system for PETtraceWKLcostum made64Cu production
64Cu work-up moduleWKLcostum made64Cu production
Dose calibratorCapintecCRC-25R
PETtrace cyclotronGeneral Electric Medical Systems
DOTA-NHSMacrocyclicsB-280DOTA-conjugation
Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26)Isolated from hybridoma cell cultureDOTA-conjugation
Na2HPO4Sigma-Aldrich71633DOTA-conjugation
H+ Chelex 100Sigma-AldrichC7901DOTA-conjugation
Amicon Ultra-15 filter unitMerck MilliporeUFC910008DOTA-conjugation
Rotipuran ultrapure waterCarl RothHN68.3DOTA-conjugation
Ammonium acetateSigma-Aldrich32301DOTA-conjugation
PBSUniversity TuebingenDOTA-conjugation
Micro Bio-spin P-6 columnBio-Rad Laboratories7326221DOTA-conjugation
Sodium citrateSigma-Aldrich71497DOTA-conjugation
Cyclone Plus PhosphorImager Perkin-ElmerL2250116DOTA-conjugation
DMEMMerck Millipore102568ingredient for T cell medium 
FCSMerck MilliporeS0115/1004Bingredient for T cell medium 
Sodium pyruvateMerck MilliporeL0473ingredient for T cell medium 
MEM-amino acidsMerck MilliporeK0293ingredient for T cell medium 
HEPES Merck MilliporeL 1613ingredient for T cell medium 
 Penicillin/StreptomycinMerck MilliporeA2212ingredient for T cell medium 
0.05 mM 2-β-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148ingredient for T cell medium 
DO11.10 micein-house breedingTH1 cell culture
DPBSGibco14190144TH1 cell culture
Cell strainer 40 µm Corning352340TH1 cell culture
ACK Lysing BufferLonza10-548ETH1 cell culture
CD4 MicroBeads, mouseMiltenyi Biotech130-097-145TH1 cell culture
QuadroMACS separatorMiltenyi Biotech130-090-976TH1 cell culture
LS columnMiltenyi Biotech130-042-401TH1 cell culture
anti-CD4 antibody (Gk1.5)Isolated from hybridoma cell cultureTH1 cell culture
anti-CD8 antibody (5367.2)Isolated from hybridoma cell cultureTH1 cell culture
Anti-rat antibody (MAR18.5)Isolated from hybridoma cell cultureTH1 cell culture
Rabbit complement MAtebu-BioCL3221TH1 cell culture
Anti-IL-4 antibody (11B11)Isolated from hybridoma cell cultureTH1 cell culture
cOVA 323-339-peptide EMC-micro-collectionsCustom orderTH1 cell culture
CPG1668-oligonucleotidesEurofins MWG OperonCustom orderTH1 cell culture
IL-2Novartis65483-116-07TH1 cell culture
96-well platesGreiner 655180TH1 cell culture
24-well platesGreiner 662160TH1 cell culture
cell culture flaskGreiner 660175TH1 cell culture
48-well platesGreiner 677 180cell labeling
Gammacell 1000Best Theratronicsvia inquiry 
Gulmay RT225Gulmayvia inquiry 
Trypan blueMerck MilliporeL6323in vitro evaluation
Mouse IFN-γ ELISABD Biosciences558258in vitro evaluation
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit BD Biosciences559763in vitro evaluation
Tube 5 mLSarstedt55.476in vitro evaluation
Round-bottom tubes BD Biosciences352008in vitro evaluation
Wizard γ-counterPerkin-Elmer2480-0010in vitro evaluation
ELISA Reader MultiscanEXThermo Fisher Scientific51118177in vitro evaluation
MicroscopeLeicavia inquiry in vitro evaluation
BD LSRII BD Biosciencesvia inquiry in vitroevaluation
BALB/c miceCharles River028in vivo cell trafficking
Aluminum gelServa Electrophoresis12261.01in vivo cell trafficking
XylazineBayer HealthCareOrdered via University hospitalin vivo cell trafficking
KetamineRatiopharmOrdered via University hospitalin vivo cell trafficking
IsofluraneCP-PharmaOrdered via University hospitalin vivo cell trafficking
30 G needleBD Biosciences304000in vivo cell trafficking
SyringeBD Biosciences11612491in vivo cell trafficking
Capillaries 10 µLVWR612-2439
Inveon PET scannerSiemens Healthineersno longer availablein vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso 
Inveon SPECT/CT scannerSiemens Healthineersno longer availablein vivo cell trafficking
Inveon Research WorkplaceSiemens Healthineersimage analysis, alternative software: Pmod

References

  1. Cerri, S., et al. Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson's Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects. Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).
  2. Hasenbach, K., et al. Monitoring the glioma tropism of bone marrow-derived progenitor cells by 2-photon laser scanning microscopy and positron emission tomography. Neuro Oncol. 14 (4), 471-481 (2012).
  3. Sood, V., et al. Biodistribution of 18F-FDG-Labeled Autologous Bone Marrow – Derived Stem Cells in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus. Clin Nucl Med. 40 (9), 697-700 (2015).
  4. Perez-Diez, A., et al. CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells. Blood. 109 (12), 5346-5354 (2007).
  5. Muranski, P., Restifo, N. P. Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells. Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).
  6. Braumuller, H., et al. T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence. Nature. 494 (7437), 361-365 (2013).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
  8. Cherry, S. R. Fundamentals of Positron Emission Tomography and Applications in Preclinical Drug Development. J. Clin. Pharmacol. 41 (5), 482-491 (2001).
  9. Tavaré, R., et al. An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy. Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).
  10. Tavaré, R., et al. Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).
  11. Dobrenkov, K., et al. Monitoring the Efficacy of Adoptively Transferred Prostate Cancer-Targeted Human T Lymphocytes with PET and Bioluminescence Imaging. J Nucl Med. 49 (7), 1162-1170 (2008).
  12. Rini, J. N., et al. PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection. Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).
  13. Ritchie, D., et al. In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).
  14. Adonai, N., et al. Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).
  15. Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging. Mol. Imaging. 7 (1), (2008).
  16. Griessinger, C. M., et al. In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue. J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).
  17. Griessinger, C. M., et al. 64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).
  18. McCarthy, D. W., et al. Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron. Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).
  19. Kalkhof, S., Sinz, A. Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters. Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).
  20. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, ., J, Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
  21. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
  22. Judenhofer, M., Wiehr, S., Kukuk, D., Fischer, K., Pichler, B. Chapter 363. Small Animal Imaging. Basics and Practical Guide. , 363-370 (2011).
  23. Phelps, M. E. . PET. Molecular Imaging and Its Biological Applications. , 93-101 (2004).
  24. Wu, A. M. Antibodies and Antimatter: The Resurgence of Immuno-PET. JNM. 50 (1), 2-5 (2009).
  25. Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. J Nucl Med. 44 (8), 1284-1292 (2003).
  26. Boswell, C. A., et al. Comparative in vivo stability of copper-64-labeled cross-bridged and conventional tetraazamacrocyclic complexes. J Med Chem. 47 (6), 1465-1474 (2004).
  27. Ghosh, S. C., et al. Comparison of DOTA and NODAGA as chelators for (64)Cu-labeled immunoconjugates. Nucl Med Biol. 42 (2), 177-183 (2015).
  28. Johnson, T. E., Birky, B. K. . Health Physics and Radiological Health. , (2011).
  29. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Meth. 2 (12), 932-940 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

122In vivoPET CTT TH1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved