JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מתאר שיטה למדידת alloreactivity באוכלוסייה מעורבת של תאי T באמצעות זרימת הדמית cytometry.

Abstract

מדידת תגובתיות אימונולוגיים לאנטיגנים התורמים במושתלים צפויה להיות מכריע עבור ההפחתה המוצלחת או הנסיגה של דיכוי חיסוני. התגובה לויקוציטים מעורבת (לקה"ע), מבחני דילול מגבילים, וכן רגישות יתר טרנס-vivo מתעכב-סוג (DTH) assay יש כל הוחלו על שאלה זו, אך שיטות אלו מוגבלים ביכולת חיזוי ו / או מגבלות מעשיות משמעותיות המפחיתים השימושיות שלהם. זרימת הדמיה cytometry היא טכניקה המשלבת כוחות כמותיים multiparametric של זרימת cytometry עם יכולות הדמיה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחרונה ערכנו שימוש בגישת cytometry זרימת הדמיה להגדיר את חלקם של תאי נמען T מסוגלים ליצור סינפסות חיסונית בוגרת עם תאי תורם מציגי אנטיגן (נגמ"שים). באמצעות מודל השתלת לב עכבר מאופיין היטב, הראינו כי התדירות של סינפסות במבחנה חיסונית בקרב T-APC membrקשר Ane אירועי תוצאה חזוי של שתל חזק דחייה, סובלנות, לבין מצב בו הישרדות השתלת תלוי תא T רגולטוריים מושרה. תדירות הקשר T-APC גדל עם תאי T מעכברים במהלך דחייה חריפה וירידה עם תאי T מעכברים שניתנו מגיב alloantigen. התוספת של תאי T רגולטוריים למערכת במבחנה מופחתת קשר T-APC ממושכת. האנושות, האפקט הזה גם נתפס עם polyclonally האנושית התרחבה, המתרחש בתאי T רגולטוריים טבעי, אשר ידוע לשלוט דחיית רקמות אנושיות בעכברי מודל אנושי. פיתוח נוסף של גישה זו עשויה לאפשר אפיון מעמיק יותר של תא T-cell alloreactive במושתלים. בעתיד, התפתחות נוספת והערכה של שיטה זו באמצעות תאים אנושיים עשויות להוות בסיס מבחנים משמשים לבחירת חולים למזעור דיכוי חיסוני, וזה יכול לשמש כדי למדוד את ההשפעה של tolerogenIC טיפול בעזרת במרפאה.

Introduction

השתלת איברים Solid שינתה את הטיפול בחולים עם מחלות סופנית של כליות, כבד, לב, ריאות ו. בשל הפערים אנטיגנים histocompatibility ראשיות ומשניות, אולם, allografts נדחות מיד על ידי תאי T הנמען אם בתרופות המדכאות אינם בשימוש. יש סוכנים אלו תופעות לוואי רבות, כולל הסיכונים לסרטן ובעיות בתפקוד האיבר. מטרה קלינית עיקרית היא אפוא להפחית את המינון של דיכוי חיסוני לרמה המינימאלית הנדרשת כדי למנוע דחייה של שתל. רמה זו עשויה להשתנות בהתאם למידת ההפעלה של מערכת החיסון המולדת; מידת התאמת alloantigen התורם-נמען; והבדלים-החולה השאר בתפקוד המערכת החיסונית, פרמקוקינטיקה, ו פרמקודינמיקה.

לצערנו, טפל השתלה אין כלים כלשהם להערכת תגובתיות תורמת במדויק בחולים בודדים 1. מעורבתתגובה לויקוציטים (לקה"ע) יכולה לזהות תגובתיות תורמת, אבל זה לא מצליח לחזות 2 תוצאה שתל בצורה מהימנה, 3. מבחני דילול הגבלה, ELISPOTs ציטוקינים, ואת assay טרנס-vivo או למדוד מגוון מוגבל של תגובות או אינן מעשיות 4, 5, 6, 7, 8 פרופילי ביטוי .Gene יש חתימות חשף הקשורים סובלנות מבצעית 9, 10, 11, 12 ודחיית 13, 14, 15, אך אלה אינם תמיד להכליל על פני אוכלוסיות 16 ועלולים בסופו של דבר מוגבל תועלת בחולים בודדים. analy רצף מבוססSES של קולטן T-cell (TCR) של תאי T בדם ההיקפי 17 או מתרבה במהירות 18 לקה"ע גם פותח אך דורש אימות נוספת.

מבחינה מושגית, רצוי להיות בעל assay שמזהה את הצעדים הנדרשים המוקדמים הפעלת נמען תא T על ידי אנטיגן תורם. מאז culturing תא על פני ימים (כמו לקה"ע) יכול להציג חפצים, מבחן כזה אידיאלי לא יצריך המדידה של אירועים במורד זרם, כגון התפשטות או פונקציה מפעילה. באותה מידה, לעומת זאת, זה היה גם רצוי למבחן לסמוך על אלמנט כלשהו של תפקוד תאי T, שכן הערכות תיאורי גרידא (למשל, סידור TCR) ייתכן שלא תוכל להבחין בין תאי T anergic ופונקציונלי.

מחקרים רבים הראו כי מגע ממושך T-APC נדרש היווצרות סינפסה חיסונית, אשר מהווה הראשון חיוניצעד בתגובת תאי T 19, 20, 21, 22. אנחנו לאחרונה דווח כי, במהלך דינמי הדמיה זמן לשגות במבחנה, על 5 - 10% של העכבר CD4 + T לתאים ליצור קשרים ארוכי טווח עם תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם אלוגנאית (BMDCs) 23. תדירות המגע ממושך הוגדלה בחיות כי דחו שתל, ואילו עכברים שניתנו בעבר סובלני לאותם אנטיגנים, זה נשאר ברמות לראות עכברי untransplanted 23. אינטראקציות ממושכות הופחתו בנוכחות הנמען Tregs וגדילה בהיעדרם, ואנחנו דומים נצפו תופעות באמצעות תאי T אנושיים DCS-נגזר מונוציטים אלוגנאית (MoDCs) 23.

עם זאת, ספירת קשר ממושך הנעשית בתוך populatio polyclonal T-celln הוא זמן רב ועבודה אינטנסיבית. אנחנו ולכן הסתייענו הדמית תזרים cytometry לבחון היווצרות הסינפסה חיסונית אלוגנאית. זרימת הדמית cytometry משלבת את יכולות רכישת וניתוח נתוני multiparametric של זרימה קונבנציונלית cytometry עם יכולות הדמית תא הבודד של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. טכניקה זו שימשה חוקרים אחרים ללמוד היווצרות סינפסה החיסונית על ידי תאי T מונוקלונלי 24, 26, 27 או בנוכחות סופר-אנטיגנים 28. בנסיבות כאלו, אולם, תדירות תאי T מגיבים נע בין 30-100%, ואילו alloreactive תאי T מוערכים בדרך כלל לייצג 5-15% מכלל הרפרטואר T-cell הכולל 29, 30, 31, 32. חשוב לציין, הראינו כי זרימת הדמיה cytometry יכול לייצר avery מידה דומה של alloreactive תדירות T-cell 23 וכי שינויים בתדירות סינפסה בתוך אוכלוסיית polyclonal תאי T הם חזויים של תוצאה שתל 23. נכון לעכשיו, גישה זו כבר מותאמת למדידת alloreactivity הישירה של תאי CD4 + T, אבל, באופן עקרוני, זה יכול להיות גם פתח לבחון תאי CD8 + T ואת המסלול העקיף. העקיף alloreactivity הוא האמין להיות רלוונטי יותר ויותר בזמנים יותר לאחר השתלת 33. אנו מפתחים בימים אלה בשיטה זו כדי להשתמש בתאי אדם, אשר ייאפשרו לבדיקה בחולים. לפיכך, בעתיד, הגישה הכללית עשויה להיות שימושית עבור ההערכה התפקודית של תגובות תאי T במושתלים לפני ההשתלה; מייד לאחר השתלה; וגם לטווח הארוך, כאשר מזעור סמים הופך מטרה חשובה.

Protocol

1. כן ריאגנטים נדרש חומרים

  1. הכן בופר פוספט (PBS) המכיל 2% בסרום שור העובר (FBS) ( "לשטוף חיץ"). הכן PBS עם 2 FCS% המכיל 0.1% אבקת nonionic ( "חיץ פרם-לשטוף"; ראו טבלה של חומרים). כן PBS עם 1.5% פורמלדהיד.
    הערה: זהירות! פורמלדהיד הוא מאכל קרצינוגני פוטנציאלי ויש לטפל תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים.
  2. כן PBS המכיל FBS 2% ו 0.5 מ"מ חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) עבור פרדת תא מגנטי ( "חיץ MCS").
  3. הכן 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​isothiocyanate phalloidin-והעמסת (Phalloidin-FITC) ב sulfoxide דימתיל (DMSO). הכן כתם 1 מ"ג / מ"ל גרעיני (למשל 1 מ"ג / מ"ל 7-aminoactinomycin D (7-AAD) ב צבע DMSO או BIS-benzimide; ראו טבלה של חומרים) ב DMSO. כן נוגדנים שכותרתו fluorochrome מתאימים התאים של ענייןההדמיה לזרום cytometer.
  4. השג ברקמות בעלי חיים (למשל, בלוטות לימפה וטחול) כמקור לתאי T ורקמות חיה אלוגנאית (למשל, טחול ומח עצם) כמקור תאים מציגי אנטיגן או אבות.
  5. הכן תרבית תאים בינוניים (למשל, בינוני מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 או בינוני הנשר Modified של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% FBS), 50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, פניצילין, ו סטרפטומיצין ולקבל 24- ו / או 96 גם צלחות תרבית תאים.

2. כן Antigen-הצגת תאים

הערה: בתאוריה, כל אוכלוסיית APC יכולה להיבחן בשיטה זו. תאי דנדריטים עכבר עצם שמקורם במח מפותח (DCS) כמו נגמ"שים נתבעו במקרה הזה. פרוטוקולים רבים קיימים ליצירת תאים אלה (למשל, הערות 34 ו 35). בקצרה, שימש בפרוטוקול הבא.

  1. מח Flush מן עצמות הירך לבין שוקיים לתוך סל"דואני 1640 או DMEM.
  2. להעביר את התא המושעה דרך מסננת תא 70 מיקרומטר להסיר חתיכות קטנות של עצם ופסולת.
  3. גלולת התאים על ידי צנטריפוגה ולאחר מכן lyse תאים אדומים באמצעות חיץ אמוניום כלוריד עבור 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  4. גלולת התאים על ידי צנטריפוגה (400 XG, 5 דק ') מחדש להשעות את התא גלול.
  5. לשטוף התאים 5 - 10 מ"ל של חיץ לשטוף, גלולה ידי צנטריפוגה (400 XG, 5 דק '), מחדש להשעות את התא גלולה.
  6. העשר מבשרי hematopoietic מעל טור ההפרדה התא על ידי סימון תאים עם biotinylated אנטי CD3 (5 מיקרוגרם / מ"ל), אנטי-B220 (5 מיקרוגרם / מ"ל), בכיתה אנטי MHC II (1 מיקרוגרם / מ"ל), ו-CD11b האנטי (5 מיקרוגרם / מ"ל) נוגדנים.
  7. גלולת התאים על ידי צנטריפוגה (400 XG, 5 דק ') מחדש להשעות את התא גלול.
  8. דגירה התאים עם microbeads מגנטי אנטי ביוטין (ראו טבלה של חומרים) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  9. לשטוף גלולה התאים (400 XG, 5 דק ') מחדש suspenד אותם 1 מ"ל של MCS חיץ לפני הסרת תאים שכותרתו באמצעות מבחר חיובי גדול (LS) טור הפרדה תא מגנטי דרוך עם 3 מ"ל של חיץ MCS והושמו מגנט שלה. לשטוף את העמודה 3 פעמים עם 3 מ"ל של חיץ MCS; את הזרימה דרך יכיל את התאים הרצויים.
  10. המושבה-מגרה גורם התרבות התאים שעוברים דרך עמודה במשך 6 ימים ב RPMI 1640 או DMEM בתוספת 2 ng / מקרופאג גרנולוציט העכבר רקומביננטי מ"ל (GM-CSF) ו 2 ng / mL של β1 גורם צמיחה והפיכת אנושי רקומביננטי (TGFβ1) . החלף מחצית בינונית כל 2 ימים עם בינוני שלם טרי המכיל 2 ng / mL GM-CSF ו- TGFβ1.
    הערה: האדם TGFβ1 יש פעילות בתאי עכבר. נתונים שנוצרו באמצעות DCs בשלה אלה. תאים אחרים (למשל, B תאי DCs הבוגרת) עשויים להיות מתאימים כמו נגמ"שים אך לא נבדקו assay זה.
  11. Cryopreserve DCs ב 90% בסרום / 10% DMSO וחנות בחנקן נוזלי; להתאושש עלהיום שימוש. לפני השימוש, לספור את מספר DCs קיימא hemocytometer באמצעות הרחקה trypan כחול. Re- להשעות את התא גלולה במדיום תרבות בצפיפות המתאימה (ראה שלב 4.1) לפני השימוש בסעיף 4.

3. כן תאי T

  1. השתמש בשיטות סלקציה שליליות, כדי למנוע העברת אותות הפעלה או מעכבות בטעות את התאים.
    הערה: בדוגמה זו, CD4 + T תאים מוכנים לניתוח.
    1. כדי להכין תאים מסוג CD4 + T מן הטחול עכבר, ומועכים את הטחול דרך מסננת תא 70 מיקרומטר באמצעות הבוכנה של המזרק. שטוף את התא מסנן עם חיץ לשטוף.
    2. גלולה התאים מושעה על ידי צנטריפוגה (400 XG, 5 דקות) ולאחר מכן lyse התאים האדומים ידי מחדש השעיית גלולה ב חוצץ אמוניום כלוריד עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. גלולת התאים על ידי צנטריפוגה (400 XG, 5 דק ') מחדש להשעות הגלולה.
    4. לשטוף את התאים ב 5 - 10 מ"ל של חיץ לשטוף גלולה ידי צנטריפוגה (400 XG, 5 דק '). Re- להשעות את הגלולה.
    5. כתם התאים עם נוגדני biotinylated ל CD8, בכיתה מורכבת histocompatibility הגדולה II (MHC II, 1 מיקרוגרם / מיליליטר), ו CD19 (5 מיקרוגרם / מיליליטר). דגירה של 10 דקות ב 4 °.
    6. שוטפים את התאים ב 10 מ"ל של חיץ לשטוף גלולה ידי צנטריפוגה (400 XG, 5 דק '). Re- להשעות את הגלולה.
    7. דגירה התאים עם microbeads מגנטי אנטי ביוטין (ראו טבלה של חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
    8. שוטפים את התאים ב 10 מ"ל של חיץ לשטוף גלולה ידי צנטריפוגה (400 XG, 5 דק '); מחדש להשעות את הגלולה.
    9. Re- להשעות את התאים 1 מ"ל של חיץ MCS ולהעשיר את תאי CD4 + T מעל טור הפרדה תא מגנטי דרוך עם 3 מ"ל של MCS חיץ על מגנט. לשטוף את העמודה 3 פעמים עם 3 מ"ל של חיץ MCS. זרימה דרך טור יכיל את תאי T המועשרים.
  2. By cytome זרימה הסטנדרטיתלנסות, להעריך טוהר תא T באמצעות aliquot של התאים שנבחרו באופן שלילי. הכתם התאים באמצעות המצומד streptavidin-fluorochrome (כדי לזהות כל התאים שכותרתו ביוטין כי צריך להיות מודח על עמודה) ו נוגדן או נוגדנים כדי לזהות את אוכלוסיית תאי T של עניין (CD4 במקרה זה); טוהר של ≥85% הוא 23 מקובל.
    1. ספירת תאי T בתוך hemocytometer על ידי הרחקת trypan הכחולה (כדאי ≥90% מקובלות).
      הערה: MCS חיץ מכיל EDTA, שיש להסירה לפני assay. כדי להשיג זאת, גלולה התאים על ידי צנטריפוגה (400 XG, 5 דק ') ולשטוף 1 מ"ל של חיץ לשטוף. גלולת התאים שוב (400 XG, 5 דק ') מחדש להשעות במדיום התרבות בצפיפות המתאימה (ראה שלב 4.1).

4. Co-דגירה תאים ו DCs T

  1. תאי T Seed ו- DCs בכל 2: יחס DC בתוך צלחת תרבית תאים 24-היטב או 96-היטב: 1 T. להבטיח ש נפח התרבות הסופי הוא ≤500 μL עבור צלחות 24-היטב או ≤50 μL עבור צלחות 96-היטב.
    הערה: כמויות קטנות יותר לעודד אינטראקציות תא-תא ולאפשר מרחב חיץ קיבוע עוקב.
    1. התאם מספרים סלולריים מדויקת באופן אמפירי, אבל כהנחיה כללית, להשתמש 1 x 10 6 ותאי T 0.5 x 10 6 DCs בכל טוב (צלחת 96-היטב). אלה צריכים להיחשב מספרי המינימום של תאים, כי באמצעות פחות תאים עושה ספירה של סינפסות חיסונית קשה.
      1. כדי להגדיל את מספרי תא, להגדיר בארות לשכפל וברכה אחרי צעד 5 (קיבוע).
        הערה: בעת הגדרת בארות לשכפל, מומלץ לזרוע DCs בכל הבארות הראשונות ולאחר מכן זרע T תאים בכל הבארות; זה מצמצם פערים בזמן דגירה בין בארות.
  2. דגירה את הצלחת על 4 שעות ב 37 ° C באווירה 2 5% CO.
e_title "> 5. תקן תאי פלייט

  1. להוסיף 3 פעמים את נפח תרבות של פורמלדהיד 1.5% ב PBS היטב כל דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות; TT חשוב לתקן תאים לפני הוצאתם הצלחת כדי למזער את ההפרעה של תאי תאי אינטראקציות.
  2. העבר תאים בצלחת לתוך צינורות לרחצה מכתים שלאחר מכן. בשלב זה, להפריש תאים נוספים עבור פקדים חד כתמים. מלבד פקדים אלה, התרבות כולה צריכה להיות מוכתם עם קוקטייל של נוגדנים (ראה שלב 4.1.1).

6. תאי Stain

  1. הכתם התאים 100 μL של חיץ לשטוף המכיל קוקטייל של נוגדנים fluorochrome- מצומדות הרצוי עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
    הערה: הקוקטייל כולל נוגדני T תא ספציפי APC-ספציפי. Fluorochromes יש לבחור כזה שהם ניתן להבחין באמצעות התצורה של הדמיה לזרום cytometer. בשנת tניסויים שהוא מוצג כאן, מצומדות fluorophore כחול CD11b (5 מיקרוגרם / מ"ל, ראה טבלת חומרים) ו CD90.2 APC מצומדות (5 מיקרוגרם / מ"ל) שימשו.
  2. שוטפים את התאים ב 1 מ"ל של חיץ צנטריפוגות לשטוף עבור 5 דקות ב 400 x גרם. למזוג supernatant. Re- להשעות התאים חיץ פרם-לשטוף המכיל phalloidin FITC ב 0.05-0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור.
    הערה: ריכוזי FITC Phalloidin של כ 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר פועלים היטב עבור תאי עכבר, אבל הריכוז המתאים צפוי להשתנות לפי ספק, סוג התא, וכן הדמיה לזרום cytometer.
  3. שוטפים את התאים ב 1 מ"ל של חיץ פרם / לשטוף צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g x 400. למזוג supernatant. Re- להשעות התאים חיץ פרם / לשטוף המכילים צבע גרעיני בריכוז המתאים (למשל, כ 25 מיקרוגרם / מ"ל 7-AAD) דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור.
  4. לשטוף את התאים ב 1 מ"ל של חיץ פרם / לשטוף צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 400 גרם x. למזוג supernatant. שוטפים את התאים פעם לשטוף חיץ, גלולה, מחדש להשעות ב 50 - 100 μL של חיץ לשטוף, העברת התאים צינורות microcentrifuge קטן, כתרים.
  5. המשך נתוני רכישה מייד או לאחסן את התאים ב 4 ° C מוגן מפני אור עד כמה ימים לפני רכישה על ההדמיה לזרום cytometer.
    הערה: תאים שאוחסנו בהצלחה בדרך זו עד 7 ימים. אחסון ארוך עשוי להיות אפשרי אך לא נבדק.

רוכש 7. נתונים

  1. אתחל ולהגדיר את זרימת הדמיה cytometer פי הוראות היצרן. ודא יציבות ליבת הזרימה לפני איסוף נתונים כלשהם.
  2. שמורת ערוץ אחד עבור רכישת תמונת brightfield. רוכש את נתוני בקרה יחיד-כתם עם ערוץ brightfield כבוי.
    1. לחץ על כפתור "Load" ו- inseרט צינור המכיל מדגם צבעוני מלא (מדגם כי כבר מוכתם כל fluorochromes החובה) לתוך המחזיק.
    2. בחלון "סביבת העבודה", לבחור וליצור scatterplot חדש עם יחס הרוחב-גובה מעל singlets באזור השער שבו יחס הממדים קרוב 1. צור scatterplot חדש עבור כל ערוץ בשימוש (עוצמת ערוץ הציר האופקי) .
    3. עבור כל fluorochrome, לבדוק את האוכלוסייה חיובית, אם נדרש, להתאים את מתח לייזר בתיבה "הארה".
    4. הוצא את הצינור לטעון את הצינור היחיד המוכתם הראשון.
    5. בתיבת "גדרות רכישה", הקלד את השם המדגם ולהגדיר את מספר האירועים יש לאסוף; אם זה כתם יחיד (עבור פקדי פיצויים), 1000 - 2000 אירועים מספיקים.
    6. בתיבה "ערוצים", לבחור את הערוצים כל דגימה כבר מוכתם. עבור פקדים חד כתם, כל הערוצים יש לבחור עם brightfIELD וצד פיזור off. לחץ על כפתור "הקלט" תחת תיבת "רכישה"; כאשר מספר האירועים יגיע לסף המסוים, רכישה תפסיק אוטומטית.
    7. לחץ על כפתור "חזור" כדי לפרוק את הצינור. חזור על שלבים 7.2.4 - 7.2.6 עבור כל פקד יחיד כתם. בהתאם cytometer ותוכנה, זה לא יכול להיות אפשרי להגדיר את כל השערים שמוצג באיור 1 במהלך הרכישה (gating מדויק יותר מבוצע במהלך הניתוח; ראו סעיף 8).
  3. רוכש את הדגימות כפי עבור דגימות יחידות צבעוני (בשלב 7.2), אבל בתיבת "הערוצים", לבחור את כל הערוצים נדרשים, כולל ערוץ brightfield.
    1. לפני הקלטת נתונים, לבדוק כדי לאשר את עוצמת הערוץ מתאימה לשימוש לצורך זיהוי אוכלוסיות התאים הרצויים. אם לא, להתאים את הגדרות ליזר מחדש שיא שולט חד כתם להשתמש בהגדרות החדשות, כפי שמתואר בשלב 7.2.
    2. לכל אחדהמדגם, לרכוש כמה עשרות אלפי אירועים.
      הערה: תחת רוב התנאים, תא-תא אירועי מגע הם מיעוט קטן של מספר התא הכולל (רובם תאים בודדים). באופן כללי, רצוי שיהיו לפחות 100 אירועים בשער מגע קרום הסופי.

8. לנתח את הנתונים

  1. לנתח את הנתונים רכשה על זרימת הדמיה cytometer באמצעות תוכנה אנליטיים זמין בחינם מאתר האינטרנט של היצרן (חשבון משתמש חייב להיווצר; ראו טבלה של חומרים).

figure-protocol-13913
איור 1. Gating אסטרטגיה המשמשת לזיהוי Alloreactive חיסון סינפסות. In-פוקוס א אירועים מגודרים מכל האירועים על ידי סקירת תמונות תא המבוססות על שורש ממוצע הריבועים של שיעור השינוי של הפרופיל העוצם תמונה (Gradient RMS) באמצעות brightfield צ'אןנל (ערוץ 4, Ch04), כפי שמתואר בטקסט. B. בין האירועים-פוקוס, כפילויות נבדלים תאים בודדים על ידי התוויית יחס גובה מול אזור לערוץ brightfield. תאים בודדים מקובצים קרובים היחס של 1 ויש לי שטח קטן יותר, בעוד כפילויות שקרובות 0.5 ויש שטח גדול יותר. ג. עוצמת קרינה של APC (במקרה הזה, תא דנדריטים [DC] סמן, CD11c) הוא זמם אז נגד עוצמת קרינה של סמן T-cell (במקרה זה, CD90.2), ואירועי פעמים חיוביות הם מגודרים. גבולות של השער יכול להיות מעודן על ידי עיון בתמונות של אירועים ליד הגבולות. ד כפילויות T-APC הם מעודנים אז כך שהם מכילים רק אחד APC ידי התוויית יחס גובה מול אזור של הסמן APC (CD11c, Ch02). כפילויות חד APC E. אלה מעודנים אז כך שהם מכילים רק תא T אחד על ידי התוויית יחס הגובה מול האזורמרקר T-cell (CD90.2, Ch06). פ לבסוף, אירועים המכילים רק שני גרעינים נבחרים על ידי התוויית היסטוגרמה של ספירת הנקודה בערוץ הכתם הגרעיני (7-AAD, Ch05) ו gating אירועים המכילים רק 2 נקודות 7-AAD-חיוביות (כלומר, גרעינים). אירועי השער הזה מנותחים קשר הממברנה היווצרות הסינפסה, כמתואר באיור 2. הנתונים נותחו בצורה עיוורת לגבי משימת טיפול והם מניסוי שפורסם בעבר 23. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

הערה: אסטרטגית gating מתוארת בסעיף זה מתואר באיור 1. ניתוח של תזרים הדמית cytometry נתונים צריכה להתבצע בצורה עיוורת לגבי משימת טיפול. למרות שאנו סבורים סינפסות החיסונית הלא synaptiמגעים ג כלל נבדלים בקלות (ראה להלן ומספרי 2 ו 3), מסנוור צריך למזער את ההטיה נובעת הסובייקטיביות הטבועה ניתוח תמונה.

  1. צור מטריצת פיצויים על ידי טעינת קבצי נתוני בקרה היחיד-כתם לתוך אשף הפיצוי. לאחר טעינת הקבצים חד צבעוני, לבחור את ערוצי הניאון השתמשו בניסוי.
    הערה: התוכנה יוצרת מטריצת פיצוי אוטומטית, אבל זה צריך להיות מאומת באופן ידני כדי להבטיח כי האוכלוסיות החיוביות הנכונות נבחרו.
    1. לחץ פעמים על ערך במטריצה ​​ולהוסיף הגרף באזור הניתוח. צור שער חדש במידת צורך להוציא את כל תאים מתים / כפילויות / חיוביות שגויות; האוכלוסייה החיובית המעודנת החדשה הזו ניתן לבחור בתיבת מטריקס ב תפריט הנפתח עבור כל ערוץ.
    2. חזור על פעולה זו עבור כל ערוץ. לחץ על "סיום" כדי להציל את compensatioמטריקס n (קובץ .ctm).
  2. השג קובץ ניתוח נתונים (.daf) מקובץ הגלם (.rif) על ידי טעינת קובץ .rif לתוך תוכנת ניתוח ויישום מטריצת הפיצוי.
  3. לאחר הנתונים נטענים, לבצע gating לזהות T תא-APC אירועים מגע.
    הערה: אסטרטגית gating טיפוסית כרוכה בזיהוי ב-מוקד אירועים, בחירת כפילויות על פי קריטריוני גודל (באזור לעומת יחס של האירוע), ובחירת T תא-APC כפילויות כאירועים שהם פעמים חיוביות עבור T-cell סמני APC (איור 1A-C).
    הערה: יחס ההיבט הוא היחס בין הרוחב של אירוע בשיאה, המאפשר אפליה של תאים בודדים (יחס קרוב 1) מן הכפילויות (יחס קרוב 0.5).
  4. זהה אירועים ב-פוקוס על ידי התוויית שורש ממוצע הריבועים של שיעור השינוי של הפרופיל העוצם הדמיה (RMS שיפוע) בערוץ brightfield (איור 1A). לחץ על ההיסטוגרמה דואר שיפוע RMS כדי להציג אירועי תא פחי פרט ולאחר מכן למקם שער למעט מחוץ מוקד אירועים.
  5. מגרש בשטח מול יחס הממדים של ערוץ brightfield ולהסיק שער שמזהה כפילויות מבוססות על צורת אירוע וגודל (איור 1B). סקירה של תמונות של אירועים ממש בתוך ומחוץ לגבול של השער הזה יכול לעזור האנליסט כדי לחדד את הגודל והמיקום של השער. ואז, לבנות עלילה של אירועים כפיל אלה שבהם עוצמת סמן תא T מופיע על ציר אחד ואת האינטנסיביות של הסמן APC מופיע על אחרים. צייר שער כפיל T-APC המכיל אירועים חיוביים עבור שני הסמנים.
  6. בין אירועי הכפיל T התא-APC, אירועים נבחרים המכילים רק תא T אחד ואחד APC.
    1. לעשות זאת על ידי התוויית יחס גובה מול אזור לסמן APC ועל ידי gating על כפילויות המכיל יחיד APC (איור 1D). שרטט את יחס הממדים לעומת שטח עבור הסימן T-cellאה ושער על כפילויות המכיל תא T יחיד (איור 1E).
      הערה: חידוד נוסף ניתן להשיג על ידי התוויית היסטוגרמה של פונקצית נקודת ספירה כפי שהוחל קרינת gating גרעיניות כתם על אירועים עם רק שתי נקודות (איור 1F).
  7. במקרים מסוימים, שני התאים בתוך כפיל לא יהיו במגע; כדי לזהות תאים במגע אחד עם השני, להגדיר מסכות אובייקט עבור נגמ"שים ותאי T.
    1. השתמש באפשרות "מסכות" בתפריט הניתוח כדי לפתוח את מנהל המסכות ולהגדיר מסכה חדשה. הקלד שם, כגון "מסכת אובייקט T-cell." לחץ על כפתור "פונקציה", ובתיבת הדו-שיח, לבחור "אובייקט".
    2. בחר את הערוץ שבו סמן T-cell מזוהה (למשל, Ch06). לחץ על "אישור".
      הערה: "Object (M06, Ch06, צמודה)" מוצגת בתיבת הפונקציה. מסכת אובייקט מחדל זה בדרך כלל worKS היטב אך עשויים לדרוש אופטימיזציה.
    3. חזור על תהליך זה כדי ליצור מסכת אובייקט APC בערוץ המתאים.
  8. לאחר זיהוי מסכות APC ו- T-cell, לקבוע קשר קרום ידי התוויית עוצמת קרינת סמן T-cell במסכת אובייקט APC נגד עוצמת קרינת APC במסכת אובייקט T-cell. על מגרש זה, לצייר שער הכולל תאים רק במגע אחד עם השני.
    הערה: בדרך כלל, יש די ברורות פעמים חיוביות פעמים שליליות אוכלוסיות (איור 2 א). הגבול בין אוכלוסיות פעמים חיוביות פעמים שליליות יכול להיות מוגדר על ידי עיון בתמונות brightfield של תאים באזור הגבול כדי להבטיח כי תאים במגע הם בתוך השער שתאים לא במגע אינם נכללים.
  9. בשלב זה, באופן ידני לסקור את התמונות FITC phalloidin של אירועים בתוך השער הזה להבחין סינפסות החיסונית בוגרת ממגע תאים תאים פשוטים. Use הפונקציה "תמונות תג" כדי לסמן את התמונות האלה.
    הערה: אחוז האירועים המתויגים (סינפסות חיסונית) בתוך השער הזה יכול לשמש כמדד alloreactivity הישיר באוכלוסיית T-cell נלמדת.

תוצאות

שיטה זו שימשה לחקור CD4 + T-cell alloreactivity בעכברים שניתנו סובלנית כדי alloantigens התורם לפני השתלה שתל לב heterotopic. עכברים CBA (H-2 k) קיבלו פרוטוקול tolerizing המורכב עירוי דם מתורם ספציפי (B6, H-2 ב) בשילוב עם נוגדנים CD4 שאינם מדלדלים חודש אחד לפני שעבר השתלת לב B6. תוצאות פרוטוקול זה בהישרדות השתל לטווח ארוך כי הוא תלוי Foxp3 + תאי T רגולטוריים 36, 37. שבעה ימים לאחר השתלה, תאי טחול CD4 + T התקבלו tolerized ומקבלים הלא tolerized של allografts לב B6 והיו שיתוף וטופח עם DCS-מוח העצמות נגזרות B6 פי פרוטוקול זה. איור 2 מציג נתוני נציג מניסוי זה. שער מגע הקרום מוצג באיור 2A, עם דגש הכוונת ירוק על אירוע הסינפטי (בחלונית השמאלית, 1) ועל אירוע בלתי הסינפטי (פאנל מימין). איור 2B מראה את ערוצי brightfield הקרינה עבור אירוע זה. כדי לצמצם הטיה, נתונים נותחו על ידי משקיף מסונוורים משימת טיפול 23. כפי שניתן לראות מספר דוגמאות באיור 3, הן מן הלא-tolerized (איור 3A-B) ו tolerized (איור 3 ג-ד) מקבלי CBA של לבבות B6, סינפסות הם להבחין בקלות בין המגעים הלא-סינפטי על ידי נוכחות של רכס FITC חיובי צפוף בממשק T-APC. תוצאות אלו מראות כי זיהוי ויזואלי של סינפסות חיסונית שנעשתה על ידי תאי T נמען מסלולים עם מידת alloreactivity של הנמען.

figure-results-1611
זיהוי איור 2. T-APC כפילויות עם ממברנהקונטאקט היווצרות הסינפסה חיסון. אירועים בשער כפיל הסופי (איור 1F) מנותחים. א T-cell מסמן קרינת מסכת אובייקט APC זממה נגד קרינת סמן APC במסכת אובייקט DC. כמה אירועי כפיל יש נגמ"ש ו תא T בלי קשר תא-תא מופיעים בפינה השמאלית התחתונה של העלילה (תמונות לא מוצגות). שער קשר קרום מכאן ניתן להסיק כי כוללת רק כפילויות שבו T תאים ונגמ"שים נמצאים בקשר. תמונות של כל אירוע השער הזה נבחנות לצורך עדות התארגנות cytoskeletal יקטין בערוץ phalloidin-FITC והוא יכול להיות מתויג באמצעות תוכנת הניתוח. הלוח השמאלי מציין אירוע סינפסה חיסוני (שכותרתו 1 והצביע על ידי כוונת ירוקה), ואילו בפנל ממני מציין אירוע מגע קרום ללא היווצרות הסינפסה חיסונית (שכותרתו 2 והצביע על ידי כוונת ירוקה). קביעת היווצרות הסינפסה דורשת בדיקה ידנית של אלהתמונות, המוצג ב B. השורה העליונה מציגה תמונות brightfield קרינת ערוץ כפיל עם סינפסה חיסונית (מתאימה לאירוע 1 א); בשורה התחתונה מציגה כפיל עם מגע קרום אבל היווצרות הסינפסה חסרה (מתאים לאירוע 2 א). הנתונים נותחו בצורה עיוורת לגבי משימת טיפול והם מניסוי שפורסם בעבר 23. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3045
דוגמאות איור 3. של T-APC סינפסה גיבוש. עכברים CBA קיבל allografts לב מתורמים B6 לאחר או לא טרום טיפול (AB) או לאחר אינדוקציה סובלנות עם דם B6 כולו תחת כיסוי של נוגדנים שאינם מדלדלים אנטי CD4 ( רונג> CD). לאחר 7 ימים, הטחול CD4 + T לתאים נבדקו עבור היווצרות הסינפסה עם DCs B6. א שלוש דוגמאות של כפילויות שאינם סינפטיים עם מגע קרום מבעל חיים שאינו tolerized. B. שלוש דוגמאות של סינפסות החיסונית מבעל חיים שאינו tolerized. ג שלוש דוגמאות של כפילויות שאינם סינפטיים עם מגע קרום מבעל חיים tolerized. ד שלוש דוגמאות של סינפסות החיסונית מבעל חיים tolerized. היווצרות סינפסה מותווה על ידי נוכחות של רכס בהיר, FITC חיובי בממשק T-APC (Ch03). הנתונים נותחו בצורה עיוורת לגבי משימת טיפול והם מניסוי שפורסם בעבר 23. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

ays "> נוגדן / דיי fluorochrome עָרוּץ ריכוז CD11c eF450 Ch02 5 מיקרוגרם / מ"ל, לכיל אמפירית CD90.2 APC Ch06 5 מיקרוגרם / מ"ל, לכיל אמפירית phalloidin FITC Ch03 .05 - 0.5 מיקרוגרם / מ"ל 7-AAD - Ch05 25 מיקרוגרם / מ"ל

טבלה 1. נוגדנים צבעים המשמשים במחקר זה. Fluorochrome מצומדות נוגדנים, צבעים, ספקים, וכן ריכוזים מומלצים מוצגים בטבלה. תזרים הדמיה cytometer ערוץ ששימש לזהות כל fluorochrome גם מוצג בטבלה.

Discussion

זרימת הדמיה cytometry נוצל כדי להדגים היווצרות הסינפסה החיסון בין תאי T מונוקלונלי ונגמ"שים או בנוכחות סופר-אנטיגנים 24, 25, 26, 27, 28. שיטה זו מנצלת את העובדה כי לאחר מגע התא-APC T פרודוקטיבי, תא T מארגן מחדש cytoskeleton יקטין שלה, מקטב זה כלפי האתר של מגע 21. התארגנות זו אינה מתרחשת ללא איתות TCR, וזה אפוא לתאם מוקדם של ההפעלה של T-cell 19, 20, 21. השיטה המוצגת כאן מסתגל גישה זו למדידת alloreactive תדירות T-cell באוכלוסיות polyclonal T-cell. ככזה, הוא עשוי בעתיד לשמש בסיס לפיתוח מבחנים עבור reactivi תורם טאי בהשתלות קליניות.

למרות השוואה ישירה שטרם בוצעה, זיהוי של alloreactive סינפסות החיסונית נראה שיש יכולת ניבוי מעולה מ לקה"ע הקונבנציונלי. לדוגמא, מחקרים קודמים הראו כי, בפרוטוקול tolerizing שתואר לעיל, התוצאות של לקה"ע מצליחות לתאם באופן אמין עם תוצאה שתל 2.

מספר המבחנים פותח עבור המדינה הסובלנית המבצעי בבני אדם 9, 10, 11, אם כי אלה לא מודדים תפקוד תא מפעיל בתגובת alloantigen. לעומת זאת, IFNγ ELISPOT מבחני 8 מידת מפעיל פונקצית T-cell אבל לא יכול ללכוד את מלוא הספקטרום של הפרשת ציטוקינים שעשויות להיות רלוונטי דחייה של שתל אקוטית וכרונית, כגון IL-17 38,> 39. את assay דילול הגבלת 4, אשר הוא עבודה אינטנסיבית, ואת assay טרנס-vivo 6, מחייב עכברים, יש מגבלות מעשיות משמעותיות כי הייתה לעכב את היישום שלהם בסביבה קלינית. השיפורים אחרונים על הניתוח של תאים מתרבים באמצעות ניתוח רצף TCR של תאי T מגיבים ב לקה"ע עשויים להיות בעל ערך, אבל כמו assay המוצג כאן, ידרשו אימות נוספת במחקרים קליניים 18, 40.

פיתוח נוסף של assay זיהוי סינפסה החיסוני ידרוש כי מספר השאלות חשובות ייענה. ראשית, assay כפי שפותחה מודד alloreactivity ישירה בלבד. המסלול הישיר מקריא מתחמי אלוגנאית MHC / פפטיד על נגמ"שים תורם נגזר. זה האחרון מסולק בדרך כלל במהירות לאחר השתלה, והצגת alloantigen נוספת היא carried על ידי נגמ"שים נמען בהצגה (מסלול חצי-ישיר) MHC תורם שלם או אנטיגנים תורם מעובדים על עצמי MHC (מסלול עקיף). המסלול העקיף הוא נהג חשוב של דחייה של שתל כרוני 33, 41.

באופן עקרוני, זה צריך להיות אפשרי לזהות סינפסות חיסונית עקיפה באמצעות assay, אך בעקיפין alloreactive תאי T יש תדר נמוך בהרבה מאשר אלה ישירים 42, 43, כלומר הניתוח של מספר גדול יותר של אירועים יידרש. שיקול שני הוא שאנחנו רק צריכים לבדוק את זה assay באמצעות תאי CD4 + T, ואילו תאי CD8 + T הם גם מרכיב חשוב של התגובה האנטי-תורם. שוב, זה צריך להיות אפשרי לזהות סינפסות CD8 + T תא-APC בשיטה זו. מגבלה נוספת היא כי השיטה מחייבת בבדיקה הידנית וניתוח של תמונות תא memb הסופישער קשר RANE, ואנחנו עובדים כרגע על האוטומציה של צעד זה.

לבסוף, השיטה דורשת בדיקות ופיתוח בבני אדם, מחקרים ראשוניים עם דגימות אנושיות כרגע מתבצעים. פנוטיפי בהמשך לניתוח T-cell משנה (כלומר, מפעיל, זיכרון, שוק הון ועוד) בשילוב עם זיהוי של סינפסות חיסונית במושתלים ייצג גישה חזקה לאפיון רפרטואר תאי T alloreactive ויהיה מוקד חשוב עבודה עתידית.

Disclosures

החוקרים אין לחשוף.

Acknowledgements

SCJ נתמכה על ידי האגודה הבינלאומית ללב וריאות השתלת מחקר אחוות וגם בקולג 'המלכותי של רופאים ומנתחים של קנדה Detweiler נסיעה Fellowship.SM נתמכה בחלקה על ידי האגודה הבינלאומית ללב וריאות השתלת קריירה פיתוח פרס (עד SCJ). SS נתמכה על ידי המכונים הלאומיים Centre.JH מחקר ביו-רפואי לבריאות מחקר אוקספורד הוא מקבל כליה מחקר בבריטניה בכיר Non-קליניים Fellowship. עבודה זו מומנה על ידי מענקים הבאים ל AB ו KW: מענק תוכנית הנאמנות Wellcome (082519Z07Z), מענק תוכנית קרן הלב הבריטית (PG / 10 / 62.28504), ואת תכנית המסגרת של האיחוד האירופי 7 (מחקר אחד; BioDRIM). המחברים מבקשים להודות מייקל פרסונס ואת מתקן Core cytometry הזרימה במכון המחקר לוננפלד-טננבאום, מערכת בריאות הסינית, טורונטו למתן גישה ותמיכה עם מכשיר ImageStream מארק X.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate-buffered salineVariousVaries
Ethylenediamenetetraacetic acid, 0.5 M solutionThermo Fisher ScientificAM9260G
Triton X-100 nonionic detergentSigma-AldrichX100
Beta-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418
FormaldehydeSigma-AldrichF1635Solution is 37% formaldehyde and so must be diluted 25 times for 1.5% solution
Cell strainers, 70 μm pore sizeFisher Scientific08-771-2
Phalloidin-fluorescein isothiocyanateSigma-AldrichP5282
7-aminoactinomycin DThermo Fisher ScientificA1310Reconstitute in DMSO
Allophycocyanin-conjugated anti-mouse CD90.2eBioscience17-0902
Pacific blue-conjugated anti-mouse CD11beBioscience48-0112Pacific blue has been replaced by eFluor 450
Biotinylated anti-mouse CD3eBioscience13-0032
Biotinylated anti-mouse MHC class IIeBioscience13-5321
Biotinylated anti-mouse B220eBioscience13-0452
Biotinylated anti-mouse CD8eBioscience13-0081
Biotinylated anti-mouse CD19eBioscience13-0193
Anti-biotin microbeadsMiltenyi Biotec130-090-485
LS columnsMiltenyi Biotec130-042-401
MidiMACS magnetic cell separatorMIltenyi Biotec130-042-302
recombinant mouse GM-CSFPeprotech315-03
recombinant human TGFβ1Peprotech100-21Human TGFβ1 has activity on mouse cells
Amnis ImageStream X Mark IIAmnis/EMD MilliporeN/AImaging flow cytometer; details available at http://www.emdmillipore.com/
IDEAS SoftwareAmnis/EMD MilliporeN/AFree download (registration required): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20
Cell culture medium VariousVaries
Fetal bovine serumVariousVaries
Cell culture platesVariousVaries

References

  1. Cravedi, P., Heeger, P. S. Immunologic monitoring in transplantation revisited. Curr Opin Organ Transplant. 17 (1), 26-32 (2012).
  2. Pearson, T. C., et al. The assessment of transplantation tolerance induced by anti-CD4 monoclonal antibody in the murine model. Transplantation. 55 (2), 361-367 (1993).
  3. Strober, S., Benike, C., Krishnaswamy, S., Engleman, E. G., Grumet, F. C. Clinical transplantation tolerance twelve years after prospective withdrawal of immunosuppressive drugs: studies of chimerism and anti-donor reactivity. Transplantation. 69 (8), 1549-1554 (2000).
  4. Fussell, S. T., Donnellan, M., Cooley, M. A., Farrell, C. Cytotoxic T lymphocyte precursor frequency does not correlate with either the incidence or severity of graft-versus-host disease after matched unrelated donor bone marrow transplantation. Transplantation. 57 (5), 673-676 (1994).
  5. Roelen, D. L., et al. Relevance of cytotoxic alloreactivity under different immunosuppressive regimens in clinical islet cell transplantation. Clin Exp Immunol. 156 (1), 141-148 (2009).
  6. VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J Clin Invest. 106 (1), 145-155 (2000).
  7. Poggio, E. D., Clemente, M., Hricik, D. E., Heeger, P. S. Panel of reactive T cells as a measurement of primed cellular alloimmunity in kidney transplant candidates. J Am Soc Nephrol. 17 (2), 564-572 (2006).
  8. Zitzner, J. R., Tambur, A. R. Role of ELISPOT Assays in Risk Assessment Pre- and Post-Kidney Transplantation. Cells. 1 (2), 100-110 (2012).
  9. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  10. Brouard, S., et al. Identification of a peripheral blood transcriptional biomarker panel associated with operational renal allograft tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (39), 15448-15453 (2007).
  11. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  12. Halloran, P. F., Famulski, K. S., Reeve, J. Molecular assessment of disease states in kidney transplant biopsy samples. Nat Rev Nephrol. 12 (9), 534-548 (2016).
  13. Li, L., et al. Identification of common blood gene signatures for the diagnosis of renal and cardiac acute allograft rejection. PLoS One. 8 (12), e82153(2013).
  14. Khatri, P., et al. A common rejection module (CRM) for acute rejection across multiple organs identifies novel therapeutics for organ transplantation. J Exp Med. 210 (11), 2205-2221 (2013).
  15. Halloran, P. F., et al. Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: an international prospective study (INTERCOM). Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).
  16. Mastoridis, S., Issa, F., Wood, K. J. Novel biomarkers and functional assays to monitor cell-therapy-induced tolerance in organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 64-71 (2015).
  17. Miqueu, P., et al. Analysis of the peripheral T-cell repertoire in kidney transplant patients. Eur J Immunol. 40 (11), 3280-3290 (2010).
  18. Morris, H., et al. Tracking donor-reactive T cells: Evidence for clonal deletion in tolerant kidney transplant patients. Sci Transl Med. 7 (272), 272ra210(2015).
  19. Dustin, M. L., Bromley, S. K., Kan, Z., Peterson, D. A., Unanue, E. R. Antigen receptor engagement delivers a stop signal to migrating T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (8), 3909-3913 (1997).
  20. Goldsmith, M. A., Weiss, A. Early signal transduction by the antigen receptor without commitment to T cell activation. Science. 240 (4855), 1029-1031 (1988).
  21. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  22. Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).
  23. Juvet, S. C., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. Quantification of CD4(+) T Cell Alloreactivity and Its Control by Regulatory T Cells Using Time-Lapse Microscopy and Immune Synapse Detection. Am J Transplant. 16 (5), 1394-1407 (2016).
  24. Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 347 (1-2), 79-86 (2009).
  25. Burbach, B. J., et al. Distinct regulation of integrin-dependent T cell conjugate formation and NF-kappa B activation by the adapter protein ADAP. J Immunol. 181 (7), 4840-4851 (2008).
  26. Markey, K. A., et al. Cross-dressing by donor dendritic cells after allogeneic bone marrow transplantation contributes to formation of the immunological synapse and maximizes responses to indirectly presented antigen. J Immunol. 192 (11), 5426-5433 (2014).
  27. Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
  28. Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
  29. Ford, W. L., Simmonds, S. J., Atkins, R. C. Early cellular events in a systemic graft-vs.-host reaction. II. Autoradiographic estimates of the frequency of donor lymphocytes which respond to each Ag-B-determined antigenic complex. J Exp Med. 141 (3), 681-696 (1975).
  30. Macedo, C., et al. Contribution of naive and memory T-cell populations to the human alloimmune response. Am J Transplant. 9 (9), 2057-2066 (2009).
  31. Noorchashm, H., et al. A direct method for the calculation of alloreactive CD4+ T cell precursor frequency. Transplantation. 67 (9), 1281-1284 (1999).
  32. Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
  33. Lee, R. S., et al. Indirect recognition of allopeptides promotes the development of cardiac allograft vasculopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (6), 3276-3281 (2001).
  34. Pickl, W. F., et al. Molecular and functional characteristics of dendritic cells generated from highly purified CD14+ peripheral blood monocytes. J Immunol. 157 (9), 3850-3859 (1996).
  35. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  36. Francis, R. S., et al. Induction of transplantation tolerance converts potential effector T cells into graft-protective regulatory T cells. Eur J Immunol. 41 (3), 726-738 (2011).
  37. Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness. Transplantation. 61 (11), 1642-1647 (1996).
  38. Faust, S. M., et al. Role of T cell TGFbeta signaling and IL-17 in allograft acceptance and fibrosis associated with chronic rejection. J Immunol. 183 (11), 7297-7306 (2009).
  39. Yuan, X., et al. A novel role of CD4 Th17 cells in mediating cardiac allograft rejection and vasculopathy. J Exp Med. 205 (13), 3133-3144 (2008).
  40. Emerson, R. O., Mathew, J. M., Konieczna, I. M., Robins, H. S., Leventhal, J. R. Defining the alloreactive T cell repertoire using high-throughput sequencing of mixed lymphocyte reaction culture. PLoS One. 9 (11), e111943(2014).
  41. Stanford, R. E., Ahmed, S., Hodson, M., Banner, N. R., Rose, M. L. A role for indirect allorecognition in lung transplant recipients with obliterative bronchiolitis. Am J Transplant. 3 (6), 736-742 (2003).
  42. Benichou, G., Valujskikh, A., Heeger, P. S. Contributions of direct and indirect T cell alloreactivity during allograft rejection in mice. J Immunol. 162 (1), 352-358 (1999).
  43. Liu, Z., et al. Contribution of direct and indirect recognition pathways to T cell alloreactivity. J Exp Med. 177 (6), 1643-1650 (1993).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

122cytometryT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved